CN112094940A - 与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒与应用 - Google Patents

与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒与应用 Download PDF

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Abstract

本发明“与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒与应用”，属于生物技术辅助育种领域。所述与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记相比野生型黄瓜正常长度下胚轴基因Lh1对应连锁片段的第31‑34位点存在碱基缺失突变。所述与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。采用本发明获得的Indel标记，可以在黄瓜候选材料的任何阶段判断植株是否具有长下胚轴这一性状，该标记具有高效、限制少、准确率高的优点。

Description

与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒 与应用
技术领域
本发明属于生物技术辅助育种领域，特别涉及一种与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒与应用。
背景技术
黄瓜作为一种重要的蔬菜作物，在全球范围内广泛栽培。目前黄瓜种植中大量采用工厂化穴盘育苗，单位面积幼苗数量越多即密度越大收益越高，带来的问题是容易造成幼苗下胚轴徒长。另外，育苗过程中如果遭遇高温、高湿、弱光等不良环境，也会导致幼苗下胚轴徒长，影响后期丰产，因此研究黄瓜长下胚轴的遗传规律及分子标记，对于选育符合市场需求的新品种具有重要意义。
目前，Bo等从半野生西双版纳黄瓜中克隆了短下胚轴的基因SHORT HYPOCOTYL1(sh1)，该基因编码SMARCA3染色质重塑因子，它通过与CsHY5进行互作间接调控细胞伸长相关基因的表达，最终影响黄瓜下胚轴的伸长；苗晗等通过下胚轴长度QTL定位共检测到5个与下胚轴长度相关QTL，其中在Chr.5上检测到3个QTL，总贡献率高达61％，在Chr.6上重复检出两个相邻位点Hl6.1和Hl6.2；蔡和序等以95份黄瓜核心种质为试验材料，通过GWAS分析检测到8个与黄瓜下胚轴长度密切关联的SNP位点。然而，到目前为止，与黄瓜长下胚轴紧密连锁的Indel标记尚未见报道。
发明内容
基于上述领域的空白，本发明利用黄瓜长下胚轴突变体AM149L，旨在开发与长下胚轴紧密连锁的Indel标记，用于育种研究。本发明提供了与黄瓜长下胚轴基因lh1紧密连锁的Indel标记，并提供了其在选择黄瓜长下胚轴种质资源上的应用。
发明的技术方案如下：
与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记，其特征在于，其相比野生型黄瓜正常长度下胚轴基因Lh1对应连锁片段的第31-34位点存在碱基缺失突变。
具体地，所述缺失突变的碱基为ACTC。
所述的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；
优选地，所述野生型黄瓜正常下胚轴基因Lh1对应连锁片段的核苷酸序列如SeqID No.1所示。
用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物，其特征在于，可扩增所述的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记。
所述的用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物包含下述上下游引物对：
LH1-INDEL2-F:AGAGTCCTTTGAGTGGTATACG
LH1-INDEL2-R:AGAACAACTCACCCATCATCAA。
用于鉴定携带有黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于，包括可扩增所述的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记的引物，和/或，所述的用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物。
所述引物包含下述上下游引物对：
LH1-INDEL2-F:AGAGTCCTTTGAGTGGTATACG
LH1-INDEL2-R:AGAACAACTCACCCATCATCAA。
所述的用于鉴别携带黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒还包括：PCR试剂，和/或，电泳试剂；
优选地，所述PCR试剂包括：dNTP，Taq酶，缓冲液，双蒸水；
优选地，所述电泳试剂包括：电泳缓冲液、Tris-HCl、SDS、丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED、双蒸水、银染试剂。
一种鉴定携带有黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的方法，其特征在于，采用所述的用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物，和/或，所述的用于鉴别携带黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒，对待测黄瓜材料进行检测。
所述检测包括PCR；
所述PCR体系包括：0.75ng/μl DNA模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μL/μl2*3GTaq Master Mix for PAGE(Red Dye)；
优选地，所述PCR体系为：7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL 2*3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)，加双蒸水至10μl；
所述DNA模板为待测黄瓜材料的DNA；
优选地，所述PCR程序为：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟；
优选地，所述检测还包括：对PCR产物进行电泳和/或测序；
所述电泳指，将PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；
优选地，电泳条件为150V恒功率电泳分离1h10min，电泳后银染显色；
优选地，如果电泳结果为166bp和/或测序结果如Seq ID No.1所示，则所测的黄瓜材料的基因型为正常长度下胚轴基因Lh1，表现型为正常长度下胚轴，
如果电泳结果为162bp和/或测序结果如Seq ID No.2所示，则所测的黄瓜材料的基因型为长下胚轴基因lh1，表现型为长下胚轴。
本发明提供的所述Indel标记扩增的172份不同类型黄瓜种质资源的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，该片段第31、32、33和34个碱基为ACTC，所述Indel标记扩增的黄瓜材料AM149L中，其特征条带核苷酸序列如Seq ID No.2所示，该片段在第31个碱基处存在ACTC四个碱基的缺失，表现为长下胚轴。
本发明另一方面还提供所述Indel标记在筛选具有黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下：
(1)提取待测样品基因组DNA；
(2)以所述待测样品基因组DNA为模板，以权利要求1所述的引物进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增片段进行测序或进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；
如果测序结果如Seq ID No.1所示，黄瓜材料表现为正常长度下胚轴，如果测序结果如Seq ID No.2所示，黄瓜材料表现为长下胚轴；
如果电泳后片段为166bp，黄瓜材料表现为正常长度下胚轴；如果电泳后片段为162bp，黄瓜材料表现为长下胚轴。
(4)根据权利要求2所述的应用，所述PCR反应体系为:7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL 2*3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)，加双蒸水至10ul。
(5)PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
(6)一种用于筛选具有长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于，包括粉状或溶液状态的核苷酸序列如下的引物：
LH1-INDEL2-F：AGAGTCCTTTGAGTGGTATACG
LH1-INDEL2-R：AGAACAACTCACCCATCATCAA
与黄瓜长下胚轴基因lh1紧密连锁的Indel标记，其特征在于：
其核苷酸序列如下：
LH1-INDEL2-F：AGAGTCCTTTGAGTGGTATACG
LH1-INDEL2-R：AGAACAACTCACCCATCATCAA
所述Indel标记扩增的172份不同类型黄瓜种质资源的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，该片段第31、32、33和34个碱基为ACTC，所述Indel标记扩增的黄瓜材料AM149L特征条带核苷酸序列如Seq ID No.2所示，第31个碱基处存在ACTC四个碱基的缺失，表现为长下胚轴。
上述Indel标记在筛选黄瓜长下胚轴黄瓜种质资源中的应用，其步骤如下：
(1)提取待测样品基因组DNA；
(2)以所述待测样品基因组DNA为模板，以权利要求1所述的引物进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增片段进行测序；
如果测序结果如Seq ID No.1所示，黄瓜表现为正常下胚轴，如果测序结果如SeqID No.2所示，黄瓜表现为长下胚轴；
所述PCR反应体系为：7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL 2*3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)，加双蒸水至10ul。
所述PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
所述凝胶电泳检测：指采用6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶，于150V恒功率电泳分离1h10min，最后银染显色，进行条带统计。
本试验利用黄瓜AM149L材料开发的Indel标记，通过利用172份不同类型的黄瓜种质资源进行验证，结果发现LH1-INDEL2标记用于分子标记辅助选择的正确率为100％。
本试验不仅为黄瓜长下胚轴基因lh1的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育黄瓜长下胚轴新品种提供了高效的途径。本发明基于开发的Indel标记提供用于辅助筛选具有长下胚轴基因lh1的黄瓜新品种的方法。该方法中，采用所述LH1-INDEL2特异性引物扩增待测材料的DNA，然后对扩增产物进行测序及电泳。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行黄瓜长下胚轴的筛选，具有高效、限制少、准确的优点。
附图说明
图1是本发明实验例使用的待测黄瓜材料AM149L和172份不同类型的黄瓜种质资源的下胚轴表型。
图2是采用本发明的一个实施例提供的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记-LH1-INDEL2标记检测黄瓜AM149L和172份不同类型的黄瓜种质资源的扩增条带。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
生物材料的来源
本研究所用的试验材料为申请人实验室保存的黄瓜资源AM149L(长下胚轴突变体)和172份不同类型的黄瓜种质资源，申请人声明自本发明申请日起20年内可向公众发放用于本发明技术效果的验证。
主要试剂
PCR实验使用Vazyme公司的2*3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)；凝胶电泳使用北京酷来搏科技有限公司的40％非变性聚丙烯酰胺，将其稀释至6％后使用。测序在北京生工公司进行。
第1组实施例、本发明的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记
本组实施例提供一种与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记相比野生型黄瓜正常长度下胚轴基因Lh1对应连锁片段的第31-34位点存在碱基缺失突变。
在具体的实施例中，所述缺失突变的碱基为ACTC。
在一些实施例中，所述与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记的核苷酸序列如Seq ID No.2所示；
优选地，所述野生型黄瓜正常下胚轴基因Lh1对应连锁片段的核苷酸序列如SeqID No.1所示。
本文中，LH1-INDEL2标记也是指所述与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记。第2组实施例、本发明的用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物
本组实施例提供一种用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述引物可扩增第1组实施例任一所述的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记。
在具体的实施例中，所述的用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物包含下述上下游引物对：
LH1-INDEL2-F:AGAGTCCTTTGAGTGGTATACG
LH1-INDEL2-R:AGAACAACTCACCCATCATCAA。
第3组实施例、本发明的用于鉴定携带有黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒
本组实施例提供一种用于鉴定携带有黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒。本组所有实施例的共同特征在于，所述试剂盒包括可扩增第1组实施例任一所述的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记的引物，和/或，第2组实施例任一项所述的用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物。
在具体的实施例中，所述引物包含下述上下游引物对：
LH1-INDEL2-F:AGAGTCCTTTGAGTGGTATACG
LH1-INDEL2-R:AGAACAACTCACCCATCATCAA。
在进一步的实施例中，所述的用于鉴别携带黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒还包括：PCR试剂，和/或，电泳试剂；
优选地，所述PCR试剂包括：dNTP，Taq酶，缓冲液，双蒸水；
优选地，所述电泳试剂包括：电泳缓冲液TBS、Tris-HCl、SDS、丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED、双蒸水、银染试剂。
上述试剂均为分子生物学领域的技术人员常用的实验室试剂，本领域技术人员可商购获得，也可根据实际需要进行常规选择、调整和配制。
第4组实施例、本发明鉴定携带有黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的方法
本组实施例提供一种鉴定携带有黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的方法。本组所有实施例的共同特征在于，采用第2组实施例任一项所述的用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物，和/或，第3组实施例任一所述的用于鉴别携带黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒，对待测黄瓜材料进行检测。
在具体的实施例中，所述检测包括PCR；
所述PCR体系包括：0.75ng/μl DNA模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μL/μl2*3GTaq Master Mix for PAGE(Red Dye)；
优选地，所述PCR体系为：7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL 2*3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)，加双蒸水至10μl；
所述DNA模板为待测黄瓜材料的DNA；
优选地，所述PCR程序为：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟；
在进一步的实施例中，所述检测还包括：对PCR产物进行电泳和/或测序；
所述电泳指，将PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；
优选地，电泳条件为150V恒功率电泳分离1h10min，电泳后银染显色；
优选地，如果电泳结果为166bp和/或测序结果如Seq ID No.1所示，则所测的黄瓜材料的基因型为正常长度下胚轴基因Lh1，表现型为正常长度下胚轴，
如果电泳结果为162bp和/或测序结果如Seq ID No.2所示，则所测的黄瓜材料的基因型为长下胚轴基因lh1，表现型为长下胚轴。
实验例1.黄瓜AM149L长下胚轴基因lh1紧密连锁的Indel标记的获得
结合黄瓜基因组序列的数据和AM149L重测序数据，利用生物信息学结合遗传群体的表型鉴定，分析定位该区域内的片段差异，在黄瓜AM149L材料中，发现了4个碱基的缺失。
基于获得的与黄瓜AM149L长下胚轴基因lh1紧密连锁的Indel标记，开发与黄瓜AM149L长下胚轴基因lh1紧密连锁的Indel标记(命名为LH1-INDEL2)。其中正向和反向引物分别为：
LH1-INDEL2-F：AGAGTCCTTTGAGTGGTATACG
LH1-INDEL2-R：AGAACAACTCACCCATCATCAA
由于插入Indel的关系，通过上述引物(LH1-INDEL2-F/LH1-INDEL2-R)对黄瓜材料AM149L和172份不同类型黄瓜种质资源进行PCR扩增，获得特异性条带，其中在材料AM149L(长下胚轴)中，获得一个162bp的条带，在其他黄瓜种质资源(正常长度下胚轴)中，获得一个166bp的条带。
具体操作方法：
步骤1.DNA提取和PCR扩增
取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取AM149L和172份不同类型黄瓜种质资源的基因组DNA。
Indel标记PCR反应体系为：反应体系10μL，3μL DNA(5.0ng·μL-1)，正向和反向引物(50ng·μL-1)各1μL，5μL2*3G Taq Master Mix for PAGE(Red Dye)(Vazyme公司产品)。
PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，10℃保存。
步骤2.结果判定
PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h10min，电泳后银染显色，统计带型。
在材料AM149L(长下胚轴)中，获得一个162bp的条带，条带带型记为a，在172份不同类型黄瓜种质资源(正常下胚轴长度)中，获得一个166bp的条带，条带带型记为b。
实验例2.黄瓜AM149L长下胚轴基因lh1侧翼标记的验证
利用本课题保存的172份不同类型黄瓜种质资源材料，对实施例1获得的与基因lh1连锁的LH1-INDEL2标记进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性：经和所选材料的下胚轴表现型相比(图1)，发现该标记在172份不同类型黄瓜种质资源带型反映的表型数据与下胚轴表型调查结果一致(图2)，经计算正确率为100％。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 与黄瓜长下胚轴基因Lh1连锁的Indel标记及其引物、试剂盒与应用
<130> P200813/SCH
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 166
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 与黄瓜正常下胚轴基因lh1连锁片段
<400> 1
agagtccttt gagtggtata cgctttacta actcactttt ggaggctaca gatttgagtg 60
aagatcaaaa gcagttcctt gagaccagtg ttgcttgtga aaaacaaatg ctaaagatta 120
ttgaggatat ggacttggaa tgtattgatg atgggtgagt tgttct 166
<210> 2
<211> 162
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 与黄瓜长下胚轴基因Lh1连锁的Indel标记
<400> 2
agagtccttt gagtggtata cgctttacta acttttggag gctacagatt tgagtgaaga 60
tcaaaagcag ttccttgaga ccagtgttgc ttgtgaaaaa caaatgctaa agattattga 120
ggatatggac ttggaatgta ttgatgatgg gtgagttgtt ct 162
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LH1-INDEL2-F
<400> 3
agagtccttt gagtggtata cg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LH1-INDEL2-R
<400> 4
agaacaactc acccatcatc aa 22

Claims (10)

1.与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记，其特征在于，其相比野生型黄瓜正常长度下胚轴基因Lh1对应连锁片段的第31-34位点存在碱基缺失突变。
2.根据权利要求1所述的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记，其特征在于，所述缺失突变的碱基为ACTC。
3.根据权利要求1或2所述的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示；
优选地，所述野生型黄瓜正常下胚轴基因Lh1对应连锁片段的核苷酸序列如Seq IDNo.1所示。
4.用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物，其特征在于，可扩增权利要求1-3任一所述的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记。
5.根据权利要求4所述的用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物，其特征在于，包含下述上下游引物对：
LH1-INDEL2-F:AGAGTCCTTTGAGTGGTATACG
LH1-INDEL2-R:AGAACAACTCACCCATCATCAA。
6.用于鉴定携带有黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于，包括可扩增权利要求1-3任一所述的与黄瓜长下胚轴基因lh1连锁的Indel标记的引物，和/或，权利要求4或5所述的用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物。
7.根据权利要求4所述的用于鉴别携带黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于，所述引物包含下述上下游引物对：
LH1-INDEL2-F:AGAGTCCTTTGAGTGGTATACG
LH1-INDEL2-R:AGAACAACTCACCCATCATCAA。
8.根据权利要求4或5所述的用于鉴别携带黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于，还包括：PCR试剂，和/或，电泳试剂；
优选地，所述PCR试剂包括：dNTP，Taq酶，缓冲液，双蒸水；
优选地，所述电泳试剂包括：电泳缓冲液、Tris-HCl、SDS、丙烯酰胺、过硫酸胺、TEMED、双蒸水、银染试剂。
9.一种鉴定携带有黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的方法，其特征在于，采用权利要求4或5所述的用于筛选黄瓜长下胚轴基因lh1的引物，和/或，权利要求6-8任一所述的用于鉴别携带黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的试剂盒，对待测黄瓜材料进行检测。
10.根据权利要求9所述的一种鉴定携带有黄瓜长下胚轴基因lh1的黄瓜种质资源的方法，其特征在于，所述检测包括PCR；
所述PCR体系包括：0.75ng/μl DNA模板，正向和反向引物各5ng/μl，0.5μL/μl2*3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)；
优选地，所述PCR体系为：7.5ng DNA模板，正向和反向引物各50ng，5μL 2*3G TaqMaster Mix for PAGE(Red Dye)，加双蒸水至10μl；
所述DNA模板为待测黄瓜材料的DNA；
优选地，所述PCR程序为：95℃预变性3分钟；以95℃变性15秒，57℃退火15秒，72℃延伸30秒为1个循环，共35个循环；72℃保温5分钟；
优选地，所述检测还包括：对PCR产物进行电泳和/或测序；
所述电泳指，将PCR产物用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离；
优选地，电泳条件为150V恒功率电泳分离1h10min，电泳后银染显色；
优选地，如果电泳结果为166bp和/或测序结果如Seq ID No.1所示，则所测的黄瓜材料的基因型为正常长度下胚轴基因Lh1，表现型为正常长度下胚轴，
如果电泳结果为162bp和/或测序结果如Seq ID No.2所示，则所测的黄瓜材料的基因型为长下胚轴基因lh1，表现型为长下胚轴。
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