CN109234446B

CN109234446B - 黄瓜雌性snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109234446B
Application number: CN201811390571.5A
Authority: CN
Inventors: 李利斌; 曹齐卫; 杨宗辉; 孟昭娟; 王永强; 杨桂兰
Original assignee: Vegetable Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN109234446A

Abstract

本发明提供了黄瓜雌性SNP分子标记及其应用，即位于黄瓜Csa6M496990.1基因组第六号染色体如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列第116位多态性为T/C的SNP1和第222位多态性为G/A的SNP2，通过一对引物对的扩增就可得到这两个变异位点的序列信息，用于黄瓜雌性系的辅助选择以及黄瓜分子标记辅助育种。该方法可替代传统的以表型观察判断的方法，使结果更加准确可靠。其在黄瓜苗期即可在室内进行，比在田间开花坐果期人工观察便捷，可用于大规模筛选育种材料，节约土地和成本，大大加速黄瓜育种进程。

Description

黄瓜雌性SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说涉及黄瓜雌性SNP分子标记及其应用。

背景技术

黄瓜是我国主要栽培蔬菜之一。黄瓜雌性系品种的选育和利用是提高黄瓜产量的根本途径。另外，利用雌性系配制一代杂种，可大大降低制种成本，提高制种的纯度。但是，由于国内雌性种质的匮乏，和利用常规育种手段选育黄瓜雌性系存在周期长、效率低下的问题，影响了黄瓜雌性系育种的进程。而基于基因型选择的现代分子标记辅助育种技术，可以大大提高性状选择的效率，加速育种进程。

目前报道的黄瓜雌性系分子标记大都是基于乙烯合成和信号转导基因开发的，比如2016年申报的专利《黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用》中即为利用乙烯合成酶基因和乙烯信号应答基因如受体基因来判断黄瓜的雌性与否，是一种间接判断的方式。

与以往的分子标记明显不同，本发明是基于黄瓜发育相关基因homeobox/Csa6M496990.1开发的雌性系分子标记。

发明内容

本发明在黄瓜雌性系及其近等基因系重测序的基础上，发现在黄瓜homeobox基因/Csa6M496990.1内部存在雌性相关SNP位点，并通过一对引物的扩增就可得到这些变异位点的序列信息，而且通过验证发现在不同遗传背景雌性材料中分析结果一致。因而，本发明能够用于黄瓜雌性系的辅助选择。

本发明的第一个目的是提供了黄瓜雌性SNP分子标记及其应用，本发明的另一目的是提供用于检测所述的与黄瓜雌性相关的SNP标记的引物及其检测方法。

一种黄瓜雌性SNP分子标记，包含第一分子标记SNP1和第二分子标记SNP2；

所述SNP1为含有位于黄瓜Csa6M496990.1基因组第六号染色体上如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第116位多态性为T/C的分子标记；

所述SNP2含有位于黄瓜Csa6M496990.1基因组第六号染色体上如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第222位多态性为G/A的分子标记。

一种用于检测上述SNP标记的引物对，所述引物对包括：具有SEQ ID NO.1-2所示的核苷酸序列，用于检测所述SNP标记。

进一步的，利用所述引物对获得的雌性系扩增产物序列为SEQ ID NO.3，非雌性系扩增序列为SEQ ID NO.4。

本发明还提供所述黄瓜雌性SNP分子标记或其引物在鉴定黄瓜雌性性状中的应用。

一种鉴定黄瓜雌性性状的方法，包括如下步骤：

1)提取待测黄瓜基因组的DNA；

2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用所述引物对SEQ1和SEQ2进行PCR扩增反应；

3)分析扩增产物的SNP位点，SNP1均为T，SNP2均为G对应黄瓜雌性性状，SNP1均为C，SNP2均为A对应黄瓜非雌性性状。

进一步的，所述步骤2)中的PCR扩增反应体系为：10ng/μl DNA模板1μl，10pmol/μl引物各1μl，10mmol/L dNTPmix 0.5μl，TaqDNA聚合酶1ul，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为超纯水，补齐至25μl；

所述步骤2)中的PCR扩增反应的程序为：95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20循环；最后72℃延伸10min。

本领域技术人员应该知晓，PCR的扩增体系和反应程序以及酶切反应的体系和程序可以根据所用DNA聚合酶、限制性内切酶不同或其它需要调整其中各组分的体积和/或用量以及各反应的温度和时间，因此，本发明所述的PCR扩增体系和反应程序以及酶切反应的体系和程序的选择包括但不限于上述扩增体系和反应程序。

本发明还提供了所述的分子标记和/或其引物在黄瓜雌性分子标记辅助育种中的应用。

有益效果：

本发明通过一次性扩增和检测2个SNP位点即可判断黄瓜雌性与否，可替代传统的以表型观察判断的方法，使结果更加准确可靠。这种方法在黄瓜苗期即可在室内进行，比在田间开花坐果期人工观察便捷，可用于大规模筛选育种材料，节约土地和成本，大大加速黄瓜育种进程。它是一种不同于乙烯合成基因相关的黄瓜雌性分子标记手段。

附图说明

图1开花期非雌性材料图片：雄花较多。

图2开花期雌性材料图片：节节着生雌花。

图3黄瓜雌性和非雌性系基因组DNA电泳检测图：1，AZ-1；2，BB；3，X8-2；4，A10h；5，A86h；6，M16；7，YN；8，A72；9，ZQ3；10，SJ11；11，MC8-3；12，Cuilong；13，BM28；14，DL102。

图4黄瓜雌性和非雌性系PCR产物电泳图：图中所用分子marker为DL2000,共有6个条带，大小依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp；扩增产物对应的条带为750bp。

图5黄瓜雌性和非雌性材料PCR扩征序列比对及SNP标记，为方便显示，只选取部分序列。

具体实施方式

实施例黄瓜雌性分子标记在鉴定黄瓜雌性性状中的应用

检测品种来源：

M16、日本黄瓜类型的雌性源材料,来源于国家种质库；

BB、白黄瓜，华南类型，来源于山东海阳地方品种；

AZ-1、华北型，来源于山东地方品种；

X8-2、华北类型，来源于新泰密刺黄瓜；

MC8-3、X8-2回交转育的雌性系；

A86h、AZ-1回交转育的雌性系；

A10h、BB回交转育的雌性系；

A72、密刺类型的雌性系，来源于山东农科院蔬菜花卉研究所；

SJ11、欧美水果黄瓜类型的雌性系，来源于波兰农科院；

ZQ3、欧美加工型黄瓜雌性系，来源于德瑞特种业有限公司；

YN、华南类型黄瓜雌性系，来源于山东农科院蔬菜花卉研究所；

Cuilong、华南类型黄瓜杂交种，来源于青岛农科院；

DL102、华北类型杂交种，来源于山东农科院；

Bomei28、华北类型杂交种，来源于天津德瑞特种业有限公司；

上述品种均为现有已知品种。

2014、2015两年夏季分别种植纯雌系材料8个(A10h，A86h-1，M16，A72，MC8-3,ZQ3，SJ11，YN)、非雌性材料3个(AZ-1，BB，X8-2)及杂交种3个(Cuilong，Bomei28，Dongling102)，取性型稳定的纯雌性材料和非雌性材料及杂交种的幼嫩叶片进行DNA提取,然后进行PCR扩增和分子标记检测分析。具体步骤如下：

1、DNA提取：使用天根的快捷型植物基因组DNA提取系统(DP321)。

(1)处理材料：取黄瓜幼嫩叶片100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μl缓冲液FP1和6μl的RNase A(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min。

(2)加入130μl缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1min。

(3)12,000rpm(～13,400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中。

(4)可选步骤：将上清液再次12,000rpm(～13,400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中。

(5)向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA。(例如500μl的上清液加350μl异丙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃上清，保留沉淀。

(6)加入600μl70％乙醇，涡旋振荡5sec，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃上清。

(7)重复步骤6。

(8)开盖倒置，室温5-10min，彻底晾干残余的乙醇。

(9)加入适量洗脱缓冲液TE，65℃水浴10-60min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到DNA溶液。

2、DNA纯度和浓度检测

(1)将DNA样品原液稀释10倍后,取4ulDNA样品加入2μl Loading Buffer后混匀，上样于含有1％gelred核酸染料的1％的琼脂糖凝胶，恒定电压135V下电泳40min，使用凝胶成像系统观察结果并拍照存档。

(2)取2μlDNA样品原液，用TE溶液稀释至100μl，使用Ultrospec 3300Pro型紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度。

PCR扩增：

PCR扩增程序：首先进行梯度降落PCR,95℃30s，65℃～56℃(每1cycles降退火温度1℃)45s，72℃1min；95℃30s，56℃45s，72℃1min,20cycles；72℃10min。

3、PCR产物测序及分析

使用ABI公司3730XL测序仪和分析软件Sequencing Analysis 5.2直接对PCR产物进行测序及分析。测序分析结果如图3所示。

品种BB、品种AZ-1、品种X8-2、品种A10h、品种A72、品种A86h、品种M16、品种MC8-3、品种SJ11、品种YN、品种ZQ3、品种Cuilong、品种DL102、品种BM28等品种的核苷酸序列如图5所示。

由上述序列可以看出，纯雌系材料A10h，A86h-1，M16，A72，ZQ3，SJ11，MC8-3，YN的SNP1均为T，SNP2均为G,非雌性材料AZ-1，BB，X8-2及杂交种Cuilong，BM28，DL102的SNP1均为C，SNP2均为A。其在黄瓜第六染色体的位置如表1所示：

表1雌性和非雌性相关SNP标记分布、序列和命名

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省农科院蔬菜花卉所

<120> 黄瓜雌性SNP分子标记及其应用

<130> 2018

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaacagaag caaaagcaag c 21

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcaaataagg agacataata attgga 26

<210> 3

<211> 325

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cactttctta attaatcttg ttctgattta attaacagaa gcaaaagcaa gccttagcta 60

gcgagttaaa tctccggcct cgacaagttg aagtttggtt ccagaatagg agagctaggt 120

aattaaatta attgatctgt tttcagaaaa taaaaattag ggatttggga ttagatcaaa 180

gaaattaaaa cagaggatgt tgaatgaatc tgcaggacaa agcttaagca aacagaggta 240

gattgcgagt ttctaaagag atgctgcgaa acgctaacgg acgaaaacag gaggctacaa 300

aaagagctac aagaactgaa agcct 325

<210> 4

<211> 325

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cactttctta attaatcttg ttctgattta attaacagaa gcaaaagcaa gccttagcta 60

gcgagttaaa tctccggcct cgacaagttg aagtttggtt ccagaatagg agagccaggt 120

aattaaatta attgatctgt tttcagaaaa taaaaattag ggatttggga ttagatcaaa 180

gaaattaaaa cagaggatgt tgaatgaatc tgcaggacaa aacttaagca aacagaggta 240

gattgcgagt ttctaaagag atgctgcgaa acgctaacgg acgaaaacag gaggctacaa 300

aaagagctac aagaactgaa agcct 325

Claims

1.一种黄瓜雌性SNP分子标记，其特征在于，包含SNP1和SNP2，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述SNP1为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第116位，其多态性为T/C；

所述SNP2为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的第222位，其多态性为G/A；

SNP1均为T且SNP2均为G对应黄瓜雌性性状，SNP1均为C且SNP2均为A对应黄瓜非雌性性状。

2.权利要求1所述黄瓜雌性SNP分子标记在鉴定黄瓜雌性性状中的应用。

3.一种鉴定黄瓜雌性性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）提取待测黄瓜基因组的DNA；

2）以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR扩增反应；

3）分析扩增产物的SNP位点，SNP1均为T且SNP2均为G对应黄瓜雌性性状，SNP1均为C且SNP2均为A对应黄瓜非雌性性状。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2）中的PCR扩增反应体系为：10ng/μlDNA模板1μl，10pmol/μl引物各1μl，10mmol/L dNTPmix 0.5μl， TaqDNA聚合酶1μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为超纯水，补齐至25μl；

所述步骤2）中的PCR扩增反应的程序为：95℃变性30s， 56℃退火 45s，72℃延伸1min，20循环；最后72℃延伸10min。

5.权利要求1所述黄瓜雌性SNP分子标记在黄瓜雌性分子标记辅助育种中的应用。