CN110724759A

CN110724759A - 与黄瓜叶酸含量相关的indel分子标记及其应用

Info

Publication number: CN110724759A
Application number: CN201911213633.XA
Authority: CN
Inventors: 张圣平; 顾兴芳; 苗晗; 周琪; 薄凯亮
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2020-01-24

Abstract

本发明提供了与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记及其应用，属于分子标记技术领域。与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记的上游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明基于所述INDEL标记引物提供一种用于辅助筛选具有特定高叶酸含量的黄瓜品种的方法，采用所述INDEL标记的特异性引物扩增待测材料的基因组DNA，对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现两种情况：与高叶酸含量的材料相比低叶酸材料在35bp处有四个碱基的插入。通过本发明提供的方法，在黄瓜候选材料任何阶段进行叶酸含量的鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。

Description

与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记及其应用。

背景技术

叶酸是指四氢叶酸(THF)及其衍生物，为一种水溶性B族维生素，是生物体的必需成分。人体自身不能合成叶酸，需要从食物中才能获得。谷类作物的叶酸含量较低，因此依赖这些主要作物尚不能达到人类叶酸的推荐摄入量。目前，叶酸缺乏是一个既影响发展中国家又影响发达国家的全球性健康问题。叶酸缺乏会引发巨幼红细胞贫血和胎儿神经管发育缺陷等疾病，因此叶酸对人体正常生活动十分重要。现在都建议妇女在备孕期间应该补充叶酸。叶菜是居民膳食叶酸的主要来源，但叶酸结构不稳定，水煮、清炒、蒸制过程中均有一定的损失，黄瓜以鲜食为主，使叶酸得到最大限度的保留。

目前，对叶酸的研究主要集中在含量的测定及叶酸生物强化方面。齐敏采用高效液相色谱法测定了50份菠菜样品的叶酸含量。张毅通过对液相条件流动相、流速、柱温、波长等条件的优化，确定了高效液相色谱法测定叶菜中叶酸以及五甲基四氢叶酸的检测方法。周恒勇等建立了高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)直接测定豆芽、西红柿、菠菜等蔬菜提取物中叶酸含量的方法。邵丽华等用0.04％的高锰酸钾氧化，在Ex＝370nm，Em＝443nm处用间接荧光法测定小米叶酸含量。该法简单，灵敏度高，重复性好，结果令人满意。此方法可用于小米及谷物粮食作物的叶酸含量测定。周福林发现在pH值5.0的HAc-NaAc缓冲溶液中，Co²⁺可直接催化KIO₄氧化叶酸。据此，建立了测定叶酸的催化氧化荧光新方法。该法操作简便、灵敏度高，用于蔬菜中叶酸的测定，结果令人满意。在叶酸强化方面，迄今为止，唯一提高叶酸含量的方法是转基因过表达叶酸合成过程中的酶。提高植物中叶酸的含量可通过过表达GTP环化水解酶I(GTPCHI)和氨基脱氧分支酸合成酶(ADCS)来实现。单独GTPCHI的过表达会引起蝶呤的大幅积累，单独ADCS的过表达会引起p-ABA的大幅提高，均不会引起叶酸含量的大幅变化，只有当两者共同过表达才表现出叶酸含量的大幅提高。

目前在关于提高叶酸含量的植物育种方面，公开号CN 105647942A、发明名称为玉米ZmGFT1基因在提高植物叶酸含量中的应用的专利公开了玉米ZmGFT1基因及该基因中显著影响5-甲酰四氢叶酸含量的关键SNP位点的发现，不仅为在玉米和其他作物中研究叶酸代谢提供了理论基础，还可以提高转基因植物的叶酸含量。但目前公开的与叶酸含量相关的分子标记十分有限，需要开发大量的与植物叶酸含量相关的分子标记。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记及其应用，所述分子标记与黄瓜叶酸含量紧密连锁，在筛选高叶酸黄瓜种质资源上的应用。

本发明提供了与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记，所述INDEL分子标记的上游扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所述INDEL分子标记的下游扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明提供了用于筛选高含量叶酸特征的黄瓜种质资源的试剂盒，包括所述INDEL分子标记中的上游扩增引物和下游扩增引物。

优选的，还包括PCR反应所需要的试剂。

本发明提供了所述INDEL分子标记或所述试剂盒在筛选高含量叶酸特征的黄瓜种质资源中的应用。

本发明提供了一种筛选高含量叶酸的黄瓜种质资源的方法，包括以下步骤：

1)提取检测样品的基因组DNA；

2)以提取的基因组DNA为模板，以所述INDEL分子标记中的扩增引物进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；

3)对所述PCR扩增产物进行测序或电泳检测；

当所述PCR扩增产物的测序结果如SEQ ID No.3所示或电泳结果出现一条236bp的电泳条带，则检测样品为低叶酸黄瓜材料；

当所述PCR扩增产物的测序结果如SEQ ID No.4所示或电泳结果出现一条233bp的电泳条带，则检测样品为高叶酸黄瓜材料。

优选的，所述PCR扩增的反应体系为10μL：5.0ng·μL^-1DNA模版3μL，50ng·μL^-1上游扩增引物1μL和50ng·μL^-1下游扩增引物1μL和5μL Go Phanta Max MasterMix。

优选的，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min。

优选的，所述高叶酸黄瓜材料中叶酸含量>7.09μg/g；

所述低叶酸黄瓜材料中叶酸含量<5.37μg/g。

本发明提供了与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记，本发明以中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组选育的74份自交系和杂交种为试验材料，利用其基因型数据及鉴定所得表型数据，进行全基因组关联分析(GWAS)，检测到与黄瓜叶酸含量相关的INDEL位点INDEL5.9，与高叶酸黄瓜02245相比，低叶酸含量的黄瓜在35bp处有四个碱基的插入。以65G和02245为亲本构建的含143个株系的F2代群体为试验材料，从该群体中挑选20份叶酸含量高(>7.09μg/g)的材料和20份叶酸含量低(<5.37μg/g)的材料进行验证，结果表明对于高叶酸含量的黄瓜材料INDEL5.9验证的正确率为80.0％。本发明不仅为控制黄瓜中叶酸含量的基因的精细定位和分子克隆奠定了基础，同时也为利用分子标记辅助选育叶酸含量高的黄瓜新品种提供了高效的途径。

本发明基于开发的INDEL标记引物提供一种用于辅助筛选具有特定高叶酸含量的黄瓜种质资源的方法，采用所述INDEL标记的特异性引物扩增待测材料的基因组DNA，然后对扩增产物进行电泳检测，扩增产物可能出现两种情况：与高叶酸含量的材料相比低叶酸材料在35bp处有四个碱基的插入。通过本发明提供的方法，可以在黄瓜候选材料的任何阶段对其进行叶酸含量高低的鉴定和筛选，具有高效、限制少、准确的优点。

附图说明

图1为采用本发明所述的INDEL5.9特异性引物验证黄瓜材料获得的基因片段对比图，P1代表低叶酸材料，P2代表高叶酸材料；

图2为采用本发明所述的INDEL5.9标记的特异性引物经扩增后验证不同黄瓜材料的电泳检测结果；其中‘a’代表高叶酸材料，‘b’代表低叶酸材料，‘h’代表中间型材料；灰色字体对应的泳道为表型与标记条带验证不一致的单株。

具体实施方式

本发明提供了与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记，所述INDEL分子标记的上游扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所述INDEL分子标记的下游扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。所述INDEL分子标记与黄瓜叶酸含量相关紧密连锁。采用上述引物扩增INDEL分子标记得到两种扩增片段，将两个扩增片段经测序和比对发现，与高叶酸含量的材料相比，低叶酸材料在35bp处有四个碱基的插入(见图1)。

本发明提供了用于筛选高含量叶酸特征的黄瓜种质资源的试剂盒，包括所述INDEL分子标记中的上游扩增引物和下游扩增引物。所述试剂盒还优选包括PCR反应所需要的试剂，例如PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶等。

基于所述INDEL分子标记与黄瓜的高含量叶酸性状紧密连锁，本发明提供了所述INDEL分子标记或所述试剂盒在筛选高含量叶酸特征的黄瓜种质资源中的应用。在本发明中，所述高含量叶酸是指叶酸含量高于7.09μg/g的黄瓜种质。

基于所述INDEL分子标记与黄瓜的高含量叶酸性状紧密连锁，本发明还提供了一种筛选高含量叶酸的黄瓜种质资源的方法，包括以下步骤：

1)提取检测样品的基因组DNA；

3)对所述PCR扩增产物进行测序或电泳检测；

本发明提取检测样品基因组DNA。本发明对提取检测样品基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取植物基因组DNA的方法即可，例如试剂盒法或CTAB法等。在本发明实施例中，所述提取检测样品基因组DNA的方法为改良的CTAB法，参见张圣平博士论文：《黄瓜果实苦味基因遗传分析及精细定位》，2011,中国农业科学院,P73～74。

以提取的基因组DNA为模板，以所述INDEL分子标记中的扩增引物进行PCR扩增，得到PCR扩增片段。

在本发明中，所述PCR扩增的反应体系优选为10μL：5.0ng·μL^-1DNA模版3μL，50ng·μL^-1上游扩增引物1μL和50ng·μL^-1下游扩增引物1μL和5μL Go Phanta MaxMasterMix。所述PCR扩增的反应程序优选为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min。本发明对所述PCR扩增用仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的PCR扩增用仪器即可。

得到PCR扩增产物后，本发明对所述PCR扩增产物进行测序或电泳检测；当所述PCR扩增产物的测序结果如SEQ ID No.3所示或电泳结果出现一条236bp的电泳条带，则检测样品为低叶酸黄瓜材料；当所述PCR扩增产物的测序结果如SEQ ID No.4所示或电泳结果出现一条233bp的电泳条带，则检测样品为高叶酸黄瓜材料。在本发明中，所述高叶酸材料中叶酸含量优选>7.09μg/g；所述低叶酸黄瓜材料中叶酸含量优选<5.37μg/g。利用20份高叶酸黄瓜材料和20份低叶酸黄瓜材料进行验证(图2)，结果表明，利用该标记检测高叶酸材料，有16份材料的鉴定结果与表型鉴定数据结果一致，准确率为80.0％。

下面结合实施例对本发明提供的与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

1)生物材料的来源说明

用于INDEL标记开发的试验材料为中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组的74份核心种质，其中包括华北类型，欧洲温室类型以及华北类型和欧洲温室类型的杂交种。74份核心种质为现有已知品种，在刘盼娜等人于2015年3月在《植物遗传资源学报》发表的文章《黄瓜核心种质遗传多样性的苗期和初花期形态标记分析》中有记载。本实验室亦有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

本发明所用的验证群体是以高叶酸材料黄瓜‘02245’和低叶酸材料‘65G’为亲本，杂交后获得F1代，F1自交后获得F2代，包含143个株系的F₂代群体。从中挑选20个叶酸含量高(>7.09μg/g)的材料，20个叶酸含量低(<5.37μg/g)的材料，用于该标记的验证。本实验室亦有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

65G(P₁)：欧洲温室型黄瓜雌性系，生长势强，叶片大，瓜长18厘米左右，果皮光滑，无刺瘤。为现有已知品种，在Guili Tian等人于2015年在《MolecularBreeding》第35期发表的文章《Genetic analysis and gene mapping ofpapayaring spotvirus resistance incucumber》中有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

02245(P₂)：华北密刺型黄瓜自交系，生长势强，叶片中等，瓜条深绿色，瓜长35厘米左右，白刺、密集，瘤中小，无棱、无纹。为现有已知品种，在Guili Tian等人于2015年在《MolecularBreeding》第35期发表的文章《Genetic analysis and gene mappingofpapaya ring spot virus resistance in cucumber》中有记载。本实验室有保存，保证自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验

2)主要试剂来源说明

PCR实验使用Shanghai PromeGa公司的GoTaq GreenMasterMix；测序在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。

SNP标记引物是本实验室基于重测序的基因组信息、利用primer 6.0软件设计，并在上海生工公司合成。

下述实施例中，未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular cloning:alaboratorymanual，2001)，或参考制造厂商说明书记载的方法。

实施例1

用于检测黄瓜叶酸含量高低的INDEL标记INDEL5.9的获得

步骤1.黄瓜叶酸含量的测定

中国农业科学院蔬菜花卉研究所黄瓜课题组选育的74份自交系和杂交种为试验材料，对其商品瓜进行表型鉴定。采用双酶法提取材料中的叶酸，采取液相色谱三重四极杆质谱联用仪测定叶酸含量。

以高叶酸材料黄瓜‘02245’和低叶酸材料‘65G’为亲本，杂交后获得F1代，F1自交后获得F2代，以包含143个株系的F₂代群体为材料，利用液相色谱三重四极杆质谱联用仪测定商品瓜的叶酸含量。经数据分析发现黄瓜叶酸含量呈连续分布，且接近正态分布，表明在F₂群体中该性状是受数量性状控制的。

步骤2.全基因组关联分析(GWAS)

利用74份试验材料的基因型数据及表型数据进行GWAS分析，使用emmax软件进行分析，采用混合线性模型(MLM)，经过主成分分析(PCA)，并绘制曼哈顿图。

步骤3.SNP标记的开发及其应用

分析-logP value在5以上的位点，得到5号染色体9133354bp处的INDEL5.9为候选INDEL位点。根据INDEL的位置，用primer 6.0软件设计正向引物和反向引物，其核苷酸序列如下：

INDEL5.9-F：5’-CAAAGAGTTCAATTTTTAG-3’；(SEQ ID No.1)

INDEL5.9-R：5’-AGGAGCTGTCATGTTATTTGGA-3’；(SEQ ID No.2)。

实施例2

与黄瓜叶酸含量相关的INDEL5.9标记的验证

使用以高叶酸含量的黄瓜‘02245’和低叶酸含量的黄瓜‘65G’杂交后获得F1代，F1自交后获得F2代，以包含143个株系的F₂代群体为材料对实施例1获得的INDEL标记INDEL5.9进行验证，以确定该标记用于分子标记辅助选择的准确性。

步骤1.DNA提取

取黄瓜植株的嫩叶，用改良的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法提取亲本及重组自交系群体各单株的基因组DNA。

步骤2.PCR扩增

PCR反应体系为：总反应体系10μL,3μL DNA(5.0ng·μL^-1)，正向和反向引物(50ng·μL^-1)各1μL，5μL Go PhantaMax MasterMix(Promega公司产品)。

PCR扩增程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃保温5分钟，16℃保存。

步骤3.黄瓜叶酸含量判断

方法一：通过PCR产物直接测序来判断黄瓜叶酸含量

直接对PCR产物进行测序，若35bp处有四个碱基的插入则为低叶酸材料，若35bp处没有四个碱基的插入，则为高叶酸材料。

方法二：通过PCR产物的电泳条带来判断黄瓜叶酸含量

PCR反应体系为：总反应体系10μL，3μL DNA(5.0ng·μL^-1)，正向和反向引物(50ng·μL^-1)各1μL，5μL Go

Green Master Mix(Promega公司产品)。

扩增产物用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，150V恒功率电泳分离1h30min，电泳后银染显色，统计带型。

扩增产物可能出现三种情况：第一种是获得一条236bp的条带，这种是低叶酸材料，条带带型记为b，第二种是是获得一条233bp的条带，这种为高叶酸材料，条带带型记为a，第三种是出现两个条带同时检测到，为中间型，条带带型记为h。

利用20份高叶酸黄瓜材料和20份低叶酸黄瓜材料进行验证(图2)，结果表明，利用该标记检测高叶酸材料，有16份材料的鉴定结果与表型鉴定数据结果一致，准确率为80.0％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caaagagttc aatttttag 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggagctgtc atgttatttg ga 22

<210> 3

<211> 236

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaagagttc aatttttagt caaactccaa aaaaaaaaaa aaagttttta aaaactaatt 60

cttttcaaag tttgatttac ttttttaaaa tattagtaaa aattaaatta aaaaataata 120

aatttatgga tgaaaaacct atttcattac cccattttct tggccctttt cttctattta 180

tattgatctt gaaaaaaatt agtcattctt aagttccaaa taacatgaca gctcct 236

<210> 4

<211> 233

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caaagagttc aatttttagc caaactccaa aaaaaaaaag tttttaaaaa ctaattcttt 60

tcaaagtttg atttactttt ttaaaatatt agtaaaaatt agattaaaaa aataataaat 120

ttatggatga aaaacctatt tcattacctc attttcttgt tccttttctt ctatttatat 180

tgatcttgaa atagattagt cattcttaag ttccaaataa catgacagct cct 233

Claims

1.与黄瓜叶酸含量相关的INDEL分子标记，其特征在于，所述INDEL分子标记的上游扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，所述INDEL分子标记的下游扩增引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

2.用于筛选高含量叶酸特征的黄瓜种质资源的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述INDEL分子标记中的上游扩增引物和下游扩增引物。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应所需要的试剂。

4.权利要求1所述INDEL分子标记或权利要求2或3所述试剂盒在筛选高含量叶酸特征的黄瓜种质资源中的应用。

5.一种筛选高含量叶酸的黄瓜种质资源的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取检测样品的基因组DNA；

2)以提取的基因组DNA为模板，以权利要求1所述INDEL分子标记中的扩增引物进行PCR扩增，得到PCR扩增片段；

3)对所述PCR扩增产物进行测序或电泳检测；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为10μL：5.0ng·μL^-1DNA模版3μL，50ng·μL^-1上游扩增引物1μL和50ng·μL^-1下游扩增引物1μL和5μL GoPhanta Max MasterMix。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃保温5min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述高叶酸黄瓜材料中叶酸含量>7.09μg/g；

所述低叶酸黄瓜材料中叶酸含量<5.37μg/g。