CN110283930B

CN110283930B - 6个怀远石榴优良品种的ssr指纹图谱及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN110283930B
Application number: CN201910631034.3A
Authority: CN
Inventors: 徐义流; 秦改花; 刘春燕; 黎积誉; 高正辉; 齐永杰; 潘海发; 伊兴凯; 张晓玲
Original assignee: Institute of Gardening of Anhui Academy Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Gardening of Anhui Academy Agricultural Sciences
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2039-07-12
Also published as: CN110283930A

Abstract

本发明公开6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱，6个怀远石榴优良品种分别为：白玉石籽、大笨子、红粉皮、红玉石籽、玛瑙籽、晶花玉石籽；SSR指纹图谱是基于8对SSR引物构建的指纹图谱，8对SSR引物分别为：PG080、PG130、PG139、PG152、PG098、PG077、PG090、PG093，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1‑16所示，构建的6个品种的SSR指纹图谱特征如表1所示。本发明还公开了其构建方法及其应用。本发明为6个石榴品种的真伪鉴定、育种利用和新品种权利保护提供了理论依据。

Description

6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱及其构建方法与应用。

背景技术

石榴是古老的保健水果，果实富含花青苷、黄酮、安石榴苷等多酚类物质，特别是安石榴苷等鞣花单宁类物质临床医用和保健价值高，具有潜在的抗氧化、抗癌、抗菌等功能，被誉为超级水果，被划为国家规划特色经济林树种之一。据记载，石榴在我国已有2000多年的栽培历史，在长期的栽培过程中，形成了众多具有地方特色的优良石榴品种。安徽怀远是我国四大传统石榴产区之一，玉石籽、玛瑙籽等优良品种闻名遐迩。怀远石榴籽粒晶莹剔透、风味醇厚，深受消费者青睐。

石榴是多年生果树，对石榴优良品种的保存主要采取无性繁殖的方法。由于石榴独特的经济、生态效应，近年来石榴产业快速发展，在我国果树产业结构调整中发挥了重要的作用。石榴在不同地域间引种和品种交换频繁，常常导致品种混杂，同物异名或同名异物现象严重，对石榴品种资源的保存、鉴定与利用都十分不利，对杂交育种中亲本的选配及系谱分析也有不利影响。生产中，品种纯正是保证高效栽培的条件。因此明确品种的指纹图谱，对石榴资源的保存、鉴定及利用均有重要的现实意义。分子标记可以直接检测不同品种或个体在DNA分子水平上的差异，具有较高的多态性和个体特异性，且不受环境和生长阶段影响，能鉴定形态标记所难以鉴定的个体。因此，开发可靠的分子标记并构建石榴指纹图谱，对石榴快速鉴定具有重要意义。

白玉石籽、大笨子、红粉皮、红玉石籽、玛瑙籽、晶花玉石籽是安徽怀远的6个优良的主栽石榴品种，由于其性状优良，商品价值高，在苗木生产、果品销售以及引种过程中常有以次充好现象存在，因此建立这6个优良石榴品种的指纹图谱，对科学合理利用这些品种具有重要的意义。

发明内容

本发明第一方面提供了6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱，6个怀远石榴优良品种分别为：白玉石籽、大笨子、红粉皮、红玉石籽、玛瑙籽、晶花玉石籽；

SSR指纹图谱是基于8对SSR引物构建的指纹图谱，8对SSR引物分别为：PG080、PG130、PG139、PG152、PG098、PG077、PG090、PG093，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO.1-16所示；

利用该8对引物构建的6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱特征如表1所示：

表1 6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱

本发明第二方面提供了上述6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

(1)采用CTAB法提取DNA，加入50μL 0.1M的TE缓冲液，溶解过夜，-20℃保存备用；

(2)采用8对引物，以提取DNA为模版，进行PCR扩增，PCR扩增采用20μL的反应体系，含1.0ng DNA，0.4μM正向引物，0.4μM反向引物，4mM MgCl₂，400μM dNTPs，1.0U Taq-DNA酶，加ddH₂0至总体积20μL，PCR采用touchdown反应，反应条件如下：5min，95℃；接下来11个循环，每个循环后退火温度下降0.8℃{30s，95℃；30s，65℃；50s，72℃}；22个循环{30s，95℃；30s，55℃；50s，72℃}；最后72℃延伸8min；

(3)PCR产物用毛细管电泳确定片断大小，毛细管电泳按照以下步骤进行，将6-FAM或HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，吸取1μL产物加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；板中各孔分别加入0.1μL LIZ 500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺；95℃变性5min，于4℃冷却10min；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行自动荧光检测；

(4)使用Genemapper软件分析SSR扩增数据，利用SSR毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值；纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异，小片段在前，大片段在后。

本发明第三方面提供了6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱在石榴品种鉴定方面的应用。

本发明的有益效果：

1、本发明利用8对重复性好、多态性丰富的SSR核心引物，构建了6个怀远石榴优良品种8对核心引物的DNA指纹图谱。该指纹图谱与常规形态学检测相比，具有检测时间短、准确性高、可靠、便捷、重复性好的优点。本发明为6个石榴品种的真伪鉴定、育种利用和新品种权利保护提供了理论依据。

2、指纹图谱稳定，不受环境影响，进行品种鉴定时可取叶、花、果实、芽等组织或器官，苗木、多年生植株、果实均可取样，不受季节限制。本发明可以直接用于生产实践，对石榴品种鉴定具有十分重要的意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

实施例1

用于6个怀远石榴优良品种SSR指纹图谱构建的引物对获取：

(1)石榴全基因组数据从DDBJ/ENA/GenBank数据库下载，序列号MTKT00000000。利用MISA(MIcroSAtellites identificationtool，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)软件在全基因组范围内挖掘不同重复单元SSR位点，SSR查找的标准为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸的重复次数分别为11、8、6、5、4。

(2)SSR引物设计

上述获得的SSR位点，在每个染色体上随机选择5对，利用重复序列两端的保守侧翼序列，用Primer 3.0设计引物，引物设计的条件是：PCR产物长度为100～350bp；退火温度(Tm)为50～70℃，保证两引物间Tm值相差不超过4℃；GC％含量为40～65％；引物长度为18～28bp；引物5’端最好是G/C，3’端避免出现A。为了保证引物的特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20～23个碱基。成功设计出45对引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(3)引物筛选

采用合成的45对引物，以上述6个怀远石榴品种(白玉石籽、大笨子、红粉皮、红玉石籽、玛瑙籽、晶花玉石籽)为材料，根据扩增结果，筛选可稳定扩增、带型清晰且多态性丰富的引物8对(表2)用于6个怀远石榴优良品种SSR指纹图谱构建。

表2 8对引物序列

实施例2

6个怀远石榴优良品种SSR指纹图谱的构建：

(1)供试品种基因组DNA提取采用CTAB法。称取0.2～0.3g新鲜的叶片，加入液氮迅速研磨成粉状，将粉末转入2.0mL离心管中；加入1.0mL 65℃预热的3×CTAB提取液65℃水浴1h；室温下12000rpm离心10min；吸取上清液于2.0mL离心管中；加入于上清液等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，V/V/V)，轻轻颠倒混匀成乳浊液；12000r/min离心8min，取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1，V/V)，混匀后12000r/min离心8min；取上清液加入等体积冷冻的异丙醇和10μL 3M醋酸钠，置于-20℃条件下沉淀半个小时；12000r/min离心8min，小心弃上清液，DNA留在离心管中；加入75％的乙醇洗2次，再用无水乙醇洗一次，离心后弃无水乙醇；室温下晾干，加入50μL TE缓冲液(0.1M)，溶解过夜，-20℃保存备用。

(2)采用实施例1的8对引物，以提取DNA为模版，进行PCR扩增，PCR扩增采用20μL的反应体系，含1.0ng DNA，0.4μM正向引物，0.4μM反向引物，4mM MgCl₂，400μM dNTPs，1.0UTaq-DNA酶，加ddH₂0至总体积20μL，PCR采用touchdown反应，反应条件如下：5min，95℃；接下来11个循环，每个循环后退火温度下降0.8℃{30s，95℃；30s，65℃；50s，72℃}；22个循环{30s，95℃；30s，55℃；50s，72℃}；最后72℃延伸8min。

(3)PCR产物用毛细管电泳确定片断大小。毛细管电泳按照以下步骤进行，将6-FAM或HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，吸取1μL产物加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL LIZ 500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。95℃变性5min，于4℃冷却10min。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上(ABI3730XL)进行自动荧光检测。

(4)使用Genemapper软件分析SSR扩增数据，利用SSR毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值。纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异，小片段在前，大片段在后，8个位点的数据整合在一起形成6个怀远石榴品种的SSR指纹图谱。品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数〈3为近似品种。构建的6个石榴品种的SSR指纹图谱如表1所示，6个品种间的差异位点数均≥3。

序列表

<110> 安徽省农业科学院园艺研究所

<120> 6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱及其构建方法与应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> PG080正向引物(人工序列)

<400> 1

ctgactgttg cagagagtag gctg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> PG080反向引物(人工序列)

<400> 2

aggaggtgaa acaacgaata gctg 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> PG130正向引物(人工序列)

<400> 3

ctcatatggc gattctctgt cctt 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> PG130反向引物(人工序列)

<400> 4

aagttcgata aattgcactg gtgg 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> PG139正向引物(人工序列)

<400> 5

gtttccttcc ctcaacccaa aa 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> PG139反向引物(人工序列)

<400> 6

agtgggattt taccaagtcg aaca 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> PG152正向引物(人工序列)

<400> 7

catcagaatc gtccccttgt g 21

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> PG152反向引物(人工序列)

<400> 8

cagagagaag aagagagacc gagc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> PG098正向引物(人工序列)

<400> 9

tgccttctta aggacttcac caac 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> PG098反向引物(人工序列)

<400> 10

ctaacctcat gcacttgtca tcca 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> PG077正向引物(人工序列)

<400> 11

gtcagtctcc tccttcttca atgg 24

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> PG077反向引物(人工序列)

<400> 12

agacgaagca cctgagaagg aat 23

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> PG090正向引物(人工序列)

<400> 13

attcttttat actaaccaaa atttgcga 28

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> PG090反向引物(人工序列)

<400> 14

atgtcatgag aggacccaca aa 22

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> PG093正向引物(人工序列)

<400> 15

cgtcaatagg acgtccctga gata 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> PG093反向引物(人工序列)

<400> 16

gatgacgtgg cagagtaaga gagc 24

Claims

1.用于构建6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱的SSR引物组，其特征是，

所述6个怀远石榴优良品种分别为：白玉石籽、大笨子、红粉皮、红玉石籽、玛瑙籽、晶花玉石籽；

所述SSR引物组为8对SSR引物，分别为：PG080、PG130、PG139、PG152、PG098、PG077、PG090、PG093，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-16所示。

2.利用权利要求1所述的SSR引物组构建6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱的方法，其特征是，包括如下步骤：

（1）采用CTAB法提取DNA，加入50μL 0.1M的TE缓冲液，溶解过夜，-20℃保存备用；

（2）采用8对引物，以提取DNA为模版，进行PCR扩增，PCR扩增采用20μL的反应体系，含1.0ng DNA，0.4μM正向引物，0.4μM反向引物，4mM MgCl₂，400μM dNTPs，1.0U Taq-DNA酶，加ddH₂O至总体积20μL，PCR采用touchdown反应，反应条件如下：5min，95℃；接下来11个循环，每个循环后退火温度下降0.8℃，每个循环程序如下：30s，95℃；30s，65℃；50s，72℃；22个循环，每个循环程序如下：30s，95℃；30s，55℃；50s，72℃；最后72℃延伸8min；

（3）PCR产物用毛细管电泳确定片段大小，毛细管电泳按照以下步骤进行，将6-FAM或HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，吸取1μL产物加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；板中各孔分别加入0.1μL LIZ 500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺；95℃变性5min，于4℃冷却10min；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行自动荧光检测；

（4）使用Genemapper软件分析SSR扩增数据，利用SSR毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值；纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异，小片段在前，大片段在后；

8个位点的数据整合在一起形成6个怀远石榴品种的SSR指纹图谱，品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种；构建的6个石榴品种的SSR指纹图谱如表1所示：

表1 6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱

6个品种间的差异位点数均≥3。

3.权利要求1所述的用于构建6个怀远石榴优良品种的SSR指纹图谱的SSR引物组在石榴品种鉴定方面的应用，其特征是，所述石榴品种为6个怀远石榴优良品种，分别为：白玉石籽、大笨子、红粉皮、红玉石籽、玛瑙籽、晶花玉石籽。