CN114196778A - 一种青花菜品种dna分子身份证的制作方法 - Google Patents

一种青花菜品种dna分子身份证的制作方法 Download PDF

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Abstract

一种青花菜品种DNA分子身份证的制作方法，该方法筛选出4对核心引物，可对目前22份大面积主栽青花菜品种基因分型，制作二维码青花菜品种DNA分子身份证，实现了以广泛基因组覆盖度的最少引物鉴定青花菜品种，能够把目前主要栽培的青花菜品种一一区分开，减少了繁复的工作量和高昂的检测成本。

Description

一种青花菜品种DNA分子身份证的制作方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体为一种基于SSR标记技术开发的用于青花菜品种真实性鉴定的方法，应用于品种分子鉴定及品种管理。
背景技术
青花菜(Brassica oleracea L.var.italic)，又名西兰花等，是起源于欧洲地中海沿岸的甘蓝类蔬菜变种之一。青花菜因富含抗癌活性成分莱菔硫烷，而备受国内外消费者的青睐。青花菜的需求量和种植面积也逐年增加。然而，在我国30多年的青花菜栽培历史中，其生产用种主要依赖于国外进口。目前生产中青花菜用种90％以上仍然为进口，种子价格奇高，而目前种子市场中的“同种异名“同种异名”、“同名异种”、“假冒套牌”等现象屡禁不止，制假、售假事件时有发生，使国家和农民利益受到很大的损害，给品种管理和产权保护带来诸多困难。要解决这一问题，需建立一种简便、快速、准确的品种识别方法，为青花菜品种管理提供技术支撑，为做好非主要农作物商品种子的进口监管提供技术支持。
品种识别及科学的种子管理需要达到唯一性、可识别(鉴别)性、可追溯性的要求。品种DNA分子标签即品种DNA分子身份证，通过品种分子指纹描述，将指纹信息转化为代码信息标注在种子标签上，可作为品种特异识别的一个标准，是品种数字化管理的核心技术之一。
发明内容
为了能够准确、快速、方便地识别青花菜品种，本发明提供一种青花菜品种DNA分子身份证的制作方法。
本发明的技术方案如下：
一种青花菜品种DNA分子身份证的制作方法，包括(1)青花菜品种基因组DNA提取、(2)PCR扩增、(3)PCR产物的毛细管电泳荧光检测、(4)DNA指纹数据的获得、(5)青花菜品种基本商品信息数据的采集、(6)青花菜品种DNA分子标签制作，其特征在于：
在所述步骤(2)PCR扩增中每一个青花菜品种提取的基因组DNA，分别用引物BoGMS0501、BoE718、BoGMS0941、BoE723进行扩增；
所述引物BoGMS0501由BoGMS0501正向引物和BoGMS0501反向引物组成，所述BoGMS0501正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，BoGMS0501反向引物的碱基序列如SEQID NO：2所示；
所述引物BoE718由BoE718正向引物和BoE718反向引物组成，所述BoE718正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，BoE718反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；
所述引物BoGMS0941由BoGMS0941正向引物和BoGMS0941反向引物组成，所述的BoGMS0941正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，BoGMS0941反向引物的碱基序列如SEQID NO：6所示；
所述引物BoE723由BoE723正向引物和BoE723反向引物组成，所述BoE723正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，BoE723反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示。
在所述步骤(4)DNA指纹数据的获得中每一个青花菜品种的DNA指纹数据的获得是根据毛细管荧光电泳读出的该青花菜品种4个位点的等位变异片段大小数据，纯合位点的等位变异记录为X/X，以X/X的形式表示其DNA指纹数据，杂合位点的等位变异记录为X/Y，以X/Y的形式表示其DNA指纹数据，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小数据，小片段在前，大片段在后，以两个片段大小记录；每一个青花菜品种的DNA指纹数据X/Y或X/Y依次按引物BoGMS0501、BoE718、BoGMS0941、BoE723的引物顺序排列；
在所述步骤(5)青花菜品种基本商品信息数据的采集中每一个青花菜品种所采集的基本商品信息数据包括作物种类、品种植物学类型、品种繁殖类型、品种名称；
步骤(6)青花菜品种DNA分子标签制作是将同一青花菜品种在步骤(4)获得的DNA指纹数据和在步骤(5)所采集的基本商品信息数据输入二维码生成器生成二维码图形即为青花菜品种DNA分子身份证。
进一步，步骤(5)青花菜品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括品种登记年份。
进一步，步骤(5)青花菜品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括生产经营者名称。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明通过75对SSR引物对22份大面积主栽青花菜品种基因分型，根据最少引物组合原则筛选出来的4对核心引物对鉴别大面积主栽青花菜品种可以全部区分，实现了以广泛基因组覆盖度的最少引物鉴定青花菜品种，能够把目前主要栽培的青花菜品种一一区分开，减少了繁复的工作量和高昂的检测成本。
2、本发明制作的分子身份证标识于商品种子包装上，实现了青花品种和其种子的双重防伪，达到品种识别及科学的种子管理的唯一性、可识别(鉴别)性、可追溯性。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是BoGMS0501正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是BoGMS0501反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：3所示的是BoE718正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：4所示的是BoE718反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：5所示的是BoGMS0941正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：6所示的是BoGMS0941反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：7所示的是BoE723正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：8所示的是BoE723反向引物的碱基序列。
附图说明
图1：实施例1中采用本发明方法对青花菜品种“美青”制作的DNA分子身份证二维码。
图2：用手机扫图1二维码扫到的内容。
具体实施方式
本发明针对青花菜主栽品种，选取多态性高、区分度好、数据容易统计、扩增重复性好、引物位点在染色体上均匀分布的SSR引物作为核心引物。采用22个青花菜主栽品种对75对青花菜SSR引物进行筛选，筛选出22对多态性高、区分度好、数据容易统计、扩增重复性好、引物位点在染色体上均匀分布的SSR引物。在用该22对引物对所述22个青花菜主栽品种进行扩增检测，得到DNA指纹图谱，根据引物扩增等位基因数和多态信息含量(PIC)指数，从1对引物开始逐步增加引物数量，筛选可将供试材料全部区分的引物组合，最终确定4对核心引物可以区分全部供试品种。
这4对核心引物分别分布在青花菜4条染色体，青花菜为二倍体，DNA指纹数据以4个位点的等位变异片段大小数据表示，DNA指纹数据通过毛细管荧光电泳读取。
表1本发明用于鉴别青花菜品种的引物信息
Figure BDA0003433812290000031
Figure BDA0003433812290000041
实例1青花菜品种“美青”DNA分子身份证的制作方法
(1)青花菜基因组DNA提取：
取美青叶片200-300mg置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨。每管加入700μL经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴60min并2-3次颠倒混匀。每管加入等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液，混合液中三氯甲烷:异戊醇的体积比为24:1，充分混合后静置10min，在12000rpm离心15min。吸取上清液转移至一新的离心管，加入等体积0℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min后在4℃、12000rpm离心10min，弃上清液，加入70％v/v乙醇，旋转2-3次后弃去乙醇溶液，并倒立于垫有滤纸的实验台上，室温放置10min以上。加入100μL超纯水或100μL TE缓冲液，充分溶解后得基因组DNA，备用。
CTAB提取液：81.7g氯化钠和20.0g CTAB溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris-HCl100mL，0.5mol/L EDTA 40mL，超纯水定容至1000mL，4℃贮存。
(2)PCR扩增
取步骤(1)获得的基因组DNA样品进行扩增，PCR扩增反应体系为：10μL的反应体积，其中2×mix混合液5μL、10μmol/L正向引物0.3μL、10μmol/L反向引物0.3μL，样品DNA 1μL，超纯水3.4μL。
PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；循环内94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，循环30次，之后72℃延伸10min，4℃保存。
分别用引物BoGMS0501、BoE718、BoGMS0941、BoE723进行扩增。
所述引物BoGMS0501由BoGMS0501正向引物和BoGMS0501反向引物组成，所述的BoGMS0501正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，BoGMS0501反向引物的碱基序列如SEQID NO：2所示。
所述引物BoE718由BoE718正向引物和BoE718反向引物组成，所述BoE718正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，BoE718反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。
所述引物BoGMS0941由BoGMS0941正向引物和BoGMS0941反向引物组成，所述BoGMS0941正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，BoGMS0941反向引物的碱基序列如SEQID NO：6所示。
所述引物BoE723由BoE723正向引物和BoE723反向引物组成，所述BoE723正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，BoE723反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示。上述各正向引物的5’端修饰有1个FAM荧光标记,由生物技术公司合成各对引物。
(3)PCR产物的毛细管电泳荧光检测
将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，分别从中吸取1μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将深孔板在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时1000rpm离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳。对采集的数据采用GeneMapperV3.2数据分析软件进行分析。读出每个位点每份样品的等位变异大小数据。
(4)DNA指纹数据的获得
每一个青花菜品种的DNA指纹数据的获得是根据毛细管荧光电泳读出的在4个位点上的等位变异片段大小数据，纯合位点的等位变异记录为X/X，以X/X的形式表示其DNA指纹数据，杂合位点的等位变异记录为X/Y，以X/Y的形式表示其DNA指纹数据，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小数据，小片段在前，大片段在后，以两个片段大小记录；每一个青花菜品种的DNA指纹数据X/Y或X/Y依次按引物BoGMS0501、BoE718、BoGMS0941、BoE723依次排列。
美青在4个位点上的扩增片段大小(bp)分别为(按引物顺序排列)：249/249、175/224、209/222、179/179，即为美青的DNA指纹数据：249/249、175/224、209/222、179/179。
上述4对引物分别分布在青花菜的4条染色体上。分子标记数据为可替换或扩展项，有多态性更好的位点可以替换或补充。
(5)青花菜品种基本商品信息数据的采集
美青的基本商品信息数据如下：
作物种类：青花菜
品种植物学类型：甘蓝种
品种繁殖类型：杂交种
品种名称：美青
生产经营者名称：日本时田种苗株式会社
(6)云粳系列水稻品种DNA分子标签制作
将步骤(4)获得的美青的DNA指纹数据(DNA指纹数据：249/249、175/224、209/222、179/179)和步骤(5)采集的美青的基本商品信息数据输入微微二维码生成器生成二维码图形即为美青DNA分子身份证，如图1-2所示。该分子身份证实现了使用者用普通设备(手机)快速识别种子真伪。
实施例2其余21个青花菜主栽品种的DNA分子身份证的制作
实施例2除所用品种与实施例1不同外，其余实验操作步骤与实施例1相同，不再赘述。22个青花菜品种分子指纹信息见表2。分别根据表2中青花菜主栽品种的DNA分子指纹信息，再采集对应的基本商品信息数据，按实施例1所述方法，即可制作其DNA分子身份证。
表2 22个青花菜品种分子指纹信息
Figure BDA0003433812290000061
Figure BDA0003433812290000071
序列表
<110> 云南省农业科学院粮食作物研究所
云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所
云南省农业科学院热区生态农业研究所
<120> 一种青花菜品种DNA分子身份证的制作方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatgagtt tgctcgttag g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaatccttcc tcctttcac 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caagaaacgg acgtggtgaa ag 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctcgcgtat ggggctgtct 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttgaagaaa ctaaggagga aa 22
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaacgacagc gaagagag 18
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgttgaggcc gagagtgaga g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggacgccg gaaatgagaa 20

Claims (3)

1.一种青花菜品种DNA分子身份证的制作方法，包括(1)青花菜品种基因组DNA提取、(2)PCR扩增、(3)PCR产物的毛细管电泳荧光检测、(4)DNA指纹数据的获得、(5)青花菜品种基本商品信息数据的采集、(6)青花菜品种DNA分子标签制作，其特征在于：
在所述步骤(2)PCR扩增中每一个青花菜品种提取的基因组DNA，分别用引物BoGMS0501、BoE718、BoGMS0941、BoE723进行扩增；
所述引物BoGMS0501由BoGMS0501正向引物和BoGMS0501反向引物组成，所述BoGMS0501正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，BoGMS0501反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；
所述引物BoE718由BoE718正向引物和BoE718反向引物组成，所述BoE718正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，BoE718反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；
所述引物BoGMS0941由BoGMS0941正向引物和BoGMS0941反向引物组成，所述的BoGMS0941正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，BoGMS0941反向引物的碱基序列如SEQID NO：6所示；
所述引物BoE723由BoE723正向引物和BoE723反向引物组成，所述BoE723正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，BoE723反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；
在所述步骤(4)DNA指纹数据的获得中每一个青花菜品种的DNA指纹数据的获得是根据毛细管荧光电泳读出的该青花菜品种4个位点的等位变异片段大小数据，纯合位点的等位变异记录为X/X，以X/X的形式表示其DNA指纹数据，杂合位点的等位变异记录为X/Y，以X/Y的形式表示其DNA指纹数据，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小数据，小片段在前，大片段在后，以两个片段大小记录；每一个青花菜品种的DNA指纹数据X/Y或X/Y依次按引物BoGMS0501、BoE718、BoGMS0941、BoE723的引物顺序排列；
在所述步骤(5)青花菜品种基本商品信息数据的采集中每一个青花菜品种所采集的基本商品信息数据包括作物种类、品种植物学类型、品种繁殖类型、品种名称；
步骤(6)青花菜品种DNA分子标签制作是将同一青花菜品种在步骤(4)获得的DNA指纹数据和在步骤(5)所采集的基本商品信息数据输入二维码生成器生成二维码图形即为青花菜品种DNA分子身份证。
2.根据权利要求1所述的一种建立云粳系列水稻品种DNA分子身份证的方法，其特征在于：步骤(5)青花菜品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括品种登记年份。
3.根据权利要求1所述的一种建立云粳系列水稻品种DNA分子身份证的方法，其特征在于：步骤(5)青花菜品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括生产经营者名称。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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管俊娇: "利用SSR标记构建青花菜的分子身份证", 中国蔬菜, vol. 12, pages 41 - 42 *

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