CN113930543A

CN113930543A - 检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光pcr试剂盒

Info

Publication number: CN113930543A
Application number: CN202111428056.3A
Authority: CN
Inventors: 姚丽锋; 冯家望; 蔡教英; 张晴阳; 丁琦; 黎财慧; 周昱晨; 游淑珠; 符家忍; 王小玉
Original assignee: Gongbei Customs Technology Center
Current assignee: Gongbei Customs Technology Center
Priority date: 2021-11-29
Filing date: 2021-11-29
Publication date: 2022-01-14

Abstract

本发明提供一种检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光PCR试剂盒，包括引物探针组合，所述单端孢霉烯族毒素真菌的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示，所述单端孢霉烯族毒素真菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述玉米赤霉烯酮毒素真菌的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑5所示，所述玉米赤霉烯酮毒素真菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明提供的试剂盒，其测试方法特异性强、灵敏度高、快速、环保，适用于基层实验室对食品中主要产毒素真菌的快速检测。

Description

检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光PCR试剂盒

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体地，涉及一种检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光PCR试剂盒。

背景技术

真菌广泛分布于自然界各级食物链中，种类繁多、数量庞大、与人类的关系十分密切，在适宜的温、湿度条件下，有些产毒素真菌就会在食品（原料及加工产品）、粮食和饲料中生长繁殖，产生真菌毒素。真菌毒素普遍存在于农副产品或动物饲料中，误食后可引起人类和动物的急性或慢性中毒，可损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织，致畸、致癌等。

禾谷镰刀菌是小麦赤霉病的主要病原菌，其侵染小麦主要产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，简称DON)及其乙酰化衍生物(3Ac-DON/15Ac-DON)和玉米烯酮(zearalenone，简称ZEN)等真菌毒素。禾谷镰刀菌产生的毒素会污染小麦籽粒，可引起人畜中毒和重大疾病，严重影响食品安全，给人类及家畜健康带来严重威胁。

目前产毒素真菌的检测方法主要是传统微生物培养法和普通PCR法，前者基于形态学观察，根据孢子形态、菌丝侵染和产孢方式等特征对产毒素真菌进行分类鉴定，普通PCR检测过程需在扩增后对产物进行分析验证。两种方法操作均存在步骤繁琐、检验周期长的局限性，在应急监测中难以应用。实时荧光PCR方法边扩增边检测，提高了检测速度，具有特异性更强、灵敏度更高、检测周期更短，已成为一种成熟的主流基因检测平台，该方法应用于产毒素真菌的检验，能够较好地弥补传统方法在检测工作中的不足，大幅缩短检测时间，简化操作流程，满足进出口食品产毒素真菌快速检测的需求。

因此，基于实时荧光PCR方法的优势以及对禾谷镰刀菌类产毒真菌快速检测的需求，开发一种便捷、快速的禾谷镰刀菌类产毒真菌快速检测方法，以满足基层实验室对食品中主要产毒素真菌的快速检测。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种新型的检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光PCR试剂盒。本发明作为一种便捷、快速的禾谷镰刀菌类产毒真菌快速检测方法，可以满足基层实验室对食品中主要产毒素真菌的快速检测的需求。

本发明的技术方案为：

一种检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述禾谷镰刀菌类产毒真菌包括单端孢霉烯族毒素真菌和玉米赤霉烯酮毒素真菌，包括引物探针组合，所述单端孢霉烯族毒素真菌的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述单端孢霉烯族毒素真菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述玉米赤霉烯酮毒素真菌的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示，所述玉米赤霉烯酮毒素真菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

具体为：

上游引物Tri5-F1，SEQ ID No.1：5’-CTACCCTCAATTCCTTCGTCGTA-3’；

下游引物Tri5-R1，SEQ ID No.2：5’-CGCTCATCGTCGAATTCCTTG-3’；

探针Tri5-P1，SEQ ID No.3：5’-FAM- CAAACCATCCAGTTCTCCATCTG-BHQ1-3’。

上游引物PKS13-F1，SEQ ID No.4：5’-GATGGACCCAGGCCATCGACA-3’；

下游引物PKS13-R1，SEQ ID No.5：5’-TGGCTCACATCATGCCAGTCG-3’；

探针PKS13-P1，SEQ ID No.6：5’-FAM-CCGAGTACCCAGCCATTTCGAGAGCT-BHQ1-3’。

进一步的，所述单端孢霉烯族毒素真菌、玉米赤霉烯酮毒素真菌的检测探针的5’端修饰有荧光基团、3’端修饰有荧光猝灭基团的物质；所述荧光基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1。

本发明中，分别选用单端孢霉烯前体合成酶编码基因Tri5的有无来判断待检样品是否污染了产单端孢霉烯族化合物的真菌，选用聚酮合成酶基因PKS13的有无来判断待检菌株是否能够产生玉米赤霉烯酮毒素。通过NCBI在线工具查找目的基因序列，利用DNAMAN软件进行序列分析和比对，选择具有种属特异性且高度保守的序列，利用Oligo7软件分别设计出引物和探针组合，探针5’端标记FAM，3’端标记BHQ1。

进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照和PCR反应体系。

进一步的，所述阳性对照选取真菌共有的5.8S rDNA的ITS基因。

进一步的，所述阳性对照的引物探针组合分别如SEQ ID NO.7-9所示。

具体为：

上游引物ITS-F1，SEQ ID No.7：5’-CTCTTGGTTCCGGCATC-3’；

下游引物ITS-R1，SEQ ID No.8：5’-TGCGTTCAAAGACTCGAT-3’；

探针ITS-P1，SEQ ID No.9：5’-FAM-AGCGAAATGCGATACGTAATGTGA-BHQ1-3’。

本发明中，使用真菌共有的5.8S rDNA的ITS序列作为阳性参标判断提取的DNA模板和荧光PCR反应是否合适。

进一步的，所述反应体系包括12.5 µL 2x Superstart premix Plus（ProbeqPCR），引物探针各1µL，DNA模板5 µL，用双蒸水补足总体积25 µL。

进一步的，所述引物探针的终浓度均为0.4 µmol/L。

进一步的，所述试剂盒的扩增反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性5s，60℃退火45s，收集荧光信号；45个循环。

本发明中，采用的实时荧光PCR技术是在PCR基础上，加入一条与模板DNA匹配的、两端有荧光标记的寡核苷酸探针。PCR每进行一次循环，合成新链数与释放的荧光基团呈对应关系，即PCR产物的量与荧光信号的强度呈对应关系。当荧光信号超过所设定的阈值时，荧光信号可被检测出来，仪器检测荧光基团的增加量可以间接地体现目的片段的扩增量。样品的模板DNA进行实时荧光PCR扩增，观察实时PCR的增幅曲线，从而对食品中的产毒素真菌进行快速检测。

本发明中，禾谷镰刀菌类产毒真菌由于种类繁多，种之间、种属之间的核酸序列同源性较高，同时，整个真菌基因组发生变异的几率远大于人类基因组，使得可选择做为靶基因序列进行种属检测的基因序列不多，因此，对于设计特异性检测常见禾谷镰刀菌比如单端孢霉烯族毒素真菌、玉米赤霉烯酮毒素真菌等的荧光PCR的引物和探针的难度比较大。发明人通过大量创造性试验，找到最优的引物探针对。PKS13基因是禾谷镰刀菌中编码聚酮化合物合酶(PKS)执行多个酯单元顺序缩合的关键基因，由PKS13指导的氨基酸合成序列与数据库中其他真菌PKS酶的基因紧密相连，要找到其中的非保守序列难度很大，发明人进行了大量的序列分析和比对，针对PKS13基因的两个非保守序列设计了引物探针对，用于检测产玉米赤霉烯酮禾谷镰刀菌。

单端孢霉烯族毒素的生物合成至少涉及到3 个基因家族，分别为Tri5基因簇、Tri1～Tri16基因簇和Tri101基因簇；其中Tri5基因编码单端孢霉烯合成酶，该酶可促进焦磷酸法尼酷折叠成单端孢霉稀，是所有单端孢霉烯族毒素生化合成的第一步。多种镰刀菌中都存在单端孢霉烯基因簇的一个19kb的片段,其中包含Tri5基因，这些包含Tri5基因的镰刀菌都可产生单端孢霉烯毒素。Tri5基因具有种属特异性和高度的保守性，因此在分析参与毒素合成的基因或者参与调控的分子机制中，可作为探针，也可作为特异性的分子标记产单端孢霉烯族毒素的禾谷镰刀菌菌株。但由于目标核苷酸特异型片段较小，要在其中设计合适的引物探针，仅仅利用软件进行分析和比对，找到的引物探针不能满足实验要求，必需再通过创造性试验，进行人工调整和比对，并进行大量实验以从中筛选合适的引物探针对。

本发明设计的引物探针均能有效扩增出相应的靶基因，对其目标基因扩增荧光信号强，出现时间早，扩增效果好。

本发明提供的引物探针组合能够实现单端孢霉烯族毒素真菌、玉米赤霉烯酮毒素真菌的同时检测，检测特异型强，灵敏度高、检测速度快。本发明的试剂盒能成功从食品样品中快速检测出主要产毒素真菌，方法具有良好的排他性和包容性，同常见真菌和常见致病菌均无交叉反应，产毒素真菌关键基因的核酸检测灵敏度为2.0×10^-4ng/µL。检测结果与普通PCR方法结果一致。该方法特异性强、灵敏度高、快速、环保，适用于基层实验室对食品中主要产毒素真菌的快速检测。

附图说明

图1为实施例引物探针的特异性验证结果，图中A-C依次为对筛选出的ITS、Tri5、PKS13引物探针特异性检测结果，图中数字为菌株序号）；

图2为梯度稀释的阳性菌株核酸ITS基因的灵敏度检测结果，图中A-C依次为荧光PCR扩增图谱、标准曲线、普通PCR电泳图；

图3为梯度稀释的阳性菌株核酸Tri5基因的灵敏度检测结果，图中A-C依次为荧光PCR扩增图谱、标准曲线、普通PCR电泳图；

图4为梯度稀释的阳性菌株核酸PKS13基因的灵敏度检测结果，图中A-C依次为荧光PCR扩增图谱、标准曲线、普通PCR电泳图；

图5为染菌样品单端孢霉烯族毒素检测谱图；

图6为染菌样品玉米赤霉烯酮毒素检测谱图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不限定本发明的保护范围。

实施例

具体为：

上游引物Tri5-F1，SEQ ID No.1：5’-CTACCCTCAATTCCTTCGTCGTA-3’；

下游引物Tri5-R1，SEQ ID No.2：5’-CGCTCATCGTCGAATTCCTTG-3’；

探针Tri5-P1，SEQ ID No.3：5’-FAM- CAAACCATCCAGTTCTCCATCTG-BHQ1-3’。

上游引物PKS13-F1，SEQ ID No.4：5’-GATGGACCCAGGCCATCGACA-3’；

下游引物PKS13-R1，SEQ ID No.5：5’-TGGCTCACATCATGCCAGTCG-3’；

进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照和PCR反应体系。

具体为：

上游引物ITS-F1，SEQ ID No.7：5’-CTCTTGGTTCCGGCATC-3’；

下游引物ITS-R1，SEQ ID No.8：5’-TGCGTTCAAAGACTCGAT-3’；

探针ITS-P1，SEQ ID No.9：5’-FAM-AGCGAAATGCGATACGTAATGTGA-BHQ1-3’。

进一步的，所述引物探针的终浓度均为0.4 µmol/L。

实验效果验证：

1、实验菌株：本实验共使用52株菌（表1），其中包括黄曲霉、寄生曲霉、禾谷镰刀菌标准菌株，其他真菌标准菌株，以及其他常见的食源性致病菌标准菌株。

表1实验用菌株列表

注：ATCC：美国典型培养物保藏中心；CMCC：医学微生物菌种保藏管理中心；CGMCC：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； CICC：中国工业微生物菌种保藏管理中心；ACCC：中国农业微生物菌种保藏管理中心；CCTCC：中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。

2、试剂与仪器：2x Superstart premix Plus（Probe qPCR），TAKARA；货号：RR390；UNlQ-10 柱式真菌菌基因组DNA抽提试剂盒，生工生物工程股份有限公司，货号：B511375；培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司。7500 Fast Real Time PCR System，美国ABI公司；Nanodrop 2000c核酸蛋白分析仪，美国Thermo公司；Masteroyoler pro梯度PCR仪，德国eppendorf公司；QIAxcel Advanced全自动核酸分析系统，德国Qiagen公司。

3、基因组DNA提取与核酸蛋白分析仪测定：

无菌条件下用灼烧过的接菌环挑取一环目标真菌的孢子接种到装有5mL萨氏培养液的试管中，25℃，180 r/min，摇床培养48h。从萨氏培养液中挑取菌丝（约0.3 g）到研钵中，加液氮研磨菌丝至粉末状。采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行，最终将核酸溶解在50μL TE缓冲液中。对提取的核酸用超微量分光光度计（Nanodrop 2000）进行浓度和纯度的测定，确保提取核酸的A260/A280在1.7-1.9之间。按照式（1）计算DNA的浓度。

ρ= A260×50………………………………（1）

注：ρ— DNA浓度，单位为微克每毫升（ng//μL），A260 — 260 nm处的吸光值

4、普通PCR检测：参照DB22/T 1821-2013方法进行产单端孢霉烯族毒素真菌（禾谷镰刀菌）的检测，参照Atoui （2012）的方法进行产玉米赤霉烯酮毒素真菌（禾谷镰刀菌）的检测。引物序列及扩增片段长度见表2。

表2产毒素真菌普通PCR引物序列

5、人工污染样品的检测：

称取50g优质籼米，加入20ml灭菌水混匀，过夜，121℃灭菌15min，作为一份添加基质样品。将禾谷镰刀菌（ACCC38871、ACCC39294）菌株在萨氏液体培养基活化培养7d后，取5mL含菌丝/孢子培养液分别接种至大米培养基中。制备成4份人工污染样品，①每份样品取25g参照GB 4789.15中方法进行样品制备和培养；取培养出的可疑真菌，在无菌条件下用灼烧过的接菌环挑取一环孢子接种到装有5mL沙氏液体培养基的试管中，在25℃，180 r/min，摇床培养48h。采用真菌基因组DNA 提取试剂盒进行基因组DNA 提取，采用荧光PCR法检测产单端孢霉烯族毒素真菌（禾谷镰刀菌）、产玉米赤霉烯酮毒素真菌（禾谷镰刀菌）。②剩余样品于28 ℃、相对湿度60%的条件下培养7d后，每份样品各取5g，按照GB 5009.111-2016《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》进行单端孢霉烯族毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）测定，按照GB 5009.209-2016 《食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定》进行玉米赤霉烯酮毒素测定。

6、自然样品的检测：

抽取代表性的30种食品、粮食样品，按照GB 4789.15-2016进行真菌培养，取可疑菌提取真菌核酸，采用本发明荧光PCR法和普通PCR法检测产毒素真菌，并比较检测结果。

7、结果分析

7.1、引物探针特异性测试

引物探针特异性测试包括包含性测试和排外性测试。为保证扩增反应的特异性，用筛选出的ITS-F1/R1/P1对表1中的所有菌株DNA进行检测，结果表明，真菌DNA出现明显扩增曲线，其他微生物检测均呈阴性，该引物探针组有良好的特异性（图1A）。

采用选出的Tri5-F1/R1/P1、PKS13-F1/R1/P1引物探针组，对表1中所列3株禾谷镰刀菌标准菌株和其他真菌DNA进行检测，结果发现只有3株产禾谷镰刀菌出现阳性扩增信号，而其他真菌检测均呈阴性（图1B、C）。表明Tri5-F1/R1/P1、PKS13-F1/R1/P1引物探针组具有良好的特异性。

表 3 对引物探针的特异性验证结果

7.2、梯度稀释真菌核酸的检测－灵敏度验证

用筛选出的引物组和优化的反应体系进行梯度稀释真菌核酸的检测。取阳性标准菌株的基因组核酸（20ng/μL），进行 10 倍梯度稀释至10^-1- 10^-6，对应核酸浓度为2.0、2.0×10^-1、2.0×10^-2、2.0×10^-3、2.0×10^-4、2.0×10^-5 ng/µL。禾谷镰刀菌 ACCC 39294提取核酸用于检测Tri5、PKS13基因。同时使用荧光PCR和普通PCR方法进行检测。

ITS基因检测结果表明：检测灵敏度达10^-6稀释度（2.0×10^-5 ng/µL），在10^-1至10^-6范围内检测结果呈良好的线性关系（R2= 0.999），标准曲线斜率-3.336，扩增效率达99.4%（图2）。相应的普通PCR方法灵敏度达10^-5稀释度，结果表明荧光PCR方法灵敏度更高。

Tri5和PKS13基因检测灵敏度均为10^-5稀释度（2.0×10^-4 ng/µL），在10^-1至10^-5范围内检测结果呈良好的线性关系，R2＞0.990，标准曲线斜率在3.2-3.4之间，扩增效率达99%以上（图3-4）。相应的普通PCR方法灵敏度为10^-3-10^-4稀释度，结果表明荧光PCR方法灵敏度为2.0×10^-4 ng/µL，高于普通PCR方法的灵敏度。

表 4 梯度稀释的禾谷镰刀菌基因组 DNA检测结果

7.3、人工污染样品的检测

根据人工污染样品培养结果，提取可疑真菌核酸后进行荧光PCR检测，对可疑产单端孢霉烯族毒素真菌检测ITS、Tri5基因，对可疑产玉米赤霉烯酮毒素真菌检测ITS、PKS13基因。检测见表5，污染禾谷镰刀菌ACCC38871、ACCC39294的样品分离出的可疑菌均检出产单端孢霉烯族毒素真菌关键基因（Tri5）和产玉米赤霉烯酮毒素真菌关键基因（PKS13）。与预期结果一致。

表5 人工污染样品可疑真菌荧光PCR检测及产毒素检测结果

取染菌样品培养物检测真菌毒素，结果见图5-6，污染禾谷镰刀菌ACCC38871、ACCC39294的样品种均检出单端孢霉烯族毒素和玉米赤霉烯酮毒素。

7.4、自然样品的检测

抽取代表性的30种食品、粮食样品（表6），按照GB 4789.15-2016进行真菌培养，取可疑菌提取真菌核酸，采用本发明荧光PCR法和普通PCR法检测产毒素真菌，结果见表6，结果表明荧光PCR方法检测结果与普通PCR检测结果一致。

表6 自然样品检测结果

因此，本发明的引物探针组合以及试剂盒能成功从食品样品中快速检测出主要产毒素真菌，方法具有良好的排他性和包容性，同常见真菌和常见致病菌均无交叉反应，产毒素真菌关键基因的核酸检测灵敏度为2.0×10^-4ng/µL。检测结果与普通PCR方法结果一致。本发明方法特异性强、灵敏度高、快速、环保，适用于基层实验室对食品中主要产毒素真菌的快速检测。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。需注意的是，本发明中所未详细描述的技术特征，均可以通过本领域任一现有技术实现。

序列表

<110> 拱北海关技术中心

<120> 检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光PCR试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctaccctcaa ttccttcgtc gta 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgctcatcgt cgaattcctt g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caaaccatcc agttctccat ctg 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatggaccca ggccatcgac a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggctcacat catgccagtc g 21

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgagtaccc agccatttcg agagct 26

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcttggttc cggcatc 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcgttcaaa gactcgat 18

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcgaaatgc gatacgtaat gtga 24

Claims

1.一种检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述禾谷镰刀菌类产毒真菌包括单端孢霉烯族毒素真菌和玉米赤霉烯酮毒素真菌，包括引物探针组合，所述单端孢霉烯族毒素真菌的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述单端孢霉烯族毒素真菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述玉米赤霉烯酮毒素真菌的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示，所述玉米赤霉烯酮毒素真菌的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.根据权利要求1所述的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述单端孢霉烯族毒素真菌、玉米赤霉烯酮毒素真菌的检测探针的5’端修饰有荧光基团、3’端修饰有荧光猝灭基团的物质；所述荧光基团为FAM，所述荧光猝灭基团为BHQ1。

3.根据权利要求2所述的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和PCR反应体系。

4.根据权利要求3所述的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照选取真菌共有的5.8S rDNA的ITS基因。

5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述阳性对照的引物探针组合分别如SEQ ID NO.7-9所示。

6.根据权利要求3所述的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述反应体系包括12.5 µL2x Superstart premix Plus 8，引物探针各1µL，DNA模板5 µL，用双蒸水补足总体积25 µL。

7.根据权利要求6所述的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述引物探针的终浓度均为0.4 µmol/L。

8.根据权利要求7所述的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性5s，60℃退火45s，收集荧光信号；45个循环。