CN107058577B - 一种建立云粳系列水稻品种dna分子标签的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种建立云粳系列水稻品种DNA分子标签的方法。该方法提供6对鉴别云粳系列水稻品种的特异性引物，实现了以广泛基因组覆盖度的最少引物鉴定云粳系列水稻品种，能够用最少的引物构建所有云粳系列水稻品种的DNA分子标签，减少了繁复的工作量和高昂的检测成本，能够把云粳系列水稻品种与其它云南高原粳稻品种鉴别开，同时还可以把云粳系列水稻品种一一区分开。该方法将扩增获得的云粳系列水稻品种DNA指纹数据和采集的基本商品信息数字化编码赋值，形成二维码表述，获得云粳系列水稻品种DNA分子标签，达到品种识别及科学的种子管理的唯一性、可识别性、可追溯性，标识于商品种子包装上，用于水稻优良品种种子的防伪和溯源。

Description

一种建立云粳系列水稻品种DNA分子标签的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种云粳系列水稻品种DNA分子标签的建立，应用于品种分子鉴定及品种管理。
背景技术
云南得天独厚的自然环境为形成丰富的稻作资源创造了条件，同时多样的民族文化又不断促进着稻作资源的丰富和发展，使云南成为中国栽培稻的遗传多样性中心，是同时拥有全国3种野生稻资源的两个省份之一。丰富的水稻资源选育出大量的优质、高产、抗逆品种，这些品种具有丰富的多样性和高原特色。
云粳系列水稻品种是由云南省农业科学院粳稻育种创新团队选育的一系列高产、优质的水稻品种。云粳系列水稻品种(系)具有“高产、优质、抗病、抗倒伏”的特点，在云南省及周边省份大面积推广应用，但随着品种数目的急剧增多，种子市场中的“多、乱、杂”现象和“品种同质化”现象并存，“同种异名”“同名异种”“假冒套牌”等现象屡禁不止，制假、售假事件时有发生，使国家和农民利益受到很大的损害，给品种管理和产权保护带来诸多困难。要解决这一问题，需建立起一种简便、快速、准确的品种识别及科学的种子管理方法。品种识别及科学的种子管理需要达到唯一性、可识别(鉴别)性、可追溯性的要求。
品种DNA分子标签即品种DNA身份信息标签，通过品种分子指纹描述，将指纹信息转化为代码信息标注在种子标签上，可作为品种特异识别的一个标准，是品种数字化管理的核心技术之一。
发明内容
为了能够准确、快速、方便地识别云粳系列品种，本发明提供一种建立云粳系列水稻品种DNA分子标签的方法。
本发明的技术方案如下：
1.一种建立云粳系列水稻品种DNA分子标签的方法，包括(1)云粳系列水稻品种基因组DNA提取、(2)PCR扩增、(3)PCR产物的毛细管电泳荧光检测、(4)DNA指纹数据的获得、(5)云粳系列水稻品种基本商品信息数据的采集、(6)云粳系列水稻品种DNA分子标签制作步骤，其特征在于：
在所述(2)PCR扩增中每一个云粳系列水稻品种提取的基因组DNA，分别用引物RM8277，RM551，RM190，RM336，RM219和RM432进行扩增，所述引物RM8277由RM8277正向引物和RM8277反向引物组成，所述的RM8277正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，RM8277反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物RM551由RM551正向引物和RM551反向引物组成，所述RM551正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，RM551反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；所述引物RM190由RM190正向引物和RM190反向引物组成，所述RM190正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，RM190反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；所述引物RM336由RM336正向引物和RM336反向引物组成，所述RM336正向引物的碱基序列如SEQID NO：7所示，RM336反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；所述引物RM219由RM219正向引物和RM219反向引物组成，所述RM219正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：9所示，RM219反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：10所示；所述引物RM432由RM432正向引物和RM432反向引物组成，所述RM432正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：11所示，RM432反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：12所示；
在所述(4)DNA指纹数据的获得中每一个云粳系列水稻品种的DNA指纹数据的获得是根据毛细管荧光电泳读出的该云粳系列水稻品种6个位点的等位变异片段大小数据，纯合位点的等位变异记录为X/X，以X/X的形式表示其DNA指纹数据，杂合位点的等位变异记录为X/Y，以X/Y的形式表示其DNA指纹数据，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小数据，小片段在前，大片段在后，以两个片段大小记录；每一个云粳系列水稻品种的DNA指纹数据X/Y或X/Y依次按引物RM8277、引物RM551、引物RM190、引物RM336、引物RM219、引顺RM432的引物顺序排列；
在所述(5)云粳系列水稻品种基本商品信息数据的采集中每一个云粳系列水稻品种所采集的基本商品信息数据包括作物种类、品种植物学类型、品种繁殖类型、品种名称、单元识别代码、审定区域和审定的年份，所述的单元识别代码是用1、2、3……自然数中的任意数表示，且不同的云粳系列水稻品种的单元识别代码均不相同；
所述(6)云粳系列水稻品种DNA分子标签制作是将同一云粳系列水稻品种在步骤(4)获得的DNA指纹数据和在步骤(5)所采集的基本商品信息数据输入二维码生成器生成二维码图形即为云粳系列水稻品种DNA分子标签。
2.根据技术方案1所述的一种建立云粳系列水稻品种DNA分子标签的方法，其特征在于：在步骤(5)云粳系列水稻品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括生产经营者名称。
3.根据技术方案2所述的一种建立云粳系列水稻品种DNA分子标签的方法，其特征在于：在步骤(5)云粳系列水稻品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括追溯网址。
4.根据技术方案1或2或3所述的一种建立云粳系列水稻品种DNA分子标签的方法构建的云粳系列水稻品种DNA分子标签。
与现有技术相比，本发明的有益效益：
1、本发明提出了6对鉴别云粳系列水稻品种的特异性引物，实现了以广泛基因组覆盖度的最少引物鉴定云粳系列水稻品种。能够用最少的引物构建所有云粳系列水稻品种的DNA分子标签，减少了繁复的工作量和高昂的检测成本，能够把云粳系列水稻品种与其它云南高原粳稻品种鉴别开，同时还可以把云粳系列水稻品种一一区分开。
2、本发明实现了云粳系列水稻品种和其种子的双重防伪，达到品种识别及科学的种子管理的唯一性、可识别(鉴别)性、可追溯性,标识于商品种子包装上，用于水稻优良品种种子的防伪和溯源,实现了云粳系列水稻品种的DNA分子标签真实性鉴别。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是RM8277正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是RM8277反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：3所示的是RM551正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：4所示的是RM551反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：5所示的是RM190正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：6所示的是RM190反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：7所示的是RM336正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：8所示的是RM336反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：9所示的是RM219正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：10所示的是RM219反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：11所示的是RM432正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：12所示的是RM432反向引物的碱基序列。
附图说明
图1是实施例1中采用本发明方法对云粳系列水稻品种云粳26号品种构建的DNA分子标签。
具体实施方式
术语：
追溯网址：是指云粳系列水稻品种的生产经营者的网址。
本发明针对云粳系列水稻品种，选取多态性高、区分度好、数据容易统计、扩增重复性好、引物位点在染色体上均匀分布的SSR引物作为核心引物。采用20个不同遗传背景的云南水稻品种对325对水稻SSR引物进行筛选，筛选出48对多态性高、区分度好、数据容易统计、扩增重复性好、引物位点在染色体上均匀分布的SSR引物。48对引物对200个云南水稻品种进行扩增检测，得到DNA指纹图谱，通过数据分析确定24对核心引物就可鉴别该200个品种。再对35个云粳系列水稻品种的指纹图谱进行分析，最后确定6对引物作为核心引物鉴别云粳系列水稻品种，DNA指纹数据以6个位点的等位变异片段大小数据表示，DNA指纹数据通过毛细管荧光电泳读取。
表1用于构建云粳系列水稻品种DNA分子标签的引物信息
Figure BDA0001308907890000041
Figure BDA0001308907890000051
实例1建立云粳系列水稻品种云粳26号(滇审稻2010003号)品种DNA分子标签的方法
(1)云粳系列水稻品种基因组DNA提取：
取云粳26号水稻叶片约200-300mg置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨。每管加入700μL经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴60min并2-3颠倒混匀。每管加入等体积的三氯甲烷和异戊醇混合液，三氯甲烷：异戊醇的体积比为24：1，充分混合后静置10min，在12,000rpm离心15min。吸取上清液转移至一新管，加入等体积0℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min后在4℃、12,000rpm离心10min，弃上清液，加入70％v/v乙醇，旋转2-3次后弃去乙醇溶液，并倒立于垫有滤纸的实验台上，室温放置10min以上。加入100μL超纯水或100μL TE缓冲液，充分溶解后得基因组DNA，备用。
CTAB提取液：81.7g氯化钠和20.0g CTAB溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris-HCl 100mL，0.5mol/L EDTA 40mL，定容至1000mL，4℃贮存。
(2)PCR扩增
取步骤(1)获得的基因组DNA样品进行扩增，PCR扩增反应体系为：10μL的反应体积，其中1μL 10×PCR反应缓冲液、0.6μL 25mmol/L MgCl2、0.8μL2.5mmol/L dNTP溶液、1μL5μmol/L正向引物，1μL 5μmol/L反向引物(各引物对合成时用荧光基团修饰)，0.25μL 2U/μL Taq DNA聚合酶，4.35μL超纯水，1μL样品DNA。
PCR扩增的反应程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
分别采用引物RM8277、引物RM551、引物RM190、引物RM336、引物RM219、引物RM432进行扩增，所述引物RM8277由RM8277正向引物和RM8277反向引物组成，所述RM8277正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，RM8277反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物RM551由RM551正向引物和RM551反向引物组成，所述RM551正向引物的碱基序列如SEQID NO：3所示，RM551反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；所述引物RM190由RM190正向引物和RM190反向引物组成，所述RM190正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，RM190反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；所述引物RM336由RM336正向引物和RM336反向引物组成，所述引物RM336正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，引物RM336反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；所述引物RM219由RM219正向引物和RM219反向引物组成，所述RM219正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：9所示，RM219反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：10所示；所述引物RM432由RM432正向引物和RM432反向引物组成，所述RM432正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：11所示，RM432反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：12所示；
(3)PCR产物的毛细管电泳荧光检测
将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，分别从中吸取1μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将深孔板在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时1000rpm离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳。对采集的数据采用GeneMapperV3.2数据分析软件进行分析。读出每个位点每份样品的等位变异大小数据。
(4)DNA指纹数据的获得
每一个云粳系列水稻品种的DNA指纹数据的获得是根据毛细管荧光电泳读出的该云粳系列水稻品种在6个位点上的等位变异片段大小数据，纯合位点的等位变异记录为X/X，以X/X的形式表示其DNA指纹数据，杂合位点的等位变异记录为X/Y，以X/Y的形式表示其DNA指纹数据，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小数据，小片段在前，大片段在后，以两个片段大小记录；每一个云粳系列水稻品种的DNA指纹数据X/Y或X/Y依次按引物RM8277、引物RM551、引物RM190、引物RM336、引物RM219、引物RM432依次排列。
云粳26号在6个位点上的扩增片段大小(bp)分别为(按引物顺序排列)：
212/212、187/187、121/121、166/166、204/204、181/181，即为云粳26号的DNA指纹数据：212/212、187/187、121/121、166/166、204/204、181/181。
分子标记数据为可替换或扩展项，有多态性更好的位点可以替换或补充。
(5)云粳系列水稻品种基本商品信息数据的采集
云粳26号品种的基本商品信息数据如下：
作物种类：水稻
品种植物学类型：粳稻
品种繁殖类型：常规种
品种名称：云粳26号
单元识别代码：1
审定区域和审定的年份：云南，2010年
生产经营者名称：云南省农业科学院粮食作物研究所
追溯网址：http://www.ynifc.org/
(6)云粳系列水稻品种DNA分子标签制作
将步骤(4)获得的云粳26号的DNA指纹数据和步骤(5)采集的云粳26号品种的基本商品信息数据输入微微二维码生成器生成二维码图形即为云粳26号品种DNA分子标签，如图1所示。该分子标签实现了使用者用普通设备(手机)快速识别种子真伪。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所
<120> 一种建立云粳系列水稻品种DNA分子标签的方法
<130> /
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM8277正向引物
<400> 1
agcacaagta ggtgcatttc 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM8277反向引物
<400> 2
atttgcctgt gatgtaatag c 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM551正向引物
<400> 3
agcccagact agcatgattg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM551反向引物
<400> 4
gaaggcgaga aggatcacag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM190正向引物
<400> 5
ctttgtctat ctcaagacac 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM190反向引物
<400> 6
ttgcagatgt tcttcctgat g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM336正向引物
<400> 7
cttacagaga aacggcatcg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM336反向引物
<400> 8
gctggtttgt ttcaggttcg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM219正向引物
<400> 9
cgtcggatga tgtaaagcct 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM219反向引物
<400> 10
catatcggca ttcgcctg 18
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM432正向引物
<400> 11
ttctgtctca cgctggattg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> RM432反向引物
<400> 12
agctgcgtac gtgatgaatg 20

Claims (1)

1.一种建立云粳系列水稻品种DNA分子标签的方法，包括(1)云粳系列水稻品种基因组DNA提取、(2)PCR扩增、(3)PCR产物的毛细管电泳荧光检测、(4)DNA指纹数据的获得、(5)云粳系列水稻品种基本商品信息数据的采集、(6)云粳系列水稻品种DNA分子标签制作步骤，其特征在于：
在所述(2)PCR扩增中每一个云粳系列水稻品种提取的基因组DNA，分别用引物RM8277，RM551，RM190，RM336，RM219和RM432进行扩增，所述引物RM8277由RM8277正向引物和RM8277反向引物组成，所述的RM8277正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，RM8277反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物RM551由RM551正向引物和RM551反向引物组成，所述RM551正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，RM551反向引物的碱基序列如SEQ IDNO：4所示；所述引物RM190由RM190正向引物和RM190反向引物组成，所述RM190正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，RM190反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；所述引物RM336由RM336正向引物和RM336反向引物组成，所述RM336正向引物的碱基序列如SEQ IDNO：7所示，RM336反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；所述引物RM219由RM219正向引物和RM219反向引物组成，所述RM219正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：9所示，RM219反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：10所示；所述引物RM432由RM432正向引物和RM432反向引物组成，所述RM432正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：11所示，RM432反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：12所示；
在所述(4)DNA指纹数据的获得中每一个云粳系列水稻品种的DNA指纹数据的获得是根据毛细管荧光电泳读出的该云粳系列水稻品种6个位点的等位变异片段大小数据，纯合位点的等位变异记录为X/X，以X/X的形式表示其DNA指纹数据，杂合位点的等位变异记录为X/Y，以X/Y的形式表示其DNA指纹数据，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小数据，小片段在前，大片段在后，以两个片段大小记录；每一个云粳系列水稻品种的DNA指纹数据X/Y或X/Y依次按引物RM8277、引物RM551、引物RM190、引物RM336、引物RM219、引物 RM432的引物顺序排列；
在所述(5)云粳系列水稻品种基本商品信息数据的采集中每一个云粳系列水稻品种所采集的基本商品信息数据包括作物种类、品种植物学类型、品种繁殖类型、品种名称、单元识别代码、审定区域和审定的年份，所述的单元识别代码是用非零自然数中的任意数表示，且不同的云粳系列水稻品种的单元识别代码均不相同；
所述(6)云粳系列水稻品种DNA分子标签制作是将同一云粳系列水稻品种在步骤(4)获得的DNA指纹数据和在步骤(5)所采集的基本商品信息数据输入二维码生成器生成二维码图形即为云粳系列水稻品种DNA分子标签；
在步骤(5)云粳系列水稻品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括生产经营者名称；
在步骤(5)云粳系列水稻品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括追溯网址。
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