CN104630340A - 利用rapd分子标记技术鉴定石榴芽变品种的方法 - Google Patents

利用rapd分子标记技术鉴定石榴芽变品种的方法 Download PDF

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高正辉
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Abstract

本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是利用RAPD分子标记技术鉴定石榴芽变品种的方法；该RAPD随机引物组由100条引物组成；鉴定步骤包括（1）石榴叶片DNA提取；（2）PCR扩增；（3）电泳检测；（4）数据记录；（5）结果判定。本发明可以在实验室进行，根据RAPD位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术鉴定石榴品种，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。本发明可以用于对供试石榴品种与已知石榴品种进行品种鉴定，或构建石榴品种数据库。该方法为准确鉴定石榴种质资源，尤其是同物异名和同名异物现象奠定了基础，也为新品种保护奠定了基础。

Description

利用RAPD分子标记技术鉴定石榴芽变品种的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是利用RAPD分子标记技术鉴定石榴芽变品种的方法。
背景技术：
品种鉴定是农业生产、作物育种和种子检验上的重要方法，也是保护作物品种、防止假冒伪劣品种进入市场的重要手段。传统的果树品种检验方法有形态学鉴定与同工酶鉴定等，但是，形态学鉴定所需周期长，耗费大量人力、物力和财力。石榴品种的纯正是石榴生产的重要环节。在石榴生产中，各种品种混杂现象严重，同名异物、同物异名现象严重，常规鉴定耗时较长，田间形态学鉴定难度较大，随着分子生物学技术的飞速发展，分子标记技术不断成熟，给果树从品种基因组水平上的鉴定开辟了途径。
发明内容：
为实现上述石榴品种鉴定中出现的问题，本发明的目的在于，利用RAPD分子标记技术鉴定石榴芽变品种的方法，该方法利用分子标记技术，在营养生长期实现石榴品鉴定，具有周期短，成本低，结果可靠，节约人力、物力及土地资源，大大提高了品种鉴定的准确性。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：利用随机引物组，该RAPD随机引物组的序列如下：
表1 S系列随机引物
本发明的另一个目的是提供利用RAPD分子标记技术鉴定石榴芽变品种的方法，包括如下步骤：
(1)提取各样品石榴种质DNA；
(2)利用选择的100条RAPD随机引物，扩增石榴的基因组DNA；
(3)电泳检测每个样品的扩增条带；
(4)记录每个样品每对引物的DNA扩增带型；
(5)根据DNA扩增带型区分鉴定石榴品种；
进一步，所述步骤（2）94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环40次；最后在72 ℃延伸6 min。
进一步，所述步骤（2）中PCR扩增体系包括：dNTP（10 mmol/L） 0.5μL，引物（10μmol/L）1 μL，10×Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L） 2.5μL，TaqDNA聚合酶（5.0 u/μL）1 μL，模板DNA（约25 ng/μL）1 μL，剩余体积用ddH2O来补齐。
进一步，所述步骤(5)结果判定时，如果两个品种在两个或两个以上RAPD标记位点具有不同条带，则判定为不同品种。
本发明的有益技术效果是：可以在实验室进行，根据RAPD位点的多态性，利用PCR扩增和电泳技术鉴定石榴品种，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。
附图说明：
图1本发明方法不同模板与引物RAPD-PCR扩增效果。
图2利用随机引物S88检测不同品种电泳结果图
图3利用随机引物S167检测不同品种电泳结果图
图4利用本发明方法产生的不同品种聚类分析树形图。
图5利用随机引物S93检测不同品种电泳结果图。
图6利用随机引物S169检测不同品种电泳结果图。
具体实施方式：
下面结合具体实施实例对本发明做进一步的说明：
实施实例
材料与方法
供试材料均采自安徽省水果产业技术体系蚌埠市水果综合试验站石榴品种园。收集蚌埠市怀远县栽培的石榴主要品种。其中包括大笨子及其芽变新品种（‘73-06’）。对各品种编号标记见表1。
表2 石榴品种名称、编号
石榴DNA的提取：（1）选取幼嫩叶片，称取适量倒入研钵中，加入液氮，迅速研磨至粉末状，将研磨后的粉末装入2.0 ml离心管中；（2）加入提取缓冲液Ⅰ800-1000 μL（18.6 g葡萄糖，6.0 gPVP，240 μL β-巯基乙醇，加水至300 ml），充分混匀，室温下8000 r/min离心10 min，弃上层液；（3）加入等体积60 ℃保温的CTAB提取缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L偏重亚硫酸钠，1% β-巯基乙醇现用现加）充分混匀，置60 ℃水浴锅中保温30-40 min，期间轻缓颠倒混匀数次；（4）水浴结束后，加入等体积氯仿：异戊醇：酚（25:24:1）溶液抽提蛋白质，轻缓颠倒混匀，静置10 min后，室温下10000 r/min离心10 min，吸取上清液；（5）再重复上述步骤1-2次，以确保蛋白质等杂质抽提干净；（6）加入2/3体积预冷的异丙醇，轻缓颠倒混匀，室温下放置30 min以上，10000 r/min离心10 min；（7）去上清液后分别用70 %乙醇和无水乙醇各洗涤1次，加入400 μL TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。
RAPD引物筛选：试验采用10个碱基的随机引物，在S系列的100个随机引物中进行筛选（见表1）。
RAPD反应体系:在RAPD反应体系中，Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、模板DNA浓度、引物浓度、变性温度、退火温度、延伸温度及时间均能影响RAPD扩增的效果和稳定性。石榴RAPD反应体系参考热娜·卡司木等[66]方法进行，即试验采用25μL反应体系：dNTP（10 mmol/L） 0.5μL，引物（10μmol/L）1 μL，10×Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L） 2.5μL，TaqDNA聚合酶（5.0 u/μL）1 μL，模板DNA（约25 ng/μL）1 μL，剩余体积用ddH2O来补齐。PCR热循环参数为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环40次；最后在72 ℃延伸6 min。
数据记录与分析：将所有扩增出的条带进行0-1编码，即有带为1，无带为0。采用欧氏距离平方系数和组间连接法，应用SPSS 18.0 for Windows 软件进行聚类分析。欧氏距离平方系数公式中，表示样本第i个遗传标记位点的值，在0-1编码中就是0或1，表示样本第i个遗传标记位点的值，表示样品与样品之间的欧氏距离平方系数，欧氏距离平方系数的值越小表示亲缘关系越近，值越大表示亲缘关系越远。
结果与分析
随机引物的筛选：引物不同直接影响RAPD结果，有的引物扩增条带清晰，易于编码分析；有的引物扩增条带中暗带多，不易分辨其有无；有的引物无扩增结果，所以必须对引物进行筛选，选取条带清晰，分辨率高，重复性好的引物进行RAPD分析。
试验采用10个碱基的随机引物，在S系列的100个引物中进行筛选。通过对100个随机引物的扩增筛选，选出的23个扩增结果稳定且谱带清晰的引物（表3）对10个石榴生物型进行了PCR扩增（图1），所有样品每个引物至少重复扩增1次以上，以肯定重现性。由图1可以看出，在相同的扩增条件下，不同引物扩增结果明显不同，呈现多态性，在条带的位置和条带的亮度、宽度、多少等方面都存在一定的差异。
表3 筛选出的随机引物
石榴种质资源的RAPD指纹图谱：RAPD分析充分表明了石榴种质资源的遗传多样性，从筛选的23对引物中共扩增出177条带，其中多态性带为91条，多态性带比率达到51%，平均每个引物扩增出的条带数为在7-8之间，最少的扩增出4条，最多的扩增出12条，所有的条带集中在200-2000 bp之间，平均每个引物扩增出4条多态性带，具有丰富的遗传多样性。
在筛选的23对引物中，其中引物S88在约700 bp、2000 bp处，只有玉石籽产生特异性条带（图2），其余品种均没有出现条带；对于引物S167在约550 bp处，只有青皮产生特异性条带（图3）；在约800 bp只有玉石籽和白玉石籽产生条带（图3）；对于引物S169在约200 bp处，只有大笨子和红粉皮产生了条带；对于引物S173在约1600 bp处，只有红粉皮产生特异性条带，剩余品种没有出现条带；对于引物S326在约580 bp处，只有红玛瑙籽和红粉皮产生条带，剩余品种没有出现条带，在约1600 bp处，只有‘73-06’、云南甜石榴和白玉石籽产生条带，剩余品种没有出现条带；对于引物S324在约600 bp处，只有红玛瑙籽、红粉皮和云南甜石榴产生条带，剩余品种没有出现条带；对于引物S7在约400 bp处，只有薄皮糙、大笨子和云南甜石榴产生条带，剩余品种没有出现条带；对于引物S92在约300 bp处，只有青皮和云南甜石榴产生条带，剩余品种没有出现条带；在约900 bp处，只有青皮、酸绿籽、云南甜石榴条带，剩余品种没有出现条带。
综合以上分析，利用8条引物（S7、S92、S88、S167、 S169、S173、S326、S324）即可将全部品种内区分开来。
聚类分析：对电泳后的条带进行统计，利用SPSS统计软件进行聚类分析，有条带编为“1”，无条带编为“0”，最后进行聚类，得出系统树状图（图4）。基于RAPD生成的石榴种质资源系统树状图（图4），在欧式距离平方系数阈值为29.33-32.533时，所有品种聚为5大类，第1大类共3个品种，由薄皮糙、大笨子和‘73-06’混合组成；第2大类共2个品种，由红玛瑙籽和红粉皮组成；第3大类共3个品种，由青皮、云南甜石榴和酸绿籽组成；第4大类共1个品种，为白玉石籽；第5大类共1个品种，为玉石籽。
营养系品种‘73-06’变异条带分析:通过RAPD分析，“大笨子’与其营养系变异品种‘73-06’在筛选的23个引物中，有13个引物扩增出18条特异性条带，变异位点较多。与‘大笨子’相比，‘73-06’在引物S7扩增图上少1条约400 bp的条带；S20上少2条约500 bp、600 bp的条带；S93上少1条约1200 bp的条带（见图5）；S94上多1条约1100 bp的条带；S163上多1条约500 bp的条带；S167上多1条约600 bp的条带；S169上少1条约200 bp的条带（见图6）；S177上多1条约300 bp的条带；S224上少2条约700 bp、1000 bp的条带；S324上少2条约1000 bp、1200 bp的条带；S326上多1条1600 bp的条带，少1条约2000 bp的条带；S327上多2条约900 bp、1100 bp的条带；S340上多1条约800 bp的条带。
结论
石榴种质资源的亲缘关系分析
基于RAPD标记的石榴种质资源聚类分析表明，在为29.33-32.533时，所有品种聚为5大类，品种之间确有按地域聚类的趋势。而大笨子与其营养系变异‘73-06’在欧式距离平方系数阈值21.00即可归为一类。RAPD聚类分析认为，大笨子与其营养系变异‘73-06’归为一类，他们之间的遗传距离短，具有很近的亲缘关系。
“大笨子”营养系品种‘73-06’变异条带分析
应用RAPD分子标记技术，“大笨子”与其营养系变异品种‘73-06’在筛选的23个引物中，有13条引物扩增出18条特异性条带；‘73-06’较“大笨子”在DNA水平上出现了较大范围的变异。
序列表
 
[0001]
      <110>安徽省农业科学院园艺研究所
<120>利用RAPD分子标记技术鉴定石榴芽变品种的方法与应用
<130>权利要求书，说明书
<160>23
<170>PatentIn version 3.5
 
<210>1
<211>10
<212>DNA
<213>引物S5
<400>1
TGCGCCCTTC
 
 
<210>2
<211>10
<212>DNA
<213>引物S7
<400>2
GGTGACGCAG
 
<210>3
<211>10
<212>DNA
<213>引物S10
<400>3
CTGCTGGGAC
 
<210>4
<211>10
<212>DNA
<213>引物S20
<400>4
GGACCCTTAC
 
 
 
<210>5
<211>10
<212>DNA
<213>引物S88
<400>5
TCACGTCCAC
 
 
<210>6
<211>10
<212>DNA
<213>引物S92
<400>6
CAGCTCACGA
 
 
<210>7
<211>10
<212>DNA
<213>引物S93
<400>7
CTCTCCGCCA
 
 
 
<210>8
<211>10
<212>DNA
<213>引物S94
<400>8
GGATGAGACC
 
 
<210>9
<211>10
<212>DNA
<213>引物S99
<400>9
GTCAGGGCAA
 
 
 
<210>10
<211>10
<212>DNA
<213>引物S163
<400>10
CAGAAGCCCA
 
 
<210>11
<211>10
<212>DNA
<213>引物S167
<400>11
CAGCGACAAG
 
<210>12
<211>10
<212>DNA
<213>引物S169
<400>12
TGGAGAGCAG
 
 
<210>13
<211>10
<212>DNA
<213>引物S173
<400>13
CTGGGGCTGA
 
 
<210>14
<211>10
<212>DNA
<213>引物S177
<400>14
GGTGGTGATG
 
 
 
<210>15
<211>10
<212>DNA
<213>引物S324
<400>15
AGGCTGTGCT
 
 
<210>16
<211>10
<212>DNA
<213>引物S326
<400>16
GTGCCGTTCA
 
 
<210>17
<211>10
<212>DNA
<213>引物S327
<400>17
CCAGGAGGAC
 
 
<210>18
<211>10
<212>DNA
<213>引物S328
<400>18
GGGTGGGTAA
 
 
<210>19
<211>10
<212>DNA
<213>引物S329
<400>19
CACCCCAGTC
 
 
 
<210>20
<211>10
<212>DNA
<213>引物S330
<400>20
CCGACAAACC
 
 
<210>21
<211>10
<212>DNA
<213>引物S337
<400>21
CCTTCCCACT
 
 
<210>22
<211>10
<212>DNA
<213>引物S339
<400>22
GTGCGAGCAA
 
 
<210>23
<211>10
<212>DNA
<213>引物S340
<400>23
ACTTTGGCGG
 
 

Claims (3)

1.利用RAPD分子标记技术鉴定石榴芽变品种的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)提取各样品石榴种质DNA；
(2)利用设计100条随机引物，扩增石榴的基因组DNA；
(3)电泳检测每个样品的扩增条带；
(4)记录每个样品每条引物的DNA扩增带型；
(5)根据DNA扩增带型区分鉴定石榴品种；
所述的100条对随机RAPD引物序列如下：
其特征是，所述步骤（2）中PCR热循环参数为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环40次；最后在72 ℃延伸6 min。
2.所述利用RAPD随机引物鉴定石榴品种的方法，其特征是，所述步骤（2）中PCR扩增体系采用25μL反应体系：dNTP（10 mmol/L） 0.5μL，引物（10μmol/L）1 μL，10×Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L） 2.5μL，TaqDNA聚合酶（5.0 u/μL）1 μL，模板DNA（约25 ng/μL）1 μL，剩余体积用ddH2O来补齐。
3.根据权利要求1所述利用RAPD随机引物鉴定石榴品种的方法，其特征是所述步骤(5)结果判定时，如果两个品种在两个或两个以上RAPD标记位点具有不同条带，则判定为不同品种。
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