CN113897456B

CN113897456B - 四种杉木炭疽病病原菌的实时荧光pcr检测引物探针组合、检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113897456B
Application number: CN202111417224.9A
Authority: CN
Inventors: 黄麟; 何姣; 王俊伟; 李建伟
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2041-11-25
Also published as: CN113897456A

Abstract

本发明公开了四种杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合、检测试剂盒及其应用，属于植物保护和质检领域。本发明针对高度保守的APMAT基因的转录间隔区域设计了杉木炭疽病四种病原菌荧光的实时荧光PCR检测引物探针组合，包括胶孢炭疽菌、果生炭疽菌、暹罗炭疽菌以及温州炭疽菌，采用该引物探针组合及含引物探针组合的检测试剂盒能准确、快速、方便的判别炭疽病样本，判断病木中是否含有杉木上述四种炭疽病病原菌，灵敏度达1ng模板DNA。本发明提供的杉木炭疽病病原菌引物探针组合、含有该引物探针组合的检测试剂盒为杉木炭疽病病原菌的检测提供了快速、灵敏、特异的方法。

Description

四种杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于植物保护和质检领域，更具体地说，涉及四种杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合、检测试剂盒及其应用。

背景技术

杉木[Cunninghamia lanceolata(Lamb.)Hook]是中国特有的用材树种，广泛分布于长江流域，具有很高的经济价值。但由于其栽培品种单一，经营管理模式固定，地力衰退的等问题，导致了部分主要栽培区的杉木病虫害严重发生。杉木炭疽病连年发生，是杉木上最主要的生物灾害之一。杉木炭疽病病原种类多样，目前的研究发现其病原菌种类主要有果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)、温州炭疽菌(C.wenzhouense)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporiordes)、和暹罗炭疽菌(C.siamense)。该病主要危害杉木叶片和枝条，轻则造成杉木枝条长势衰弱；重则可能导致整片杉木林死亡。研究发现我国很多杉木自然分布区和栽培地都发生了严重的炭疽病，对杉木生长种植造成了巨大的危害，严重威胁我国林业的健康发展。

炭疽菌(Colletotrichum)在植物病原真菌中占有重要的地位，可危害多种植物，在全球范围内均普遍发生，由于其对农林经济重大的破坏性和其珍贵的科学研究价值，炭疽属真菌也被列为全世界最重要的十大植物病原真菌之一，其分类问题一直是该类真菌研究的热点之一。早期炭疽菌的分类主要依赖于其危害寄主种类，但此分类方式导致许多同物异名的问题。1980年Sutton在前人的研究基础上，以纯培养条件下的菌落特征，包括分生孢子、附着胞、产孢细胞、产孢梗的形态、颜色、大小等特征，并结合寄主范围来进行炭疽菌分类。虽然这些形态特征差异可解决部分炭疽菌的分类鉴定，但后来的研究发现部分形态特征会随环境和培养条件的不同而变化，以及不同种类炭疽菌形态重叠等现象，都给该类真菌种水平的准确鉴定带来困难，单纯的依靠菌株形态学特征并不能有效地对炭疽菌属的真菌种类进行准确的分类与鉴定。

随着分子生物学的快速发展，通过分子生物学方法进行真菌的分类鉴定也应用的越来越广泛。早期的炭疽菌的分子鉴定主要依赖于真菌的ITS(rDNA转录间隔区)，后来的研究发现，ITS序列分析在炭疽菌分类研究中存在很大的局限性，对很多近缘种不能有效地区分。目前更多的研究认为多个基因序列串联分析是炭疽菌分子鉴定的可靠手段。主要用来进行炭疽分子鉴定的基因有ITS(rDNA转录间隔区)、TUB2(微管蛋白)、ACT(肌动蛋白)、CHS-1(几丁质合成酶)、CAL(钙调蛋白)、GS(谷氨酰胺合成酶)、GAPDH(甘油醛3磷酸脱氢酶)和APMAT。但是多基因序列串联同样也存在应用成本高，耗时长，操作难，依赖于Genbank等数据库近缘种同源序列积累等问题，难于推广应用。

开展杉木炭疽菌的分子检测技术，特别是准确、快速、易于掌握的检测技术，对快速、有效鉴定该病病原菌以及控制该病的蔓延和扩散具有重要意义。随着分子生物学技术的发展，普通PCR、实时荧光PCR、巢式PCR等分子检测方法已成功应用于炭疽菌的检测。但是PCR方法所需仪器设备较多，样品处理复杂，实验环节偏多，容易带入人为误差，且耗时长和污染环境。环介导等温扩增(LAMP)技术引物设计复杂，该方法中使用染色剂种类会对灵敏度和稳定性产生明显影响，难以满足生产应用需要。另外，重组酶介导等温扩增(RPA)作为一种新的等温核酸扩增技术，具有检测引物长，单个样本检测成本高等不足。实时荧光PCR具有高特异性、高灵敏度、结果稳定等优势，被广泛用于有害生物的分子鉴定与快速诊断。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供四种杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合。本发明所要解决的另一技术问题在于提供含有杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合的检测试剂盒。本发明所要解决的最后一技术问题在于提供前述杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合及检测试剂盒的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

四种杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合，所述引物的核苷酸序列为：

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)

正向引物(F)：5′-AGCAGCGTCGATGAGGTAG-3′，

反向引物(R)：5′-TCGCAGTCGGTAGGTGTAAC-3′；

探针的核苷酸序列为：5′-CCGAGAGCGACGACACCATCAGCG-3′，其在5′端修饰有荧光基团、3′端修饰有荧光猝灭基团的物质。

果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)

正向引物(F)：5′-CCATCTATTCCAGCCCGATACC-3′，

反向引物(R)：5′-CAGTGGCGAAGAGCAACATG-3′；

探针的核苷酸序列为：5′-CCGCCGTGAGGACCATTGATTCGCC-3′，其在5′端修饰有荧光基团、3′端修饰有荧光猝灭基团的物质。

暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)

正向引物(F)：5′-CGCTGCCAGACGACCTAAC-3′，

反向引物(R)：5′-CGAAGACAGCCGCCAAAG-3′；

探针的核苷酸序列为：5′-AGGCTCCTCTGGTCGCTAATGCTGC-3′，其在5′端修饰有荧光基团、3′端修饰有荧光猝灭基团的物质。

温州炭疽菌(Colletotrichum wenzhouense)

正向引物(F)：5′-ACACCTACGGACTGCGACAA-3′，

反向引物(R)：5′-GGACACGCTGACTGGATACAGA-3′；

探针的核苷酸序列为：5′-TGCATCAGCCACGACATGGAACCGA-3′，其在5′端修饰有荧光基团、3′端修饰有荧光猝灭基团的物质。

优选地，所述荧光基团为FAM、SYBR、Green I、JOE、VIC、NED、CY-3、TExAS Red或CY-5；所述荧光猝灭基团为TAMRA或BHQ1。

一种杉木炭疽病病原菌检测试剂盒，含有所述的杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合。

优选地，所述杉木炭疽病病原菌检测试剂盒还包括：Pro Taq HS Probe Premix、ROX Reference Dye、CM液体培养基、CTAB溶液和CIA溶液[氯仿：异戊醇(24：1)]。

优选地，所述杉木炭疽病病原菌检测试剂盒还包括：胶孢炭疽菌、果生炭疽菌、暹罗炭疽菌、温州炭疽菌DNA模板和希金斯炭疽菌、西瓜炭疽菌、喀斯特炭疽菌、轮纹镰刀菌的对照DNA模板。

所述的杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合或所述的杉木炭疽病病原菌检测试剂盒在检测杉木炭疽病病原菌胶孢炭疽菌、果生炭疽菌、暹罗炭疽菌或温州炭疽菌中的应用。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明针对不同物种中高度保守的APMAT基因的内含子区域设计了四种杉木炭疽病病原菌荧光的实时荧光PCR检测引物探针组合，采用该引物探针组合能准确、快速、方便的判别炭疽病样本，判断病木中是否含有杉木炭疽病病原菌胶孢炭疽菌、果生炭疽菌、暹罗炭疽菌以及温州炭疽菌，灵敏度达1ng模板DNA。该方法能克服形态学鉴定中不同杉木炭疽病病原菌形态特征不稳定、形态鉴定困难等因素；同时也能克服传统上利用杉木炭疽病病原菌的ITS设计引物PCR检测，可能造成由于引物、探针的过度保守而出现的检测特异性不足的问题；同时还克服了由传统PCR检测手段带来的操作复杂、技术性强、耗时长、造成环境污染等方面的不足的问题。

附图说明

图1：A为利用引物对1#C-F/R和探针1#C-P检测胶孢炭疽菌结果图；B为利用引物对MQ-F/R和探针MQ-P检测果生炭疽菌结果图；C为利用引物对YK-F/R和探针YK-P检测暹罗炭疽菌结果图；D为利用引物对WZ-F/R和探针WZ-P检测温州炭疽菌结果图；

图2：A为利用引物对1#C-F/R和探针1#C-P灵敏度检测胶孢炭疽菌结果图，其中，100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng分别表示不同浓度的胶孢炭疽菌提纯DNA；NTC表示空白对照。B为利用引物对MQ-F/R和探针MQ-P灵敏度检测果生炭疽菌结果图，其中，100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng分别表示不同浓度的果生炭疽菌提纯DNA；NTC表示空白对照。C为利用引物对YK-F/R和探针YK-P灵敏度检测暹罗炭疽菌结果图，其中，100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng分别表示不同浓度的暹罗炭疽菌提纯DNA；NTC表示空白对照。D为利用引物对WZ-F/R和探针WZ-P灵敏度检测温州炭疽菌结果图，其中，100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng分别表示不同浓度的温州炭疽菌提纯DNA；NTC表示空白对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1：引物和探针的设计

根据引物AM-F(5′-TCATTCTACGTATGTGCCCGCCCGTTG-3′)和AM-R(5′-CCAGAAATACACCGAACTTGCAAAGAT-3′)，并用该引物对胶孢炭疽菌的基因组DNA进行扩增，获得APMAT基因序列如SEQ ID NO.3所示：

以APMAT基因为靶标设计用于实时荧光PCR的引物对1#C-F(5′-AGCAGCGTCGATGAGGTAG-3′)/1#C-R(5′-TCGCAGTCGGTAGGTGTAAC-3′)和探针1#C-P(5′-FAM-CCGAGAGCGACGACACCATCAGCG-TAMRA-3′)。

将以上引物对和探针用于杉木胶孢炭疽菌的实时荧光PCR检测。

根据引物AM-F(5′-TCATTCTACGTATGTGCCCGCCCGTTG-3′)和AM-R(5′-CCAGAAATACACCGAACTTGCAAAGAT-3′)，并用该引物对果生炭疽菌的基因组DNA进行扩增，获得APMAT基因序列如SEQ ID NO.4所示：

以APMAT基因为靶标设计用于实时荧光PCR的引物对MQ-F(5′-CCATCTATTCCAGCCCGATACC-3′)/MQ-R(5′-CAGTGGCGAAGAGCAACATG-3′)和探针MQ-P(5′-FAM-CCGCCGTGAGGACCATTGATTCGCC-TAMRA-3′)。

将以上引物对和探针用于果生炭疽菌的实时荧光PCR检测。

根据引物AM-F(5′-TCATTCTACGTATGTGCCCGCCCGTTG-3′)和AM-R(5′-CCAGAAATACACCGAACTTGCAAAGAT-3′)，并用该引物对暹罗炭疽菌的基因组DNA进行扩增，获得APMAT基因序列如SEQ ID NO.5所示：

以APMAT基因为靶标设计用于实时荧光PCR的引物对YK-F(5′-CGCTGCCAGACGACCTAA-3′)/YK-R(5′-CGAAGACAGCCGCCAAAG-3′)和探针YK-P(5′-FAM-AGGCTCCTCTGGTCGCTAATGCTGC-TAMRA-3′)。

将以上引物对和探针用于杉木暹罗炭疽菌的实时荧光PCR检测。

根据引物AM-F(5′-TCATTCTACGTATGTGCCCGCCCGTTG-3′)和AM-R(5′-CCAGAAATACACCGAACTTGCAAAGAT-3′)，并用该引物对温州炭疽菌的基因组DNA进行扩增，获得APMAT基因序列如SEQ ID NO.6所示：

以APMAT基因为靶标设计用于实时荧光PCR的引物对WZ-F(5′-ACACCTACGGACTGCGACAA-3′)/WZ-R(5′-GGACACGCTGACTGGATACAGA-3′)和探针WZ-P(5′-FAM-TGCATCAGCCACGACATGGAACCGA-TAMRA-3′)。

将以上引物对和探针用于杉木温州炭疽菌的实时荧光PCR检测。

实施例2：胶孢炭疽菌、果生炭疽菌、暹罗炭疽菌和温州炭疽菌的检测

1、菌株DNA提取

分别从培养了5天的供试菌株(表1)菌落上切取30个大小为1mm²的菌丝块放入装有100mL的CM液体培养基中，在25℃100rpm摇床上摇培24～48h；用两层滤膜过滤，回收菌丝，滤膜吸干水分；将菌丝置于消毒并冷却后的研钵中，加入液氮和适量石英砂，迅速研磨至细粉末状；装适量粉末于2mL离心管中，加入800μLCTAB，震荡混匀，60℃水浴30min，每隔10min震荡一次；加入800μLCIA，置于25℃ 200rpm摇床摇20min；13000rpm离心10min，取800μL上清液到新的2mL离心管中，加入等体积三氯甲烷，混匀；13000rpm离心5min，取上清液800μL，加入等体积CIA，混匀；13000rpm离心5min，取上清液500μL，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃沉降30min；13000rpm离心5min，弃上清液，加入1mL 75％酒精，13000rpm离心5min，弃上清液；待乙醇挥发完后，加入100μL 65℃预热的ddH₂O溶解DNA；调浓度至100ng/μL，取1μL用于实时PCR检测。

2、实时PCR检测

在实时荧光PCR反应管中，加入10μL 2×Pro Taq HS Probe Premix、0.4μL 4μMROX Reference Dye、0.4μL 10μM正向引物(F)、0.4μL 10μM反向引物(R)、0.4μL 0.4μM荧光探针(P)、1μL DNA模板、7.4μL ddH₂O。

将反应混合液置于实时荧光7500PCR仪(Applied Biosystems)反应孔上，按以下程序进行PCR反应：95℃30s，进入循环95℃5s，60℃30s，共32个循环。

3、结果判读

反应结束后，利用引物对1#C-F/R和探针1#C-P检测待测样品产生荧光增长曲线，说明该样品含有胶孢炭疽菌；反之则不含有胶孢炭疽菌。利用引物对MQ-F/R和探针MQ-P检测待测样品产生荧光增长曲线，说明该样品含有果生炭疽菌；反之则不含有果生炭疽菌。利用引物对YK-F/R和探针YK-P检测待测样品产生荧光增长曲线，说明该样品含有暹罗炭疽菌；反之则不含有暹罗炭疽菌。利用引物对WZ-F/R和探针WZ-P检测待测样品产生荧光增长曲线，说明该样品含有温州炭疽菌；反之则不含有温州炭疽菌。编号1～4为胶孢炭疽菌；5～8为果生炭疽菌；9～12为温州炭疽菌；13～15为暹罗炭疽菌；16为喀斯特炭疽菌；17为希金斯炭疽菌；18为西瓜炭疽菌；19为轮纹镰刀菌；本发明方法特异性检测结果见图1A-D。本发明方法灵敏度检测结果见图2A-D。由图1和图2可知，本发明方法特异性好，灵敏度高。

表1供试菌株来源

编号	菌株名称	菌株种类	来源
				1	SMCG1#C	胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides	中国江苏
2	GH7	胶孢炭疽菌C.gloeosporioides	中国安徽
				3	AY22	胶孢炭疽菌C.gloeosporioides	中国安徽
4	AY23	胶孢炭疽菌C.gloeosporioides	中国安徽
				5	MQ11-3	果生炭疽菌C.fructicola	中国福建
6	FJ7-2	果生炭疽菌C.fructicola	中国福建
				7	YX12	果生炭疽菌C.fructicola	中国江苏
8	FJ33-4	果生炭疽菌C.fructicola	中国福建
				9	WZ31	温州炭疽菌C.wenzhouense	中国浙江
10	SR9	温州炭疽菌C.wenzhouense	中国江西
				11	SR19	温州炭疽菌C.wenzhouense	中国江西
12	FJ40-1	温州炭疽菌C.wenzhouense	中国福建
				13	YK102	暹罗炭疽菌C.siamense	中国福建
14	YK38	暹罗炭疽菌C.siamense	中国福建
				15	YK63	暹罗炭疽菌C.siamense	中国福建
16	HZ4	喀斯特炭疽菌C.karstii	中国浙江
				17	IMI 349061	希金斯炭疽菌C.higginsianum	美国
18	H1-1	西瓜炭疽菌C.orbiculare	中国河南
				19	SJ1-10	轮纹镰刀菌Fusarium concentricum	中国广西

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 四种杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合、检测试剂盒及其应用

<130> 100

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> AM-F(Artificial)

<400> 1

tcattctacg tatgtgcccg cccgttg 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> AM-R(Artificial)

<400> 2

ccagaaatac accgaacttg caaagat 27

<210> 3

<211> 857

<212> DNA

<213> Colletotrichum gloeosporioides

<400> 3

ctgatgatgt accccgacta ccgttacacc ccacgcaagc cgtctgagaa gcgtcatcga 60

aagcccagtg gccaaagcaa gaaggccagc ttagcagcgt cgatgaggta gaggtcgtct 120

cctacccgag agcgacgaca ccatcagcgc gccgacttgt cagctcaaga cggaggagta 180

tgagttacac ctaccgactg cgacaagtcg ctgtagcatc agcaacgaat tggaaccgat 240

atcggcgctg ccagaccacc ttaggttgtc tttgtgccct tgactggcag catcagcgac 300

cagggaagcc taagaatatg gcgcctttgt gcagctgtct tcgatctcta tccagtcagc 360

gtggccaagc aggcaaccat gcatctggtc atcgattccc ttcctatatg ctgcggcaag 420

agttaccctg cgccggaaac caacagacct ttgtgcggcg atacttagac gtacgaacgc 480

taggagatca ccggatctga cgaaccaaga atcatcctgg cccatctgct tcgatggcta 540

cgcgaaccag agatcttcga tttgatgaac atattggtag aagaatgtac tcacaaccca 600

tgtattcgca tgttcaaagc gaacacgaac ctttttctgt aattataatc cgcaagccag 660

taaatatcat cttcatagac catctattcc agcccgatac ctagagtgtc atttcttttc 720

ctagcataaa aataatgatt cgcccttgtg atgctcttcg ccactgtcac gaccgcgcat 780

cacgggaata ctaggtctga tcttttttcc agtcgctgct ccagatgaag gtcccgcatc 840

tccactcggt ccccgat 857

<210> 4

<211> 959

<212> DNA

<213> Colletotrichum fructicola

<400> 4

tttctctacg cgagatatat ctacacgact tgcaaagatg cacaaggagc gcctcttgat 60

gatgtatccc gactaccgtt acacccctcg caagccgtct gagaagcgcc atcgaaagca 120

tagtggccaa agcaagaaga ccagcttagc agcgtcgatg aggtagaggc cgcctcctac 180

ccgagagcga caaaaccatc agcgcgccca cttgtcggct ccagacggag gagtatgagt 240

tatacctacc gactgcgaca agtcgctgta gtatcagtca tggaacggaa tagatatcgg 300

cgctgccaaa cgactttagg tcgtccttgt gttctcgact ggcagcatca gcgaccagag 360

gagcctcaga acatggcgcc tttggaggct gtcttcgatc tctatccagt cagcgtgacc 420

caggaggcga ccacgcatct gttcgtcgat tcacttcccg catgctgtgg caagagttac 480

ctgcgcgaga aaccaacaga cctttgtgcg gcgatactta gacgtacgaa cgctaggaga 540

tcaccggatc tgaggaacca agaatcatcc tggaccatct gcttcgatgg caacgcgaag 600

cagagatctt cgatttgatg aacatattgg tgcaaaaatg tactcacaac ccatgtattc 660

gcatgtcaag cgaatacgaa tctttttctg taattataat ctgcaagcca gtaaatatca 720

tcttcatgga ccatctattc cagcccgata cctagagtgt cttttggccc ccgccgtgag 780

gaccattgat tcgcccacat gttgctcttc gccactgcag actgccaaca ccatccatga 840

tgcccagcca ctgtctcgac tgcgcatcac gggaataact aggtctgatc ttttttccag 900

tcgctgctcc agatgaacgt cccgcacctc cactccgtcc ccgatcttgt cccgttcca 959

<210> 5

<211> 962

<212> DNA

<213> Colletotrichum siamense

<400> 5

ttctctcaga aaaatactac acgacttgca aagatgcaca aggagcgcct cttgatgatg 60

tatcccgact accgttacac cccacgcaag ccgtctgaga agcgccatcg aaagcctagt 120

ggccaaagca agaaggccag cttagcagcg tcaatgaggt agaggccgcc ttctacccaa 180

gagcgacaac accatcagcg cgccgacttg tcggctccag acggaggagt atgagttata 240

cctaccgact gcgatgagtc gctgtagcat ctgccacgaa atggaactga tatcggcgct 300

gccagacgac ctaaggttgt ctttgtgtcc tagaatggca gcattagcga ccagaggagc 360

ctaagaatgt ggcgcctttg gcggctgtct tcgatctcca tccagtcagc gtgacccagg 420

aggcgaccac acatctggcc atcgattccc ttcccgcatg ctgcagcaag agttaccctg 480

cgccagaaac caacagacct ttgtgcggcg atacttaggc gtacgaatgc aaggagatcg 540

ccggatctga ggaaccaaga atcatcctgg cccatctgct tcgctggcaa cgcgaaccag 600

agatcttcga tttaatgaac atattggtgg taaaatgtac tcacaaccca tgtattcgca 660

tattcagagc gaacccgagt ctttttctgt aattataatc tgcaagccag taaatattat 720

cttcatagac catctattcc agcccgatac ctaaagtgtc tttttccccc accatgggga 780

ctattcattc gcccatatca tgctcttcgc cactgcggac tgccaacacc atccacgata 840

cacagccgct gtcacgactg cgcatcacgg gagtaactag gtctgatctt tcttccagtc 900

gctgctccag atgaacgtcc cgcatctcca ctccgtcccc gattcttgac cccgtcccca 960

tg 962

<210> 6

<211> 888

<212> DNA

<213> Colletotrichum wenzhouense

<400> 6

gatgatgtat cccgactacc gttatacacc acgcaagccg tctgagaagc gccatcgaaa 60

gcccagtggt caaagcaaga aggccagctt agcagcgtcg atgaggtaga ggtcgtctcc 120

tacccgagag cgacaatcac atcagcgcgc cgacttgtcg gcccacgacg gaggtgtatg 180

ggctacacct acggactgcg acaagtcgct gttgcatcag ccacgacatg gaaccgatat 240

cggcgctgct agatgacatt aggttgtctt tgtatcctag aatggcagca tcagcgccca 300

gggaagccta agaagctggc gcctctgtgc agctgtcttc gatctgtatc cagtcagcgt 360

gtccccgaag gcaaccaaag atctggtcat cgattcgctt cccgcgggac gcggcaagac 420

ttaccttgcg ccagaaaccc acaaaccttt gtgcggtgat gctttggcgt atgaccgcta 480

ggagatgact ggatctgacg aaccaagaac catcctggtt cgtctgcttc gatggcaacg 540

cgaaccagag attttttttt tatttaatga acatattggt ggaaaatgaa ttcacaaccc 600

atgtattcgc atgttgagag cgaacaagta ctgtaattat aagctgcaag ccagtaaata 660

tcatcttcat agaccatcta ttccagcccg atacttagag tgtcatttct cttcccacca 720

tgaggactac ctattgattt gctcttgtga tgctcttcgg gccactgccg gctgctgaaa 780

ccatccatga tgcccagcca ctgccacgat tgcgcatcac gggaataact aggtctgatc 840

ttttttccag tcgctgctcc agatgaacgt cccgcatctc cactccgt 888

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 1#C-F(Artificial)

<400> 7

agcagcgtcg atgaggtag 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 1#C-R(Artificial)

<400> 8

tcgcagtcgg taggtgtaac 20

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 1#C-P(Artificial)

<400> 9

ccgagagcga cgacaccatc agcg 24

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> MQ-F(Artificial)

<400> 10

ccatctattc cagcccgata cc 22

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> MQ-R(Artificial)

<400> 11

cagtggcgaa gagcaacatg 20

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> MQ-P(Artificial)

<400> 12

ccgccgtgag gaccattgat tcgcc 25

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> YK-F(Artificial)

<400> 13

cgctgccaga cgacctaa 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> YK-R(Artificial)

<400> 14

cgaagacagc cgccaaag 18

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> YK-P(Artificial)

<400> 15

aggctcctct ggtcgctaat gctgc 25

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> WZ-F(Artificial)

<400> 16

acacctacgg actgcgacaa 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> WZ-R(Artificial)

<400> 17

ggacacgctg actggataca ga 22

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> WZ-P(Artificial)

<400> 18

tgcatcagcc acgacatgga accga 25

Claims

1.杉木胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的实时荧光PCR检测引物探针组合物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为：

正向引物(F)：5′-AGCAGCGTCGATGAGGTAG-3′，

反向引物(R)：5′-TCGCAGTCGGTAGGTGTAAC-3′，

所述探针的核苷酸序列为：5′-CCGAGAGCGACGACACCATCAGCG-3′，其在5′端修饰有荧光基团、3′端修饰有荧光猝灭基团的物质。

2.根据权利要求1所述的杉木炭疽病病原菌的实时荧光PCR检测引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团为FAM、SYBR、Green I、JOE、VIC、NED、CY-3、TExAS Red或CY-5；所述荧光猝灭基团为TAMRA或BHQ1。

3.一种杉木炭疽病病原菌检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的杉木胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的实时荧光PCR检测引物探针组合物。

4.根据权利要求3所述杉木炭疽病病原菌检测试剂盒，其特征在于，还包括：Pro TaqHS Probe Premix、ROX Reference Dye、CM液体培养基、CTAB溶液和由氯仿与异戊醇按体积比组成的CIA溶液。

5.根据权利要求3所述杉木炭疽病病原菌检测试剂盒，其特征在于，还包括：胶孢炭疽菌、果生炭疽菌、暹罗炭疽菌DNA模板和希金斯炭疽菌、西瓜炭疽菌、喀斯特炭疽菌、轮纹镰刀菌的对照DNA模板。

6.权利要求1或2所述的杉木胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides的实时荧光PCR检测引物探针组合物或权利要求3-5任一所述的检测试剂盒在检测杉木胶孢炭疽菌中的应用。