CN105255873A - 黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用，所述SNP标记与InDel标记位于黄瓜ACS1上游序列800～1300bp范围内的9个单核苷酸变异(SNP)位点和4个InDel位点，利用一对引物即可扩增全部SNP和Indel位点所在区域的序列，根据序列分析的结果即可判断黄瓜雌性与否。本发明所述方法可用于黄瓜雌性系标记辅助选择育种，能大大提高雌性系选择的效率和缩短育种时间。

Description

黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用

技术领域

本发明涉及黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

黄瓜是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一。利用雌性系育成的黄瓜杂交种具有早熟、丰产的特点。另外，利用雌性系配制一代杂种，可大大降低制种成本，提高制种的纯度。但是，由于我国缺乏相应的雌性系种质资源，利用常规育种手段把国外雌性源回交转育成国内密刺黄瓜类型和华南型黄瓜类型的雌性系，育种周期长，费工费时。而且，黄瓜性型的表达还受到环境条件的影响，依靠人工进行表型选择还存在不够准确的问题。这些问题的存在，使得黄瓜雌性系的选育进展缓慢，影响了黄瓜雌性系育种的进程。而基于基因型选择的现代分子标记辅助育种技术，可以大大提高性状选择的效率，加速育种进程。

近年来研究发现，乙烯合成基因是黄瓜性别决定的关键基因。黄瓜的乙烯合成酶基因ACS1和ACS2分别是决定黄瓜性别分化的F基因和M基因。另外，研究还发现黄瓜性别表达与乙烯信号应答基因如受体基因ETR1、EIN3等的表达相关。因此，从与黄瓜雌性表达相关的关键基因入手，筛选用于黄瓜性型鉴别的分子标记，辅助黄瓜雌性系育种具有重要意义。

单核苷酸多态性(singlenulceotidepolymorphism,SNP)是继限制性片段长度多态性RFLP、扩增片段长度多态性AFLP和微卫星标记SSR之后的新一代分子标记。它具有分布广、密度高、多态性丰富等特点，而且能直接反应植物基因水平上的差异。InDel(insertion-deletion)插入缺失标记，指的是两种亲本在全基因组中的差异，相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失。本发明是在黄瓜雌性系及其近等基因系重测序的基础上，开发用于黄瓜雌性系选择的SNP/InDel分子标记。前人的研究认为，通过黄瓜基因组中ACS1拷贝数的分析，即可判断雌性与否，但也有研究结果与此相悖。

因此，开发新的黄瓜雌性系分子标记，对于鉴定不同来源的雌性系材料和黄瓜雌性系的辅助选择具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记及其应用。

本发明技术方案如下：

黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记，均位于6号染色体上编码黄瓜乙烯合成酶基因ACS1/Csa6G496450的起始密码子上游800～1300bp区间内；

SNP1位于6号染色体的24216638bp位置，非雌性系材料为A，纯雌性材料为G；

SNP2位于6号染色体的24216699bp位置，非雌性系材料为G，纯雌性材料为T；

SNP3位于6号染色体的24216739bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C；

SNP4位于6号染色体的24216776bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为A；

SNP5位于6号染色体的24216813bp位置，非雌性系材料为C，纯雌性材料为T；

SNP6位于6号染色体的24216843bp位置，非雌性系材料为CA，纯雌性材料为TG；

SNP7位于6号染色体的24216848bp位置，非雌性系材料为G，纯雌性材料为A；

SNP8位于6号染色体的24216875bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C；

SNP9位于6号染色体的24216958bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C；

InDel1位于6号染色体的24216613bp位置，非雌性系材料为TGAGAATGTTGATAGAGGTTTT的缺失，纯雌性材料为TGAGAATGTTGATAGAGGTTT的插入；

InDel2位于6号染色体的24216849bp位置，非雌性系材料为GG的插入，纯雌性材料为GG的缺失；

InDel3位于6号染色体的24216973bp位置，非雌性系材料为T的插入，纯雌性材料为T的缺失；

InDel4位于6号染色体的24217018bp位置，非雌性系材料为TAATGG或者TGATGA的插入，纯雌性材料为TAATGG或者TGATGA的缺失。

检测上述SNP标记与InDel标记的检测引物，检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

上述SNP标记与InDel标记在黄瓜雌性系品种鉴定中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)提取待测黄瓜基因组的DNA；

(2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用SNP标记与InDel标记的检测引物进行PCR扩增反应；

(3)检测扩增产物，根据SNP标记或InDel标记判断待鉴定品种为纯雌性材料或非雌性系材料。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增反应的反应体系为25lμl，具体如下：

10ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl上游引物1μl，10pmol/μl下游引物1μl，10mmol/ldNTPmix0.5μl，TaqDNA聚合酶1U，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为超纯水。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增反应的扩增程序为：

先进行梯度降落PCR，95℃变性30s，退火温度从65℃降到56℃，每循环降退火温度1℃，45s，72℃延伸1min；

然后95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20个循环；最后72℃延伸10min。

上述与黄瓜雌性相关的SNP标记与InDel标记在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。

有益效果

1、本发明首次发现位于编码黄瓜乙烯合成酶基因ACS1/Csa6G496450的起始密码子上游800～1300b区间处存在9个与黄瓜雌性相关的SNP标记(SNP1～SNP9)和4个InDel标记(InDel1～InDel4)，通过任一SNP标记或InDel标记均可以鉴别出黄瓜雌性与否。

2、本发明所述鉴定方法可替代传统的以表型观察判断的方法，可以在黄瓜苗期和室内进行，比在田间开花坐果期人工观察便捷，可用于大规模筛选育种材料，节约土地和成本，大大加速黄瓜育种进程，使结果更加准确可靠。

3、本发明通过基因组重测序分析，在黄瓜ACS1基因的上游序列中发现多个雌性相关SNP和InDel位点，并通过一对引物的扩增就可得到这些变异位点的序列信息，而且通过验证发现在不同雌性源材料中分析结果一致。因而，本发明能够很好的鉴定不同来源的雌性系材料，能够用于不同来源的雌性系材料的辅助选择。

附图说明

图1黄瓜雌性和非雌性系基因组DNA电泳检测图；

图中：1，AZ-1；2，BB；3，X8-2；4，A10h；5，A86h；6，M16；7，YN；8，A72；9，ZQ3；10，SJ11；11，MC8-3；12，Cuilong；13，BM28；14，DL102。

图2黄瓜雌性和非雌性系PCR产物电泳图：

图中：所用分子marker为DL2000,共有6个条带，大小依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp，扩增产物对应的条带为750bp。

图3实施例1中黄瓜雌性和非雌性材料PCR扩增序列比对及SNP标记、InDel标记。

图中：M16、日本黄瓜类型的雌性源材料；BB、白黄瓜，华南类型非雌性系；AZ-1、华北型非雌性系；X8-2为华北型的新泰密刺,非雌性系；MC8-3、X8-2回交转育的雌性系；A86h、AZ-1回交转育的雌性系；A10h、BB回交转育的雌性系；A72、密刺类型的雌性系；SJ11、欧美水果黄瓜类型的雌性系；ZQ3、欧美加工型黄瓜雌性系；YN、华南类型黄瓜雌性系；Cuilong、华南类型黄瓜杂交种，为青岛农科院品种；DL102、华北类型杂交种，山东农科院品种；BM28、华北类型杂交种，天津德瑞特种业有限公司。

图4实施例2中黄瓜雌性和非雌性材料PCR扩增序列比对及SNP标记、InDel标记。

图中：Zhongnong26为华北类型杂交种；Qingyan2，华南型杂交种；Jinchun2，密刺类型杂交种；Jinyou35，密刺类型杂交种。

图5实施例1所述为X8-2开花期照片，为田间观察结果；

照片显示雄花多于雌花，证明样品为非雌性材料；

图6实施例1所述为雌性源M16开花期照片，为田间观察结果；

照片显示该植株节节着生雌花，证明样品为纯雌性材料。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

检测品种来源：

M16、日本黄瓜类型的雌性源材料,来源于国家种质库；

BB、白黄瓜，华南类型，来源于山东海阳地方品种；

AZ-1、华北型，来源于山东地方品种；

X8-2、华北类型，来源于新泰密刺黄瓜；

MC8-3、X8-2回交转育的雌性系；

A86h、AZ-1回交转育的雌性系；

A10h、BB回交转育的雌性系；

A72、密刺类型的雌性系，来源于山东农科院蔬菜花卉研究所；

SJ11、欧美水果黄瓜类型的雌性系，来源于波兰农科院；

ZQ3、欧美加工型黄瓜雌性系，来源于德瑞特种业有限公司；

YN、华南类型黄瓜雌性系，来源于山东农科院蔬菜花卉研究所；

Cuilong、华南类型黄瓜杂交种，来源于青岛农科院；

DL102、华北类型杂交种，来源于山东农科院；

BM28、华北类型杂交种，来源于天津德瑞特种业有限公司；

Zhongnong26、华北类型杂交种，来源于中国农科院；

Qingyan2、华南型杂交种，来源于青岛农科院；

Jinchun2、天津黄瓜研究所密刺类型杂交种；

Jinyou35、天津黄瓜研究所密刺类型杂交种。

上述品种均为现有已知品种。

实施例1

2014、2015两年夏季分别种植纯雌系材料8个(A10h，A86h-1，M16，A72，ZQ3，SJ11，MC8-3，YN)、非雌性材料3个(AZ-1，BB，X8-2)及杂交种3个(Cuilong，BM28，DL102)，取性型稳定的纯雌性材料和非雌性材料及杂交种的幼嫩叶片进行DNA提取，然后进行PCR扩增和分子标记检测分析。具体步骤如下：

DNA提取：使用天根生化科技(北京)有限公司生产的快捷型植物基因组DNA提取系统(DP321)。

1.处理材料：

取黄瓜幼嫩叶片100mg，加入液氮充分碾磨。加入400μl缓冲液FP1和6μl的RNaseA(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min。

2.加入130μl缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1min。

3.12,000rpm(13,400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中。

4.可选步骤：将上清液再次12,000rpm(13,400×g)离心5min，将上清转移至新的离心管中。

5.向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀，此时会出现絮状基因组DNA。(例如500μl的上清液加350μl异丙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心2min，弃上清，保留沉淀。

6.加入600μl70％乙醇，涡旋振荡5sec，12,000rpm(13,400×g)离心2min，弃上清。

7.重复步骤6。

8.开盖倒置，室温5-10min，彻底晾干残余的乙醇。

9.加入适量洗脱缓冲液TE，65℃水浴10～60min溶解DNA，其间颠倒混匀数次助溶，最终得到黄瓜样品DNA溶液。

DNA纯度和浓度检测

(1)将黄瓜样品DNA溶液稀释10倍后,取4μlDNA样品加入2μlLoadingBuffer后混匀，上样于含有质量百分比浓度1％的gelred核酸染料的1％的琼脂糖凝胶，恒定电压135V下电泳40min，使用凝胶成像系统观察结果并拍照存档，结果如图3所示。

(2)取2μlDNA样品原液，用TE溶液稀释至100μl，使用Ultrospec3300Pro型紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度。

PCR扩增

取上述制得的黄瓜样品DNA溶液，进行PCR扩增，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，PCR扩增反应的反应体系为25lμl，具体如下：

10ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl上游引物1μl，10pmol/μl下游引物1μl，10mmol/ldNTPmix0.5μl，TaqDNA聚合酶1U，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为超纯水。

PCR扩增程序：先进行梯度降落PCR，95℃变性30s，退火温度从65℃降到56℃，每循环降退火温度1℃45s，72℃延伸1min；

然后95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增后的额产物上样于含有质量百分比浓度1％的gelred核酸染料的1％的琼脂糖凝胶，恒定电压135V下电泳40min，使用凝胶成像系统观察结果并拍照存档，结果如图4所示。

PCR产物测序及分析

使用ABI公司3730XL测序仪和分析软件SequencingAnalysis5.2直接对PCR扩增后的产物进行测序及分析，测序分析结果如图3所示。

品种BB核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；品种AZ-1核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；品种X8-2SEQIDNO.5所示；品种A10hSEQIDNO.6所示；品种A72SEQIDNO.7所示；品种A86hSEQIDNO.8所示；品种M16SEQIDNO.9所示；品种MC8-3SEQIDNO.10所示；品种SJ11SEQIDNO.11所示；品种YNSEQIDNO.12所示；品种ZQ3SEQIDNO.13所示；品种CuilongSEQIDNO.14所示；品种DL102SEQIDNO.15所示；品种BM28SEQIDNO.16所示。

由上述序列可以看出，纯雌系材料A10h，A86h-1，M16，A72，ZQ3，SJ11，MC8-3，YN的SNP1均为G，SNP2均为T，SNP3均为C，SNP4均为A；SNP5均为T；SNP6均为TG；SNP7均为A；SNP8均为C；SNP9均为C；InDel1均有TGAGAATGTTGATAGAGGTTT的插入，InDel2均有GG的缺失；InDel3均有T的缺失；InDel4均有TAATGG或者TGATGA的缺失。

非雌性材料AZ-1，BB，X8-2及杂交种Cuilong，BM28，DL102的SNP1均为A，SNP2均为G，SNP3均为T，SNP4均为T；SNP5均为C；SNP6均为CA；SNP7均为G；SNP8均为T；SNP9均为T；InDel1均有TGAGAATGTTGATAGAGGTTT的缺失，InDel2均有GG的插入；InDel3均有T的插入；InDel4均有TAATGG或者TGATGA的插入，其在黄瓜第六染色体的位置如表1所示：

表1雌性相关SNP和Indel位点分布、序列和命名

实施例2

为进一步验证上述方法的有效性，对Zhongnong26、Qingyan2、Jinchun2和Jinyou35四个杂交品种采用上述方法进行检测。

黄瓜雌性系品种鉴定的方法，步骤如下：

(1)提取待测黄瓜基因组的DNA；

(2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用SNP标记与InDel标记的检测引物进行PCR扩增反应；

PCR扩增反应的反应体系为25lμl，具体如下：

10ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl上游引物1μl，10pmol/μl下游引物1μl，10mmol/ldNTPmix0.5μl，TaqDNA聚合酶1U，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为超纯水。

PCR扩增反应的扩增程序为：

先进行梯度降落PCR，95℃变性30s，退火温度从65℃降到56℃，每循环降退火温度1℃，45s，72℃延伸1min；

然后95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20个循环；最后72℃延伸10min。

(3)检测扩增产物，根据SNP标记或InDel标记判断待鉴定品种为纯雌性材料或非雌性系材料。

PCR产物测序及分析

使用ABI公司3730XL测序仪和分析软件SequencingAnalysis5.2直接对PCR扩增后的产物进行测序及分析，测序分析结果如图4所示。品种Qingyan2的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，Zhongnong26如SEQIDNO.18所示，Jinchun2如SEQIDNO.19所示，Jinyou35如SEQIDNO.20所示。结果与图3所示结果一致，说明此方法具有可靠性和广泛的适用性。

Claims (7)

1.黄瓜雌性性状相关的SNP标记与InDel标记，均位于6号染色体上编码黄瓜乙烯合成酶基因ACS1/Csa6G496450的起始密码子上游800～1300bp区间内；

SNP1位于6号染色体的24216638bp位置，非雌性系材料为A，纯雌性材料为G；

SNP2位于6号染色体的24216699bp位置，非雌性系材料为G，纯雌性材料为T；

SNP3位于6号染色体的24216739bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C；

SNP4位于6号染色体的24216776bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为A；

SNP5位于6号染色体的24216813bp位置，非雌性系材料为C，纯雌性材料为T；

SNP6位于6号染色体的24216843bp位置，非雌性系材料为CA，纯雌性材料为TG；

SNP7位于6号染色体的24216848bp位置，非雌性系材料为G，纯雌性材料为A；

SNP8位于6号染色体的24216875bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C；

SNP9位于6号染色体的24216958bp位置，非雌性系材料为T，纯雌性材料为C；

InDel1位于6号染色体的24216613bp位置，非雌性系材料为TGAGAATGTTGATAGAGGTTTT的缺失，纯雌性材料为TGAGAATGTTGATAGAGGTTT的插入；

InDel2位于6号染色体的24216849bp位置，非雌性系材料为GG的插入，纯雌性材料为GG的缺失；

InDel3位于6号染色体的24216973bp位置，非雌性系材料为T的插入，纯雌性材料为T的缺失；

InDel4位于6号染色体的24217018bp位置，非雌性系材料为TAATGG或者TGATGA的插入，纯雌性材料为TAATGG或者TGATGA的缺失。

2.检测权利要求1所述SNP标记与InDel标记的检测引物，检测引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.权利要求1所述SNP标记与InDel标记在黄瓜雌性系品种鉴定中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)提取待测黄瓜基因组的DNA；

(2)以待测黄瓜的基因组DNA为模板，利用SNP标记与InDel标记的检测引物进行PCR扩增反应；

(3)检测扩增产物，根据SNP标记或InDel标记判断待鉴定品种为纯雌性材料或非雌性系材料。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增反应的反应体系为25lμl，具体如下：

10ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl上游引物1μl，10pmol/μl下游引物1μl，10mmol/ldNTPmix0.5μl，TaqDNA聚合酶1U，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为超纯水。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增反应的扩增程序为：

先进行梯度降落PCR，95℃变性30s，退火温度从65℃降到56℃，每循环降退火温度1℃，45s，72℃延伸1min；

然后95℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，20个循环；最后72℃延伸10min。

7.权利要求1所述与黄瓜雌性相关的SNP标记与InDel标记在黄瓜分子标记辅助育种中的应用。