CN110205403B - 一对高多态性石榴ssr引物及其应用 - Google Patents

一对高多态性石榴ssr引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一对高多态性石榴SSR引物PG098，包括正向引物和反向引物，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对PG098多态性高，利用其对22个石榴品种DNA进行扩增，仅SXXA1可特异性的扩增出215bp的条带；还可根据条带大小对AHHB24、HN06、HN11、HN13、HY04、HY05、HY25、SD20、SD27、SD57、SXXA09、SXXA16、SD16、SD59品种进行区分。

Description

一对高多态性石榴SSR引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一对高多态性石榴SSR引物及其应用。
背景技术
石榴是古老的保健水果，果实富含花青苷、黄酮、安石榴苷等多酚类物质，特别是安石榴苷等鞣花单宁类物质临床医用和保健价值高，具有潜在的抗氧化、抗癌、抗菌等功能，被誉为超级水果，被划为国家规划特色经济林树种之一。石榴在中国有2000多年的栽培历史，不同地域间的引种和品种交换频繁，导致了现有品种间混杂，同物异名或同名异物现象非常普遍。品种混杂，不仅给育种亲本选配带来了困难，对生产中大规模引种也造成了严重影响，一定程度上制约了石榴产业的快速健康发展，因此，开展石榴品种鉴定是生产中需要解决的重要课题。
目前，对石榴品种的鉴定主要是通过表型特征，包括树势、叶、花、果实等特征，这些表型特征易受到环境因素影响。分子标记可以直接检测不同品种或个体在DNA分子水平上的差异，具有较高的多态性和个体特异性，且不受环境和生长阶段影响，能鉴定形态标记所难以鉴定的个体。SSR分子标记数量丰富且随机均匀分布于基因组中，呈共显性，等位变异高，检测方便，已应用于苹果、葡萄、水稻等品种鉴定中应用。石榴中开发特异性强、多态性高、能稳定鉴定石榴品种的SSR引物对科学合理利用石榴品种具有重要的意义。
发明内容
本发明第一方面提供了一对高多态性石榴SSR引物PG098，包括正向引物和反向引物，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明第二方面提供了上述引物对PG098在石榴育种中的应用。
本发明第三方面提供了上述引物对PG098在石榴品种鉴定中的应用。
本发明第四方面提供了上述引物对PG098在石榴SXXA1、AHHB24、HN06、HN11、HN13、HY04、HY05、HY25、SD20、SD27、SD57、SXXA09、SXXA16、SD16、SD59品种鉴定中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明提供的引物对PG098特异性强，利用其对22个石榴品种DNA进行扩增，仅SXXA1可特异性的扩增出215bp的条带。
2.本发明提供的引物对PG098多态性高，除了可根据特异性条带鉴定SXXA1品种，还可根据条带大小对AHHB24、HN06、HN11、HN13、HY04、HY05、HY25、SD20、SD27、SD57、SXXA09、SXXA16、SD16、SD59品种进行区分。
3.利用引物对PG098开展的品种鉴定技术具有取材方便、鉴定技术简便快速、结果高度准确稳定的特点。本方法可取叶、花、果实、芽等组织或器官，苗木或多年生植株均可取样，不受季节、地点限制。该技术是利用PCR扩增结果进行毛细管电泳即可判读结果。检测结果也高度准确稳定。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1
用于石榴品种鉴定的SSR引物对PG098的获得：
(1)石榴全基因组数据从DDBJ/ENA/GenBank数据库下载，序列号MTKT00000000。利用MISA(MIcroSAtellites identificationtool，http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)软件在全基因组范围内挖掘不同重复单元SSR位点，SSR查找的标准为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸的重复次数分别为11、8、6、5、4。
(2)SSR引物设计
上述获得的SSR位点，在每个染色体上随机选择5对，利用重复序列两端的保守侧翼序列，用Primer 3.0设计引物，引物设计的条件是：PCR产物长度为100～350bp；退火温度(Tm)为50～70℃，保证两引物间Tm值相差不超过4℃；GC％含量为40～65％；引物长度为18～28bp；引物5’端最好是G/C，3’端避免出现A。为了保证引物的特异性，用于设计引物的保守侧翼序列与微卫星位点至少间隔20～23个碱基。利用该方法，成功设计出45对引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(3)引物筛选
采用合成的45对引物，对6个不同产地有代表性的石榴品种(AHHB04：安徽淮北、SXXA1：陕西西安、CY01：西藏、XJ02:新疆、HN4:河南、SD47：山东)的基因组DNA进行扩增，根据扩增结果，筛选可稳定扩增、带型清晰且多态性丰富的引物，共11对。
利用上述11对引物对22个品种(表1)进行复筛，筛选出一对多态性高、扩增稳定的引物PG098用于石榴品种鉴定，PG098正向引物核苷酸序列为：tgccttcttaaggacttcaccaac，反向引物核苷酸序列为：ctaacctcatgcacttgtcatcca。
实施例2
引物对PG098在石榴品种鉴定中的应用：
(1)采用CTAB法提取22个不同石榴品种的DNA样品。
称取0.2～0.3g新鲜的叶片，加入液氮迅速研磨成粉状，将粉末转入2.0mL离心管中；加入1.0mL 65℃预热的3×CTAB提取液65℃水浴1h；室温下12000rpm离心10min；吸取上清液于2.0mL离心管中；加入于上清液等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1，V/V/V)，轻轻颠倒混匀成乳浊液；12000r/min离心8min，取上清液，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1，V/V)，混匀后12000r/min离心8min；取上清液加入等体积冷冻的异丙醇和10μL 3M醋酸钠，置于-20℃条件下沉淀半个小时；12000r/min离心8min，小心弃上清液，DNA留在离心管中；加入75％的乙醇洗2次，再用无水乙醇洗一次，离心后弃无水乙醇；室温下晾干，加入50μL TE缓冲液(0.1M)，溶解过夜,-20℃保存备用。
(2)采用PG098引物对，提取DNA为模版，进行PCR扩增。PCR扩增采用20μL的反应体系，含1.0ng DNA，0.4μM正向引物，0.4μM反向引物，4mM MgCl2，400μM dNTPs，1.0U Taq-DNA酶，加ddH20至总体积20μL。PCR采用touchdown反应，反应条件如下：5min，95℃；接下来11个循环，每个循环后退火温度下降0.8℃{30s，95℃；30s，65℃；50s，72℃}；22个循环{30s，95℃；30s，55℃；50s，72℃}；最后72℃延伸8min。
(3)PCR产物用毛细管电泳确定片断大小。毛细管电泳按照以下步骤进行，将6-FAM或HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，吸取1μL产物加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL LIZ 500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。95℃变性5min，于4℃冷却10min。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上(ABI3730XL)进行自动荧光检测。
(4)使用Genemapper软件分析SSR扩增数据，利用SSR毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值。纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异，小片段在前，大片段在后。
(5)利用引物对PG098扩增22个石榴品种，仅SXXA1可特异性的扩增出215bp，同时根据不同条带的大小，对14个不同品种进行区分，包括：AHHB24、HN06、HN11、HN13、HY04、HY05、HY25、SD20、SD27、SD57、SXXA09、SXXA16、SD16、SD59。具体扩增结果如表1所示。
表1 PG098对22个石榴品种的扩增结果
品种 来源 扩增结果 品种 来源 扩增结果
AHHB13 安徽淮北 229/229 HY25 安徽怀远 231/233
AHHB24 安徽淮北 213/213 SD20 山东 227/227
AHHB45 安徽淮北 213/229 SD27 山东 217/229
HN06 河南 227/229 SD57 山东 227/231
HN11 河南 217/217 SXXA09 陕西西安 217/231
HN13 河南 213/217 SXXA1 陕西西安 215/229
HY02 安徽怀远 229/229 SXXA16 陕西西安 231/231
HY04 安徽怀远 233/233 SD16 山东 213/231
HY05 安徽怀远 229/233 SD52 山东 213/229
HN23 河南 213/229 HY14 安徽怀远 229/229
HS01 安徽黄山 213/229 SD59 山东 229/231
序列表
<110> 安徽省农业科学院园艺研究所
<120> 一对高多态性石榴SSR引物及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> PG098正向引物(人工序列)
<400> 1
tgccttctta aggacttcac caac 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> PG098反向引物(人工序列)
<400> 2
ctaacctcat gcacttgtca tcca 24

Claims (3)

1.一对高多态性石榴SSR引物PG098，包括正向引物和反向引物，正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的一对高多态性石榴SSR引物PG098在石榴育种中的应用。
3.权利要求1所述的一对高多态性石榴SSR引物PG098在石榴品种鉴定中的应用。
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