CN109628444B

CN109628444B - 一种鉴定水稻品种的微卫星分子标记和方法及其应用

Info

Publication number: CN109628444B
Application number: CN201910012369.7A
Authority: CN
Inventors: 赵秀彩; 丁智; 张群宇; 袁健铭
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-01-07
Filing date: 2019-01-07
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2039-01-07
Also published as: CN109628444A

Abstract

本发明公开了一种鉴定水稻品种的微卫星分子标记和方法及其应用。所述微卫星分子标记在粳稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还提供了一种用于检测上述微卫星分子标记的引物组，其序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4所示。本发明所提供的微卫星分子标记特异性高，能方便准确的地将水稻栽培品种进行籼稻和粳稻的种质资源区分。本发明提供的微卫星分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，成本低、通量高、特异性高，适用于生产实践。

Description

一种鉴定水稻品种的微卫星分子标记和方法及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体地，涉及一种鉴定水稻品种的微卫星分子标记和方法及其应用。

背景技术

水稻种植品种主要为亚洲栽培稻，又根据一系列表型差异分为籼稻（Oryza sativa subsp Indica）和粳稻（Oryza sativa subsp Japanica），我国根据不同地域种植条件和生产需求，发展培育了上千种籼稻和粳稻品种。要保证高产稳产，水稻品种的种子纯度是最关键的因素之一。传统上鉴定水稻品种纯度，在幼苗期、抽穗期、腊熟期等不同生育期进行。鉴定的性状主要有三个方面，即植株性状、穗部性状与谷粒性状，但在实际生产应用上受鉴定者的经验影响极大。而且随着现代育种发展，部分品种的表型性状与经典的籼稻粳稻差异较大，例如部分粳稻的谷粒不是阔而短，较厚，呈椭圆形或卵圆形而是偏向于谷粒狭长等。因此，在生产实践中，有必要寻找快速精确鉴定籼稻、粳稻差异的方法。针对水稻遗传信息DNA序列在籼稻和粳稻间的遗传差异进行分子标记鉴定是高效准确的方法。

SNP（single nucleotide polymorphism）标记以及根据SNP标记发展出的微卫星分子标记技术是当前研究的热点。微卫星标记（microsatellite），又被称为短串联重复序列（short tandem repeats，STRs）或简单重复序列（simple sequence repeats），是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。微卫星位点通常通过PCR扩增，扩增产物通过电泳分析并根据大小分离等位基因进行检测，具有特异性强、准确性高的优点。因此，有必要寻找一种新的微卫星分子标记用于鉴定不同水稻品种。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服传统水稻籼稻和粳稻品种鉴别技术存在的缺陷和不足，提供一种能快速、准确鉴定水稻是否为籼稻或者粳稻品种的微卫星分子标记，本发明提供的微卫星分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，成本低、通量高、特异性高，适用于生产实践中。

本发明的目的在于提供一种水稻WRKY10基因的特异性微卫星分子标记WRKY10。

本发明的另一目的在于提供上述特异性微卫星分子标记WRKY10在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种用于检测上述特异性微卫星分子标记WRKY10的引物组。

本发明的另一目的在于提供上述引物组在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法。

本发明的另一目的在于提供上述特异性微卫星分子标记WRKY10在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述方法在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种水稻WRKY10基因的特异性微卫星分子标记WRKY10，其在粳稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明克隆了众多水稻品种的WRKY10，通过对克隆的DNA序列进行ClustalW分析发现，粳稻品种和普通野生稻序列克隆的序列全部相同，籼稻品种和Nivara野生稻序列克隆的序列全部相同。而籼稻和粳稻序列相比，在83bp处存在一个CGG的微卫星串联重复次数的位点差异。粳稻在该位点具有6个CGG重复，而籼稻在该位点在该位点仅具有2个CGG重复。因此PCR扩增以上DNA片段，粳稻片段为129bp大小的DNA片段，而籼稻为117bp大小的DNA片段。以上结果表明，可利用特异性微卫星分子标记WRKY10来鉴别水稻品种。

因此，上述特异性微卫星分子标记WRKY10在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用亦在本发明保护范围内。

本发明还提供了一种用于检测上述特异性微卫星分子标记WRKY10的引物组，所述引物组的序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4所示。

上游引物：5’- CGTCGTACGCCTACTCG -3’（SEQ ID NO：3）；

下游引物：5’- CGAGCTCCAGGAATTCAC -3’（SEQ ID NO：4）。

SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物可作为微卫星分子标记引物，用于鉴定水稻品种。因此，所述引物组在鉴定水稻籼稻和粳稻品种中的应用亦在本发明保护范围内。

本发明还提供了一种鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法，包括如下步骤：

S1.提取水稻样本基因组DNA；

S2.以权利要求3所述引物组对步骤S1基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将步骤S2的PCR产物电泳，得到微卫星分子标记；

S4.电泳结果判断：若得到117bp的电泳条带，则该水稻样本为籼稻；若得到129bp的电泳条带，则该水稻品种为粳稻。

优选地，所述PCR反应体系为10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶 5U，基因组DNA 模板0.2μg，10×PCR Buffer 10μL，去离子水补充至100μL。

优选地，所述PCR反应条件为95℃ 预变性2min；95℃ 15sec，52℃ 20sec，72℃30sec，共30个循环；72℃ 延伸5min。

上述特异性微卫星分子标记WRKY10还可以用来检测鉴定水稻亲本纯合度，因此，所述特异性微卫星分子标记WRKY10在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用亦在本发明保护范围内。

同时，上述鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法在水稻籼稻和粳稻亲本纯度检测中的应用亦在本发明保护范围内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所提供的微卫星分子标记特异性高，能方便准确的地将水稻栽培品种进行籼稻和粳稻的种质资源区分。同时，本发明提供的微卫星分子标记在实际应用中，只需PCR结合酶切，成本低、通量高、特异性高，适用于生产实践。

附图说明

图1为微卫星分子标记引物PCR扩增结果电泳图。其中，籼稻品种1～7分别为93-11，矮脚南特，广陆矮4号，珍汕97，明恢63，黄丝占，黄华占；粳稻品种1～7分别为日本晴，台中65，中花11，农垦58，云粳23号，鄂晚3号，晋稻1号。对以上不同品种的PCR扩增产物进行电泳，结果为籼稻和Nivara野生稻片段为117bp的DNA片段，而粳稻品种和普通野生稻片段为129bp的DNA片段。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1鉴别水稻的微卫星分子标记WRKY10及检测引物

本发明人前期研究发现，水稻中存在着一种分子标记WRKY10，其在粳稻中的序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻中的序列如SEQ ID NO：2所示，且在83bp处存在一个CGG的微卫星串联重复次数的位点差异，推测可利用上述分子标记去鉴定水稻籼稻和粳稻品种。分析发现，由于粳稻在该位点具有6个CGG重复，而籼稻在该位点在该位点仅具有2个CGG重复，因此可通过微卫星分子标记方法去检测鉴定水稻籼稻和粳稻品种，通过 PCR扩增以上DNA片段，粳稻片段为129bp大小的DNA片段，而籼稻为117bp大小的DNA片段，由此来鉴定水稻的籼稻和粳稻品种。

同时，通过比对微卫星分子标记WRKY10在粳稻和籼稻中的序列，设计了如下PCR扩增引物组作为微卫星标记引物：

上游引物：5’- CGTCGTACGCCTACTCG -3’（SEQ ID NO：3）；

下游引物：5’- CGAGCTCCAGGAATTCAC -3’（SEQ ID NO：4）。

PCR反应体系为10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶 5U，基因组DNA 模板0.2μg，10×PCR Buffer 10μL，去离子水补充至100μL。

PCR反应条件为95℃ 预变性2min；95℃ 15sec，52℃ 20sec，72℃ 30sec，共30个循环；72℃ 延伸5min。

实施例2 鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法

本发明用于鉴定水稻籼稻和粳稻品种的方法的实验材料包括普通野生稻和Nivara野生稻；籼稻品种分别为93-11，矮脚南特，广陆矮4号，珍汕97，明恢63，黄丝占，黄华占；粳稻品种分别为日本晴，台中65，中花11，农垦58，云粳23号，鄂晚3号，晋稻1号。具体步骤如下：

1、水稻样本基因组DNA提取

（1）取水稻叶片约0.5g，把叶片剪碎，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉末后，放入2mL离心管中，加入800μL 2×CTAB抽提缓冲液，混匀，65℃水浴30min；

（2）加入等体积的氯仿，异戊醇和无水乙醇（76：4：20），振荡10min，充分混匀；

（3）在12000转/分的条件下离心12min，将上清液转移到另一个1.5mL离心管中，加入其0.6倍体积异丙醇或两倍体积无水乙醇，混匀，12000转/分离心2min，去上清，用0.5mL70%的乙醇漂洗两次，风干，溶于100～200μL 0.5×TE缓冲液中；

（4）取1μL用于后续的PCR扩增反应。

2、PCR扩增反应

以实施例1的微卫星标记引物对上述水稻样本基因组DNA进行扩增。

所述PCR反应体系为10mmol/L dNTPs 0.2μL，0.1μmol/L PCR引物各1μL，高保真PCR聚合酶 5U，基因组DNA 模板0.2μg，10×PCR Buffer 10μL，去离子水补充至100μL。

所述PCR反应条件为95℃ 预变性2min；95℃ 15sec，52℃ 20sec，72℃ 30sec，共30个循环；72℃ 延伸5min；随后于4℃保存备用。

3、电泳

对上述水稻样本的PCR扩增产物在8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳1.5h（5V/cm），溴化乙锭（EtBr）染色，用凝胶成像系统观察并拍照记录。

4、结果与分析

对16个不同水稻材料基因组DNA进行PCR扩增，均能扩增出非常清晰的单一条带，分为2组各8个样品条带大小相同，经3次重复，结果稳定一致（如图1所示）。经过正反序列测定，16个PCR产物长度分别为129bp或者117bp；并且，PCR扩增所用的引物全部在两端被正确测出。其中，粳稻品种和普通野生稻序列见序列均如SEQ ID NO：1所示，籼稻和Nivara野生稻序列均如SEQ ID NO：2所示。

因此PCR扩增以上DNA片段，粳稻片段为129bp大小的DNA片段，而籼稻为117bp大小的DNA片段。因此本发明的微卫星分子标记方法可用来鉴定水稻籼稻和粳稻品种。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种鉴定水稻品种的微卫星分子标记和方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 129

<212> DNA

<213> 粳稻(Oryza sativa subsp Japanica)

<400> 1

cgtcgtacgc ctactcgtac ccggcgtcga acacctcctc ctccttgtgc ttccctcctc 60

tcatggcgga ccacatcgtc gacggcggcg gcggcggcgg ctgttccttt ggtgaattcc 120

tggagctcg 129

<210> 2

<211> 117

<212> DNA

<213> 籼稻(Oryza sativa subsp Indica)

<400> 2

cgtcgtacgc ctactcgtac ccggcgtcga acacctcctc ctccttgtgc ttccctcctc 60

tcatggcgga ccacatcgtc gacggcggct gttcctttgg tgaattcctg gagctcg 117

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

cgtcgtacgc ctactcg 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

cgagctccag gaattcac 18

Claims

1.用于检测特异性微卫星分子标记的引物组在鉴定水稻品种中的应用，其特征在于，所述水稻品种为粳稻、普通野生稻、籼稻或Nivara野生稻；所述特异性微卫星分子标记在粳稻或普通野生稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻或Nivara野生稻中的序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物组的序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：4所示。

2.一种鉴定水稻品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取水稻样本基因组DNA；

S2.以权利要求1中所述引物组对步骤S1基因组DNA进行PCR扩增；

S3.将步骤S2的PCR产物电泳，得到微卫星分子标记；

S4.电泳结果判断：若得到117bp的电泳条带，则该水稻样本为籼稻或Nivara野生稻；若得到129bp的电泳条带，则该水稻品种为粳稻或普通野生稻。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述PCR反应体系为10 mmol/L dNTPs 0.2 μL，0.1 μmol/L PCR引物各1 μL，高保真PCR聚合酶5U，基因组DNA模板0.2 μg，10×PCRBuffer 10μL，去离子水补充至100 μL。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述PCR反应条件为95℃预变性2 min；95℃15sec，52℃20sec，72℃30sec，共30个循环；72℃延伸5min。

5.一种特异性微卫星分子标记在水稻亲本纯度检测中的应用，其特征在于，所述特异性微卫星分子标记在粳稻或普通野生稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻或Nivara野生稻中的序列如SEQ ID NO：2所示。

6.权利要求2～4任一项所述方法在水稻亲本纯度检测中的应用，其特征在于，所述特异性微卫星分子标记在粳稻或普通野生稻中的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，在籼稻或Nivara野生稻中的序列如SEQ ID NO：2所示。