CN110172528B - 一对用于石榴品种鉴定的专用ssr引物及其应用 - Google Patents

一对用于石榴品种鉴定的专用ssr引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一对用于石榴品种鉴定的专用SSR引物PG080，包括正向引物和反向引物，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对PG080多态性高，利用其对22个石榴品种DNA进行扩增，仅HN12可特异性地扩增出159bp的条带，仅SXXA18可特异性地扩增出161bp的条带，仅CY01可特异性地扩增出140bp；还可根据条带大小对AH15、AHHB12、AH20、HN15、HY04、HY16、HY21、SD02、SD08、SD19品种进行区分。

Description

一对用于石榴品种鉴定的专用SSR引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一对用于石榴品种鉴定的专用SSR引物及其应用。
背景技术
石榴是古老的保健水果，果实富含花青苷、黄酮、安石榴苷等多酚类物质，特别是安石榴苷等鞣花单宁类物质临床医用和保健价值高，具有潜在的抗氧化、抗癌、抗菌等功能，被誉为超级水果，被划为国家规划特色经济林树种之一。石榴在中国有2000多年的栽培历史，不同地域间的引种和品种交换频繁，导致了现有品种间混杂，同物异名或同名异物现象非常普遍。品种混杂，不仅给育种亲本选配带来了困难，对生产中大规模引种也造成了严重影响，一定程度上制约了石榴产业的快速健康发展。因此，开发特异性引物进行石榴品种资源的遗传鉴定对科学合理利用石榴资源有着重要的现实意义。
目前，对石榴品种的鉴定主要是通过表型特征，包括树势、叶、花、果实特征等，这些表型特征易受到环境因素影响。分子标记可以直接检测不同品种或个体在DNA分子水平上的差异，具有较高的多态性和个体特异性，且不受环境和生长阶段影响，能鉴定形态标记所难以鉴定的个体。SSR分子标记数量丰富且随机分布于基因组中，具有等位变异高、检测方便等特点，已被苹果、葡萄、水稻等的品种鉴定上。传统上，SSR标记的开发主要是基于基因组DNA文库或者富含特异微卫星的文库，该方法工作量大且得到的标记数量比较有限；本发明是在石榴全基因组中挖掘特异性强、多态性高的SSR用于品种鉴定，结果对石榴资源的科学合理利用具有重要的参考价值。
发明内容
本发明第一方面提供了一对用于石榴品种鉴定的专用SSR引物PG080，包括正向引物和反向引物，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明第二方面提供了上述引物对PG080在石榴育种中的应用。
本方面第三方面提供了上述引物对PG080在石榴品种鉴定中的应用。
本发明第四方面提供了上述引物对PG080在石榴HN12、SXXA18、CY01、AH15、AHHB12、AH20、HN15、HY04、HY16、HY21、SD02、SD08、SD19品种鉴定中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的引物对PG080特异性强，利用其对22个石榴品种DNA进行扩增，仅HN12可特异性地扩增出159bp的条带，仅SXXA18可特异性地扩增出161bp的条带，仅CY01可特异性地扩增出140bp的条带。
2.本发明提供的引物对PG080多态性高，除了可根据特异性条带鉴定品种，还可根据条带大小对AH15、AHHB12、AH20、HN15、HY04、HY16、HY21、SD02、SD08、SD19品种进行区分。
3.利用引物对PG080开展的品种鉴定技术具有取材方便、鉴定技术简便快速、结果高度准确稳定的特点。本方法中可以取幼苗或成年植株的叶、花、果实、芽等组织或器官的基因组DNA进行检测，取样不受季节、地点限制。另外，该技术是利用PCR扩增结果进行毛细管电泳即可判读结果，技术简便快捷。检测结果也高度准确稳定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1
石榴品种鉴定的专用SSR引物对PG080的获得：
(1)石榴全基因组数据从DDBJ/ENA/GenBank数据库下载，序列号MTKT00000000。利用MISA(MIcroSAtellites identificationtool，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)软件在全基因组范围内挖掘不同重复单元SSR位点，SSR查找的标准为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸的重复次数分别为11、8、6、5、4。
(2)SSR引物设计
上述获得的SSR位点，在每个染色体上随机选择5对，利用重复序列两端的保守侧翼序列，用Primer 3.0设计引物，引物设计的条件是：PCR产物长度为100～350bp；退火温度(Tm)为50～70℃，保证两引物间Tm值相差不超过4℃；GC％含量为40～65％；引物长度为18～28bp；引物5’端最好是G/C，3’端避免出现A。为了保证引物的特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20～23个碱基。利用该方法，成功设计出45对引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(3)引物筛选
采用合成的45对引物，对6个不同产地有代表性的石榴品种(AHHB04：安徽淮北、SXXA1：陕西西安、CY01：西藏、XJ02:新疆、HN4:河南、SD47：山东)的基因组DNA进行扩增，根据扩增结果，筛选可稳定扩增、带型清晰且多态性丰富的引物，共11对。
利用上述11对引物对22个品种(表1)进行复筛，筛选出一对多态性高、扩增稳定的引物PG080用于石榴品种鉴定，PG080正向引物核苷酸序列为：ctgactgttgcagagagtaggctg，反向引物核苷酸序列为：aggaggtgaaacaacgaatagctg。
实施例2
引物对PG080在石榴品种鉴定中的应用：
(1)采用CTAB法提取22个不同石榴品种的DNA样品。
称取0.2～0.3g新鲜的叶片，加入液氮迅速研磨成粉状，将粉末转入2.0mL离心管中；加入1.0mL 65℃预热的3×CTAB提取液65℃水浴1h；室温下12000rpm离心10min；吸取上清液于2.0mL离心管中；加入于上清液等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，V/V/V)，轻轻颠倒混匀成乳浊液；12000r/min离心8min，取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1，V/V)，混匀后12000r/min离心8min；取上清液加入等体积冷冻的异丙醇和10μL 3M醋酸钠，置于-20℃条件下沉淀半个小时；12000r/min离心8min，小心弃上清液，DNA留在离心管中；加入75％的乙醇洗2次，再用无水乙醇洗一次，离心后弃无水乙醇；室温下晾干，加入50μL TE缓冲液(0.1M)，溶解过夜，-20℃保存备用。
(2)采用PG080引物对，提取DNA为模版，进行PCR扩增。
PCR扩增采用20μL的反应体系，含1.0ng DNA，0.4μM正向引物，0.4μM反向引物，4mMMgCl2，400μM dNTPs，1.0U Taq-DNA酶，加ddH20至总体积20μL。PCR采用touchdown反应，反应条件如下：5min，95℃；接下来11个循环，每个循环后退火温度下降0.8℃{30s，95℃；30s，65℃；50s，72℃}；22个循环{30s，95℃；30s，55℃；50s，72℃}；最后72℃延伸8min。
(3)PCR产物用毛细管电泳确定片断大小。
毛细管电泳按照以下步骤进行，将6-FAM或HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，吸取1μL产物加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μLLIZ 500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。95℃变性5min，于4℃冷却10min。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上(ABI3730XL)进行自动荧光检测。
(4)使用Genemapper软件分析SSR扩增数据，利用SSR毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值。纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异，小片段在前，大片段在后。
(5)利用引物对PG080扩增22个石榴品种，仅HN12可特异性的扩增出159bp，仅SXXA18可特异性的扩增出161bp的条带，仅CY01可特异性的扩增出140bp的条带，同时根据不同条带的大小，对10个不同品种进行区分，包括：AH15、AHHB12、AH20、HN15、HY04、HY16、HY21、SD02、SD08、SD19。具体扩增结果如表1所示。
表1 PG080对22个石榴品种的扩增结果
品种 品种来源 扩增结果 品种 品种来源 扩增结果
AH10 安徽 157/183 SXXA8 陕西西安 153/157
AH15 安徽 157/157 SXXA18 陕西西安 161/183
AH20 安徽 153/183 AHHB12 安徽淮北 153/153
HN12 河南 159/159 CY01 西藏 140/140
HN15 河南 163/183 AHHB26 安徽淮北 153/157
HY04 安徽怀远 155/183 AHHB42 安徽淮北 153/157
HY16 安徽怀远 183/183 AHHB66 安徽淮北 153/157
HY21 安徽怀远 155/155 HN08 河南 157/183
SD02 山东 157/189 SD05 山东 157/183
SD08 山东 189/189 SXXA12 陕西西安 157/183
SD19 山东 163/163 AH14 安徽 157/183
序列表
<110> 安徽省农业科学院园艺研究所
<120> 一对用于石榴品种鉴定的专用SSR引物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> PG080正向引物(人工序列)
<400> 1
ctgactgttg cagagagtag gctg 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> PG080反向引物(人工序列)
<400> 2
aggaggtgaa acaacgaata gctg 24

Claims (3)

1.一对用于石榴品种鉴定的专用SSR引物PG080，包括正向引物和反向引物，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的一对用于石榴品种鉴定的专用SSR引物PG080在石榴育种中的应用。
3.权利要求1所述的一对用于石榴品种鉴定的专用SSR引物PG080在石榴品种鉴定中的应用。
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