CN112280881B - 用于青花菜种质资源和品种鉴定的snp标记组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于青花菜种质资源和品种鉴定的SNP标记组合及应用，包含25个SNPs，编号分别为Bol.ita01～Bol.ita25，它们的信息如表1所示。本发明基于23份青花菜核心种质重测序获得的大量SNP中挑选的25个SNP标记，可以实现对青花菜种质资源及品种的基因型检测，使得基因分型更加高效、稳定、精准和低成本。基于所述SNP标记，可用于青花菜品种的DNA指纹数据库构建、青花菜种质资源遗传多样性分析、青花菜分子标记辅助育种和青花菜品种纯度鉴定等。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及用于青花菜种质资源和品种鉴定的SNP标记组合及应用。
背景技术
青花菜是芸薹科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)甘蓝种(oleracea)中的一个变种。它起源于地中海，于19世纪末20世纪初传到我国，长期以来是我国的特菜。近20年来，青花菜凭借其清爽的口感，丰富的营养价值而颇受人们的喜爱。国内鲜销市场不断发展，种植面积逐年增加，目前栽培面积达100多万亩。然而，由于青花菜育种起步晚，优异种质资源相对匮乏，导致目前国产青花菜种子的市场占有率不高，占有率仅为10％左右。构建青花菜核心种质资源及主要育成品种的DNA指纹图谱，建立青花菜种质材料共享与收益分配机制，有利于加强国内育种单位交流合作，打破国外青花菜品种价格垄断和技术垄断的局面。
品种和核心种质真实性鉴定是保障种子质量、规范种子市场的重要手段。品种和核心种质的独有性、真实性、特异性和一致性鉴定，传统的方法是根据形态差异进行鉴别区分。但是，田间种植鉴定存在很大的差异，有时候连育种者本人都难以辨别。另一方面，在种质资源较为匮乏的条件下，优异亲本会呈现集中化和核心化的趋势，大量在形态上相似而只存在个别性状或基因差异的品种，通过传统形态学方法已无法进行准确的品种鉴定和纯度分析。因此，寻找一种安全有效、方便快捷、精确稳定的技术以鉴定种质资源的真实性和纯度显得尤为重要。
随着第三代分子标记技术SNP标记的发展和基因分型技术的提高，越来越多的作物采用SNP标记构建指纹图谱和用于种质鉴定，如玉米、油菜、大豆、香菇、羊草等。相比于SSR标记，SNP标记数目多，覆盖基因组范围广，基于高密度的标记信息保证了品种鉴定的可靠性。目前主要的SNP标记基因分型技术有SNPlex、TaqMan、KASP等。其中，由英国LGC公司推出的KASP技术用两个通用淬灭探针和多个具体位点的引物，现实多位点的同时检测。KASP是竞争性等为基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，可在广泛的基因组DNA样品中对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断，不仅提高了实验效率，也能大大节约成本。
发明内容
本发明的目的是提供一套用于青花菜种质资源及品种鉴定的SNP标记组合及应用。
为了实现本发明的目的，第一方面，本发明提供一套用于青花菜种质资源及品种鉴定的SNP标记，包括25个SNPs，25个SNPs编号分别为Bol.ita01～Bol.ita25，它们的信息如表1所示；其中，标记Bol.ita01含有位于青花菜基因组C1号染色体第1111992处的等位为G/T的核苷酸序列，其余标记以此类推。
表1 25个青花菜SNP标记
上述SNP物理位置是基于青花菜HDEM的全基因组序列而确定的，青花菜HDEM全基因组网站http://www.genoscope.cns.fr/externe/plants/。
第二方面，本发明提供所述25个SNP标记可以基于KASP技术进行基因分型。针对每个SNP标记可以设计三条引物序列(KASP引物组合)，即两条正向引物与一条反向引物，利用正向引物末端碱基与模板DNA的特异性结合，检测该SNP的基因型。所述KASP引物组合，包含Bol.ita01～Bol.ita25引物组中的任意一组或多组，或全部，所述Bol.ita01～Bol.ita25引物组的序列信息见表2。
表2基于KASP技术检测青花菜SNP标记的引物信息
第三方面，本发明提供含有上述KASP引物的检测试剂、试剂盒或芯片。
第四方面，本发明提供所述25个青花菜SNP标记或所述KASP引物的以下任一应用：
(1)用于构建青花菜品种的DNA指纹数据库。
(2)用于青花菜种质资源遗传多样性分析。
(3)用于青花菜分子标记辅助育种。
(4)用于青花菜品种纯度鉴定。
上述应用还包括以下步骤：
1)提取待测青花菜基因组DNA。
2)向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASPMastermix，进行PCR扩增。
3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。
其中，所述KASP Primer mix中含有三条特异性引物：正向引物1、正向引物2和反向引物，分别对应F(FAM)、H(Hex)和C(common)。
所述KASP Mastermix包含如下各组分：通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaqDNA聚合酶，dNTP和MgCl2。
步骤2)中引物F的5’端添加FAM荧光标签序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’
引物H的5’端添加HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
所述PCR的反应体系为：PCR预混液5μL；引物混合液0.14μL；其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA 5μL。
所述PCR的反应条件为:90-95℃预变性10-20min；第一步扩增反应，90-95℃变性10-30s，61-55℃退火延伸30-90s，每个循环的退火温度降低0.2-1℃，共10个循环；第二步扩增反应，90-95℃变性10-30s，53-57℃退火延伸30-90s，共20-35个循环。
优选地，所述PCR的反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；第二步扩增反应，94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
本发明的有益效果：
本发明基于23份青花菜核心种质重测序获得的大量SNP中挑选的25个SNP标记，可以实现对青花菜种质资源及品种的基因型检测，使得基因分型更加高效、稳定、精准和低成本。基于所述SNP标记，可用于青花菜品种的DNA指纹数据库构建、青花菜种质资源遗传多样性分析、青花菜分子标记辅助育种和青花菜品种纯度鉴定等。
附图说明
图1为本发明对扩增产物的荧光扫描数据进行读取的结果示例图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但并不局限本发明的应用范围。若未特别指出，实施例均按照常规实验条件。
以下实施例中使用的KASP Master mix购置于英国LGC公司。
实施例125个用于青花菜种质资源及品种鉴定的SNP标记开发
1.用于SNP标记开发的材料
用于SNP标记开发的材料来自于浙江省农科院蔬菜研究所多年育种实践中积累的23份代表性的青花菜核心种质。将核心种质播种穴盘，苗期取样，用植物基因组提取试剂盒(康为公司)提取DNA检测浓度与质量后，送北京诺禾致源科技股份有限公司进行基因组重测序，不同核心种质测序深度在25-34×，获得的SNP位点数在899,926～1,908,908之间。
2.用于SNP标记筛选的材料
用于基因型检测的材料来自于国内11家主要的青花菜育种团队以及日本坂田公司的对照品种6份，共计392份，涵盖了国内青花菜的主要育成品种和新组合，能够代表广泛的遗传变异，使得标记的筛选具有很好的代表性和应用价值。
3.SNP位点的筛选和确定
基于青花菜基因组重测序数据，与青花菜HDEM参考基因组比对，挖掘SNP位点，根据以下特征进行筛选评估：(a)剔除缺失基因型比例超过20％的位点；(b)剔除最小等位基因频率(MAF)低于0.05的位点；(c)剔除前后50bp存在其它变异的位点；(d)剔除PIC值低于0.2的位点；(e)将位点进行批量的KASP引物设计，剔除引物GC含量低于0.3的位点；(f)为尽可能获得功能性KASP标记，保留位于外显子、基因间隔区、以及基因上下游的位点；(g)根据位点的物理位置，筛选出的位点能均匀覆盖青花菜基因组。
4.筛选获得的SNP标记的信息
本发明基于KASP技术对扩增产物的荧光扫描数据进行读取，代表性的结果如图1所示，其中左上角为GG基因型，中间为GA基因型，右下角为AA基因型，左下角两个为NTC(无菌水对照)。
最终挑选的SNP标记共25个，平均最小等位基因频率(MAF)为0.30，平均多态性指数(PIC)为0.45。
表3 25个SNP标记的相关信息
| SNP位点 | 染色体 | MAF值 | PIC值 | SNP位点 | 染色体 | MAF值 | PIC值 |
| Bol.ita01 | C1 | 0.21 | 0.37 | Bol.ita14 | C5 | 0.34 | 0.49 |
| Bol.ita02 | C1 | 0.24 | 0.46 | Bol.ita15 | C5 | 0.36 | 0.50 |
| Bol.ita03 | C1 | 0.39 | 0.53 | Bol.ita16 | C5 | 0.37 | 0.49 |
| Bol.ita04 | C2 | 0.28 | 0.45 | Bol.ita17 | C6 | 0.32 | 0.46 |
| Bol.ita05 | C2 | 0.25 | 0.42 | Bol.ita18 | C6 | 0.31 | 0.45 |
| Bol.ita06 | C2 | 0.26 | 0.42 | Bol.ita19 | C7 | 0.24 | 0.41 |
| Bol.ita07 | C3 | 0.14 | 0.30 | Bol.ita20 | C7 | 0.24 | 0.40 |
| Bol.ita08 | C3 | 0.34 | 0.49 | Bol.ita21 | C7 | 0.35 | 0.50 |
| Bol.ita09 | C3 | 0.41 | 0.51 | Bol.ita22 | C8 | 0.32 | 0.45 |
| Bol.ita10 | C3 | 0.24 | 0.42 | Bol.ita23 | C8 | 0.19 | 0.35 |
| Bol.ita11 | C4 | 0.22 | 0.40 | Bol.ita24 | C9 | 0.34 | 0.47 |
| Bol.ita12 | C4 | 0.39 | 0.53 | Bol.ita25 | C9 | 0.43 | 0.53 |
| Bol.ita13 | C5 | 0.25 | 0.42 |
实施例2利用25个SNP标记检测待测青花菜杂交中‘绿雄90’的纯度检测方法如下：
1.DNA的提取
随机挑选待测的‘绿雄90’杂交种种子180粒进行DNA制备
(1)将种子播种于穴盘，两周后取1cm大小的叶片于2ml离心管中，放入4mm直径的玻璃珠。
(2)加入500ul的2％的CTAB，用研磨机充分研磨；
(3)65℃水浴45min后，加入等体积的氯仿—异戊醇(体积比24:1)，颠倒混匀；
(4)12000rpm离心15min，取上清(约400ul)于新的1.5ml管中；
(5)向上清中加入2倍体积的无水乙醇，待DNA析出；
(6)10000rpm离心2min，倒掉上清液后，加75％的乙醇清洗3次，风干；
(7)加入200μl TE(PH8.0)或ddH2O，充分溶解备用。
2.利用KASP技术进行基因分型检测
利用标记Bol.ita04和Bol.ita15组成的特异性KASP标记对‘绿雄90’进行纯度鉴定。
用于KASP检测的PCR反应体系如下：PCR预混液5μL；引物混合液0.14μL；其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA5μL；
用于PCR的反应条件为：94℃预变性15min；94℃变性20s，61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
3.结果分析
通过检测，获得180个待测杂交种‘绿雄90’种子样品在编号为Bol.ita04和Bol.ita15的SNP标记基因分型结果。统计结果表明：180个样品用Bol.ita04标记基因分型，表现为杂合基因型TC，5个样品表现为母本基因型CC；180个样品用Bol.ita15标记基因分型，表现为杂合基因型AC，同样的5个样品表现为母本基因型CC。即待测样品母本自交率为2.8％，杂交种纯度为97.2％。
实施例3利用SNP标记鉴定待测青花菜是否为杂交种‘耐寒优秀’
检测方法如下：
随机挑选待测青花菜种子与‘耐寒优秀’标准样品种子各48粒，按照实施例2中的方法制备DNA，同时利用本发明涉及的25个SNP标记进行基因分型检测。
PCR反应体系和反应条件如实施例2。
结果分析：通过上述检测，获得待测的青花菜种子与‘耐寒优秀’25个SNP位点上分析结果，比对分析表明：待测杂交种在10个SNP位点与‘耐寒优秀’存在差异，表明待测杂交种不是‘耐寒优秀’的真实杂交种。
最后说明的是，以上所述为本发明的优选实施方式，尽管通过上述优选实施例，已经对本发明进行了详细的说明，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种改变，而不偏离本发明的权利要求书所要求的范围。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 用于青花菜种质资源和品种鉴定的SNP标记组合及应用
<141> 2020-09-11
<160> 75
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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agctcaggca accatataca atatttg 27
<210> 36
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gagatgcgtt gatgaagacg gttgtt 26
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
caagtcaaat gagaagactt accatca 27
<210> 38
<211> 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aagtcaaatg agaagactta ccatcg 26
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcttcttctt cttcctcgtg cttc 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
taagcctact ctcctcgaga agctt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gactgaccca taataatatc ccctga 26
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actgacccat aataatatcc cctgc 25
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<212> DNA
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ttgagactct gtatcatcat gaggagaa 28
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<212> DNA
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ggtcgttgtg agctatttcc agaaat 26
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gtcgttgtga gctatttcca gaaac 25
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ctcggtttcc ctccactgat tcaaata 27
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catcgtcagt acagacgcct ct 22
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<400> 52
tattcatgca tcccagctct aaattct 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ttcatgcatc ccagctctaa attcc 25
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaattatct tgtcaatgtg gtcagtcgta 30
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gactgcttag agaaatggga tatcg 25
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgactgctt agagaaatgg gatatca 27
<210> 57
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcattatcta cagttatgtt gaacactctt t 31
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caggggtgtt gctctgagtc aa 22
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggggtgttg ctctgagtca g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgagtatt ttctattgaa gaagcagtat a 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atgagtattt tctattgaag aagcagtatg 30
<210> 63
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<212> DNA
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gggacagtga agttcaaggt gtgat 25
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<211> 25
<212> DNA
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cttcttcaac aatctcccaa agcca 25
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ttcttcaaca atctcccaaa gccc 24
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<212> DNA
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gcaaggcttg ctaagacagc tctt 24
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<212> DNA
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ggggaagcta tgaggttgac tgaat 25
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ccatcgtcca aattgatagg gtcta 25
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catcgtccaa attgataggg tctg 24
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gaagacattc aggaggtctt gcgtaa 26
<210> 73
<211> 26
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ggctatctct tcaactcctt catgtt 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gttggattac atagtggttg ttggaaatat at 32
Claims (8)
1.用于扩增SNP标记的KASP引物组合，其特征在于，包含Bol.ita04和Bol.ita15的引物组合；
。
2.含有权利要求1的KASP引物的检测试剂、试剂盒或芯片。
3.权利要求1所述KASP引物的以下应用，其特征在于：
用于青花菜杂交种‘绿雄90’品种纯度鉴定。
4.如权利要求3所述KASP引物的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测青花菜基因组DNA；
2)向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASPPrimermix和通用的KASP Mastermix，进行PCR扩增；
3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，KASPPrimermix中含有三条特异性引物：正向引物1、正向引物2和反向引物，分别对应FAM、Hex和Common；所述KASPMastermix包含如下各组分：通用的FRETcassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaqDNA聚合酶，dNTP和MgCl2；步骤2)中引物F的5’端添加FAM荧光标签序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，引物H的5’端添加HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR的反应体系为：PCR预混液5μL；引物混合液0.14μL；其中各引物的终浓度均为5nM；20ng/μL模板DNA5μL。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述PCR的反应条件为：90-95℃预变性10-20min；第一步扩增反应，90-95℃变性10-30s，61-55℃退火延伸30-90s，每个循环的退火温度降低0.2-1℃，共10个循环；第二步扩增反应，90-95℃变性10-30s，53-57℃退火延伸30-90s，共20-35个循环。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述PCR的反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，61-55℃退火延伸60s，每个循环的退火温度降低0.6℃，共10个循环；第二步扩增反应，94℃变性20s，55℃退火延伸60s，共26个循环。
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| 花椰菜花球发育相关基因BoCAL 的KASP 标记开发和应用;盛小光等;浙江农业学报;第34卷(第6期);1183-1192 * |
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