CN110819734A - 苹果树腐烂菌lamp扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了苹果树腐烂病菌LAMP扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒。所公开的引物是针对苹果树腐烂病菌属保守的EF‑1a基因，优选了目的基因片段来设计特异性引物，使得该引物能有效检测苹果树腐烂病菌属，而且特异性好。所公开的试剂盒包括研磨液管、RNA酶液管、核酸提取液A管、核酸提取液B管、核酸提取液C管、LAMP反应液管、Bst DNA聚合酶管、显色剂管、阳性对照核酸管、阴性对照管和矿物油管。本发明的试剂盒及相应检测方法不仅实现了苹果树腐烂病菌的通用检测，而且成本低、灵敏性高、操作简单，同时可实现现场快速检测。

Description

苹果树腐烂菌LAMP扩增引物及苹果树腐烂病检测试剂盒

技术领域

本发明属于植物病菌检测技术领域，具体涉及一种苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的检测方法及所用的核酸等温扩增检测试剂盒。

背景技术

苹果是闻名世界的四大水果之一，也是我国出口创汇较多水果品种之一。由于苹果生态适应性强、营养价值高、供应周期长等优点，已经被世界上众多的国家列为其主要的消费果品。我国苹果栽培面积、总产量、人均占有量与出口量均居世界第一，是全球最大的苹果生产和消费国。2016年全国苹果种植面积为246.69万公顷，总产量为4388万吨，苹果产业已经成为我国北方农村经济发展的重要支柱产业，其发展对于我国经济和农民的增收起至关重要作用。然而，由于黑腐皮壳属真菌Valsa mali导致的苹果树腐烂病一直威胁我国苹果产业的安全。该病不仅造成苹果产量和品质的下降，也是造成树死和园毁的主要原因。同时，我国目前每年约有10％的苹果树需要更新换代，苹果树种苗中携带腐烂病菌时有发生。因此，开发苹果树腐烂病菌早期快速检测技术，为田间精准防治及阻断带菌种苗的传播提供技术支持，从而避免因苹果腐烂病导致的死树、减产等生产问题。

随着分子生物学技术的不断发展，应用PCR、血清免疫学等技术对病原菌进行特异和快速分子检测的成功例子已越来越多，但这些分子生物学技术在一定程度上也存在了一些不足之处。如血清免疫学检测技术在血清的制备过程耗时耗力，常常受到抗血清质量的影响，且可能存在交叉反应，特异性较差，容易造成假阳性；PCR快速检测技术主要包括常规PCR、巢式PCR(Nest-PCR)和实时荧光定量PCR等，PCR技术检测时间较长，需要依靠PCR仪、凝胶成像系统等贵重仪器设备，对于承担大量检测任务的植物检疫部门和条件简陋的基层农技部门来说，这些分子检测方法的实用性受到限制。因此，在生产中，亟需开发一些新型的、快速、简便、可靠且低成本的检测手段。

发明内容

针对现有技术存在的问题或缺陷，本发明的目的之一是提供一种苹果树腐烂病菌LAMP扩增引物。

基于此，本发明提供的苹果树腐烂病菌LAMP扩增引物有正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物Loop F和反向环引物Loop B组成，各引物序列如下：

进一步，本发明还提供了一种苹果树腐烂病菌检测用试剂盒。

本发明所提供的苹果树腐烂病菌检测用试剂盒内装有：研磨液管：内装研磨液；RNA酶液管：内装RNase溶液；核酸提取液A管：内装乙酸钠溶液；核酸提取液B管：内装异丙醇溶液；核酸提取液C管：内装乙醇溶液；LAMP反应液管：内装内装含有本发明所述引物的LAMP反应液；Bst DNA聚合酶管：内装Bst DNA聚合酶；显色剂管：内装核酸染料SYBR Green I；阳性对照核酸管：内装苹果树腐烂病菌阳性DNA；阴性对照管：内装无菌水和矿物油管：内装矿物油。

优选的，本发明研磨液的组分包括Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS和PVP。更优选的，各组分浓度为Tris-HCl：100mM，NaCl：1M,EDTA：50mM，SDS的质量百分比浓度为2％，PVP的质量百分比浓度为2％；研磨液的pH为8.5。

优选的，本发明的LAMP反应液包括权利要求1所述引物组合物、dNTPs、betaine、Tris-HCl、KCl、(NH4)₂SO₄、MgSO₄和Tween-20。

本发明的有益效果：

本发明是根据苹果树腐烂病菌的保守序列EF-1a基因片段设计特异性LAMP检测引物，因而使检测完全具有了LAMP技术灵敏、快速、简便、准确的特点；

本发明试剂盒中汇集了检测所需的研磨液，核酸提取液等多种试剂及器材，使得苹果树腐烂病菌田间检测能有序进行，实现了检测过程的现场化，程序化和标准化，使得操作规范，不易出错；其中，矿物油能消除多次检测过程中的核酸污染，并能有效防止开盖检测带来的假阳性风险，解决了限制LAMP技术广泛应用的易于被污染干扰的问题；

使用本发明的试剂盒及检测方法在2小时内就可完成苹果树腐烂病菌的检测，检测过程中无需昂贵的仪器设备如PCR仪和凝胶成像系统，仅需水浴锅或金属浴和普通离心机；而且检测结果易于判别；

与已有的检测技术相比，本发明的试剂盒及相应检测方法不仅实现了苹果树腐烂病菌的通用检测，而且成本低、灵敏性高、操作简单，同时可实现现场快速检测，可以替代以前苹果树腐烂病菌的相关检测方法如生理生化法、传统的病原菌形态学鉴定及PCR法等。

附图说明

图1是本发明苹果树腐烂病菌的LAMP特异性检测。图中1-45为苹果树腐烂病菌，46-51分别为赤霉菌、苹果炭疽菌、番茄灰霉菌、番茄叶霉菌、葡萄灰霉菌、苹果轮纹病菌；NC为阴性对照；CK+为阳性对照；

图2是本发明苹果树腐烂病菌的LAMP灵敏性与普通PCR灵敏相对比；图中1-8模板DNA浓度分别为100,10,1,10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5ng/μl；NC为阴性对照；M为DNA marker；其中LAMP检测结果1-7显示为绿色的阳性结果；

图3是本发明检测方法对接种离体枝条发病组织检测结果，与巢式PCR检测结果对比，其中1-3为健康枝条检测结果，4-6为发病枝条检测结果；NC为阴性对照；CK+为阳性对照；M为DNA marker；

图4是本发明检测方法对洛川及扶风采集的田间样品检测结果。其中1-30为扶风田间样品检测结果，31-45为洛川样品检测结果；NC为阴性对照；CK+为阳性对照。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明的引物是针对苹果树腐烂病菌属保守的EF-1a基因，优选了目的基因片段来设计特异性引物，使得该引物能有效检测苹果树腐烂病菌属，而且特异性好；本发明的苹果树腐烂病菌的LAMP引物组合物有正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP，正向环引物LF和反向环引物LB组成，各引物序列如下表1所示。

表1

进一步采用苹果树腐烂病菌环介导等温扩增(LAMP)检测本发明引物的特异性：以表2中供试菌株的DNA为模板，利用本发明的特异性引物进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25μL体系，LAMP反应条件：65℃温育45min，85℃温育5min；其中苹果树腐烂病菌阳性DNA的获得方式为：采用CTAB法或商品化试剂盒法提取苹果树腐烂病菌基因组DNA。

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定。待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR green Ⅰ 1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色(橘黄色)判断为阴性，不存在苹果树腐烂病菌。

结果表明，供试菌株中只有苹果树腐烂病菌显色结果可观察到绿色荧光，其余真菌显色结果为橙色(附图1)，说明所设计的检测引物可以将苹果树腐烂病菌与其他病原菌区分开来，具有高特异性，可用于苹果树腐烂病菌快速检测和鉴定。

表2

本发明试剂盒中阳性对照核酸管内装的苹果树腐烂病菌阳性DNA可通过在苹果树腐烂病菌提取获得。试剂盒中的研磨液进行样品DNA提取，使得样品DNA提取过程方便快捷；本发明的研磨液可使用DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen,Germany)等类似商品植物DNA提取试剂盒，还可使用本发明体用的研磨液。矿物油来消除LAMP扩增产物的污染，避免了因LAMP产物扩增量大，造成的假阳性结果出现，同时避免了开盖检测对实验室造成的污染。本发明试剂盒中所用试剂可选用市售产品。

利用本发明的试剂盒进行苹果树腐烂病菌的检测方法包括下列步骤：

(1)取待测样品组织(树皮)0.1g置于离心管中，加入300μL研磨液，用研磨棒充分研磨至浆状；

(2)向上述研磨后的离心管中加入300μL 65℃左右预热的研磨液，并加入RNA酶液管中的20μL RNase，于65℃水浴锅中孵育15min；

(3)向孵育后的离心管中加入160μL核酸提取液A溶液后，以15000×g离心8min，取上清液置于新离心管2；

(4)向离心管2中加入等体积的核酸提取液B溶液，静置10min后，以8900×g离心10min，弃去上清液，保留沉淀物；

(5)用核酸提取液C溶液，洗涤上述步骤(4)所得沉淀物，以5700×g离心2min，弃去上清液，保留沉淀物；

(6)重复步骤(5)一次；

(7)将上述步骤(6)所得沉淀物于室温晾干，加入50μL无菌水溶解沉淀物，得到核酸样品；

(8)分别将上述核酸样品、阴性对照管内的双蒸水、阳性对照管内的阳性对照核酸1μL，加至23μL LAMP反应液中，再分别加入1μL Bst DNA聚合酶，分别得到检测管、阴性对照管和阳性对照管；

(9)向上述配置好的反应管中分别加入25μL的矿物油；

(10)将所有反应管于65℃保温45min后，于85℃保温5min完成LAMP反应；

(11)LAMP反应结束后，加入1μL 1000×SYBR Green I，如果检测管内反应产物的颜色与阴性对照管反应产物颜色均呈橙色，同时阳性对照管反应产物呈绿色，则待测品苹果树腐烂病菌检测结果为阴性；如果检测管内LAMP反应产物的颜色与阳性对照管反应产物均呈绿色，同时阴性对照管反应产物呈橙色(或橘黄色)，则待测品苹果树腐烂病菌检测结果为阳性。

以下结合具体实施实例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：

该实施例为采用本发明的特异性引物，分别进行苹果树腐烂病菌环介导等温扩增(LAMP)检测与普通PCR检测，并对比两者结构的灵敏性。具体操作如下：

用无菌水对苹果树腐烂病菌(表2中菌株名称03-8)基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用；其中苹果树腐烂病菌阳性DNA的获得方式为：采用CTAB法或商品化试剂盒法提取苹果树腐烂病菌基因组DNA。

以不同浓度的苹果树腐烂病菌基因组DNA为模板，利用本发明特异性引物进行LAMP检测，LAMP检测反应体系为25μL，LAMP反应条件：65℃温育60min，85℃温育5min；

普通PCR检测以本发明提供的F3和B3为引物(表1)进行检测，普通PCR检测体系为10μL其中包括5μL 2×Taq master mix、3μL超纯水，F3和B3引物各0.5μL，模板DNA 1μL；普通PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性30s，50℃退火35s，72℃延伸90s,36cycles；72℃ 5min，4℃保存。PCR结果经琼脂糖凝胶电泳检测。

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色(或橘黄色)判断为阴性。结果表明，100,10,1,10^-1,10^-2,10^-3,10^-4ng/μl浓度的苹果树腐烂病菌基因组DNA显色结果可观察到绿色荧光；其余浓度及阴性对照显色结果为橙色。

PCR检测结果显示100,10,1,10^-1,10^-2ng/μl浓度的苹果树腐烂病菌基因组DNA时有明显条带可以观察到，10^-3ng/μl浓度的苹果树腐烂菌病基因组DNA时有微弱条带可以看到，但不明显；以上结果说明所设计的LAMP引物的检测灵敏度可达10^-4ng/μl(附图2)，LAMP检测灵敏性比普通PCR检测灵敏性至少高10倍。

实施例2：

该实施例为一种具体的试剂盒，该试剂盒内装有以下试剂管：

研磨液管：内装研磨液，该研磨液是由100mM Tris-HCl,pH 8.5,1M NaCl,50mMEDTA,2％SDS,2％PVP组成；

RNA酶液管：内装RNase溶液

核酸提取液A管：内装5M pH5.3的乙酸钠溶液；

核酸提取液B管：内装异丙醇溶液；

核酸提取液C管：内装质量浓度75％的乙醇溶液；

LAMP反应液管：内装LAMP反应液，LAMP反应液由以下组分组成：LAMP外引物F3和B3各0.2μM,内引物FIP和BIP各1.6μM，环引物LF和LB各0.4μM,0.6mM dNTPs,1.0M betaine,20mM Tris-HCl(pH 8.8),50mM KCl,10mM(NH₄)₂SO₄,3mM MgSO₄,0.1％Tween-20；其余为双蒸水；其中LAMP引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB由上海生工生物工程有限责任公司合成；

Bst DNA聚合酶管：内装Bst DNA聚合酶；

显色剂管：内装核酸染料SYBR Green I；

阳性对照核酸管：内装苹果树腐烂病病菌阳性DNA(由表2菌株03-8提取)；

阴性对照管：内装灭菌的双蒸水；

矿物油管：内装矿物油；

试剂盒中的EDTA Tris-HCl,NaCl,SDS,PVP,dNTPs,betaine,KCl,(NH₄)₂SO₄,MgSO₄,购自上海生工生物工程有限责任公司，Tween-20购自Sigma公司，Bst DNA聚合酶购自NEB公司，SYBR Green I购自Thermos Fisher公司。

实施例3：

该实施例为分别采用本发明的试剂盒和巢式PCR检测对接种离体枝条发病组织的苹果树腐烂病菌进行检测：

由实验室接种病原菌于离体枝条3d后，产生明显发病症状组织作为检测样品。

采用本发明的试剂盒对植物组织DNA进行提取，并进行后续检测；

LAMP扩增检测：以提取的DNA为模板，特异性引物进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25μL；LAMP反应条件：65℃温育60min，85℃温育5min；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR green Ⅰ 1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色(或橘黄色)判断为阴性。

巢式PCR参考已发表文献(Rui Zang,Zhengli Li,Xiwang Ke,Xiaojie Wang,Zhiyuan Yin,Zhensheng Kang and Lili Huang.A Nested PCR Assay for DetectingValsa mali var mali in Different Tissues of Apple Trees.Plant Dis)中的引物(表3所示)进行测试：

表3

结果如图3所示，表明发病组织样品经本发明试剂盒检测的显色结果可观察到绿色荧光，说明存在苹果树腐烂病菌；而健康组织及阴性对照显色结果为橙色，说明不存在苹果树腐烂病菌，同时巢式PCR检测结果与LAMP检测结果相符，LAMP检测技术能用于植物组织中苹果树腐烂病菌的快速分子检测。

实施例4：

该实施例是采用本发明的试剂盒对洛川及扶风采集的田间样品的苹果树腐烂病菌进行检测

采用本发明的试剂盒对分别对田间样品组织DNA进行提取，并进行后续检测；

LAMP扩增检测：以提取的DNA为模板，特异性引物进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25μL；LAMP反应条件：65℃温育60min，85℃温育5min；

反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法进行测定，待LAMP反应结束后，在LAMP反应的扩增产物中加入显色剂SYBR greenⅠ1.0μL，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，橙色(或橘黄色)判断为阴性。

图4所示结果表明扶风采集样品，显色结果可观察到绿色荧光，说明存在苹果树腐烂病菌，且平均带菌率为60％；洛川采集样品，显色结果可观察到绿色荧光，说明存在苹果树腐烂病菌，且平均带菌率为87％。

以上所述仅为本发明的较佳实例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (5)

1.苹果树腐烂病菌LAMP扩增引物，其特征在于，所述引物有正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物Loop F和反向环引物Loop B组成，各引物序列为：

2.苹果树腐烂病菌检测用试剂盒，其特征在于，该试剂盒内装有：

研磨液管：内装研磨液；

RNA酶液管：内装RNase溶液；

核酸提取液A管：内装乙酸钠溶液；

核酸提取液B管：内装异丙醇溶液；

核酸提取液C管：内装乙醇溶液；

LAMP反应液管：内装含有权利要求1所述引物的LAMP反应液；

Bst DNA聚合酶管：内装Bst DNA聚合酶；

显色剂管：内装核酸染料SYBR Green I；

阳性对照核酸管：内装苹果树腐烂病菌阳性DNA；

阴性对照管：内装无菌水；

矿物油管：内装矿物油。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述研磨液由Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS和PVP配置而成。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，各组分浓度为Tris-HCl：100mM，NaCl：1M,EDTA：50mM，SDS的质量百分比浓度为2％，PVP的质量百分比浓度为2％；研磨液的pH为8.5。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液包括权利要求1所述引物组合物、dNTPs、betaine、Tris-HCl、KCl、(NH4)₂SO₄、MgSO₄和Tween-20。

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