CN103060431A - 基于16S rDNA的细菌核酸指纹特征谱的制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于细菌16S rDNA核酸指纹图谱制备的方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。基于该方法，建立常见细菌的核酸指纹图谱数据库。根据实验产生的质谱峰图，可对待检细菌进行分类与鉴定，结果可广泛运用于细菌分类和鉴定、遗传进化分析、耐药筛选用途以及进出口检验等领域。

Description

基于16S rDNA的细菌核酸指纹特征谱的制备方法及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌核酸指纹图谱制备的方法，以及使用该方法，对细菌进行分类与鉴定的方法。 

背景技术

早期的细菌学分类主要是采用以形态培养特征和生理生化特征为依据的传统细菌学分类方法。但是由于细菌的这种表面特征往往受很多人为因素的影响与限制，特别是人们主观判断的差异反而难以反映出细菌的自然亲缘关系，这就体现了只建立在形态特征和生理生化特征基础上的传统分类学的局限性。 

因此，Colweel提出了一个新的细菌分类学术语“多相分类（Polyphasic taxonomy）”，它是指综合利用微生物多种不同信息，包括表型和基因型的信息进行分类的方法。分子分类和系统发育信息丰富了多相分类的内容，共同推动细菌分类向着自然分类系统靠近。应用于分类的分子指标主要为DNA和RNA，而DNA同源性分析是确定正确的分类地位，建立自然分类系统的最直接的方法。此类方法简便易行，分辨率高，在细菌系统分类学研究中起着越来越重要的作用。 

使用质谱技术进行细菌分类和鉴定的原理在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，对细菌基因组DNA上某个或某几个片段进行PCR和酶切后，将产生分子量和丰度各异的片段，使用质谱检测可产生核酸指纹图谱，不同细菌之间基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱，建立数据库后，可以实验结果与数据库进行比对，即可完成对细菌的鉴定。 

已有一些公开文献使用质谱技术对微生物进行分类和鉴定，例如，中国专利申请CN102337223A、“产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制备方法”，公开了一种检测产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-TOF鉴定方法，其中从平板上挑取产黄青霉A096孢子接种于SGY液体培养基培养，预处理得到粗蛋白溶液在色谱柱上分离纯化，并在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，各组分离心超滤浓缩至所需体积，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分判断获得蛋白的纯度；割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，进行MALDI-TOF鉴定。该方法仅适用于特定微生物，且需要多重蛋白纯化过程，最终用MALDI-TOF鉴定特征蛋白Pc-Arctin，其过程繁琐、适用面窄，不能实现质谱分类细菌或微生物的目的。 

中国专利申请200910157210、“一种李斯特菌属细胞中脂肪酸组分的分析方法”公开了一种利用气相色谱质谱(GC-MS)分析法针对细菌脂肪酸进行分类的方法，包括：李斯特菌复壮，用牛津琼脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂平板分别分离和纯化李斯特菌，培养单个典型菌落的李斯特菌并制成菌悬液，用甲醛灭活处理，把经甲醛处理后的菌悬液平均分装在离心管洗涤，用盐酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸进行气相色谱质谱(GC-MS)分析。虽然该方法打破传统细菌分类学的局限，减少人为因素对传统形态分类带来的误差，同时为新的菌种和毒种的分类鉴定提供强有力的工具，但该法仍然属于利用质谱法进行细胞化学分析分类，并未针对核酸进行检测。 

国际专利申请WO2010/021548、“Method for identifying biological material e.g. bacteria in sample of patient, involves separating stream of liquid containing sample into successive portions to form flying drops and ionizing flying drops to measure mass spectra”，公开了一种使用MALDI-MS(基质辅助激光解吸和电离质谱)用于识别生物材料的方法和装置，包括准备包含试样和MALDI基质材料的液体，并将其用于形成液体的连续流束。将该流束分散成接连的 部分，以形成发射到飞行中的液滴，或将流束发射到飞行中，然后分散成液滴。可使用从喷墨印刷机中已知的液滴形成技术。对飞行中的液滴电离出材料。测量来自各个液滴的电离材料的质谱。但该方法目的在于如何改善MALDI-MS检测生物物质的灵敏度，并不涉及质谱鉴定和分类任意微生物，因此也不能解决上述技术问题。 

朱健等人（“高效液相色谱-电喷雾多级质谱法对格尔德霉素粗品中各组分的初步判别及分类”，《中国抗生素》，2011年 03期 ）报道了应用高效液相色谱-电喷雾多级质谱法(LC-ESI-MSn) 对格尔德霉素(GDM)粗品中各组分进行与质量数相关的结构信息方面的初步判别及分类。该方法针对格尔德霉素(GDM)中不同组分的多级质谱碎片进行的分析整理，并对各种化合物进行了准确分类，但并不涉及针对细菌特定物质进行检测从而对细菌进行分类的方法。 

刘海洪（“MALDI TOF MS在细菌检测和鉴定中的应用”，《微生物学免疫学进展》，2003年 02期）报道了“细菌体内含有大量的生物标志分子能用于细菌的化学分类和鉴定，针对如根据细菌的组成成分获得指纹图谱检测和鉴定细菌”，并对该方法预测其理论上的可行性。然而，该研究仅仅是理论上探讨了利用MALDI TOF MS对细菌进行分类的方向，其既没有指明所针对细菌的何种组分进行检测，也没有说明具体研究方法和过程。由于细菌中可用于分类的组分（如蛋白、DNA、RNA、多糖等）种类太多，且质谱技术针对不同待测物也存在各种实验参数的组合和选择，因此在此之后的近10年内并没有利用MALDI TOF MS进行细菌分类的新的报道。 

作为最接近的现有技术，中国专利申请201110154723、“MALDI TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法”公开了一种利用MALDI TOF MS技术辅助鉴定细菌的方法，包括：预处理细菌培养物，采集所有菌株样品的MALDI TOF MS图谱，根据软件制备细菌标准图谱，使用相同的方法检测并采集待测细菌的图谱，以及比较二者图谱，根据匹配分数进行判定。由于该方法使用常规的处理（通过无水乙醇、甲酸和乙腈处理，并辅以离心，最后吸取上清液进行检测），尽管其在一定程度上能表征该细菌的特征图谱，但由于其待测物中含有蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体细菌而无法推广到其他大量的细菌检测中。 

研究证明，细菌rRNA区域。rRNA是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标，它含量达80%，并存在于所有细菌中，rRNA基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。其中，16S rDNA序列由于分子大小适中（约1.5kb），突变率极低，已经成为细菌分类和种属鉴定的重要标记（Olsen GJ, Pace NR, Nuell M, et al. Nucleic Acids Res, 1991, 19( supp l): 2017-2021.）。虽然目前16S rDNA序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，大约2500个种的16S rDNA全序列已经被报道，根据它们的序列同源性，已经构建了各种属的系统发育树。但由于16S rDNA序列在原核生物中的高度保守性，对于相近种或同一种内的不同菌株之间的鉴别分辨力较差。 

另外，目前以16S rDNA进行细菌分类和鉴定的方法主要是采用PCR产物直接测序，结果与数据库进行比对的方法。测序法应用于临床检测，目前存在如下问题：（1）成本高；（2）耗时；（3）对于混合样本，测序易产生套峰，难以进行有效区分；（4）16S rDNA全长1.5kb以上，一般需要经过两次测序并将结果进行拼接，在这个过程中易引入误差。 

如前所述，16S rDNA对细菌分类鉴定具有重要的意义，但是传统测序等方法检测成本高、耗时长；对于混合感染的样品，测序法将得到混合的序列峰图，难以进行有效的区分，并且利用质谱进行待测物分析，需要选择合适的待测物和优化质谱参数，因此目前需要新的 细菌分类技术（如质谱法）来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。  

因此，目前需要一种既能针对细菌中16S rDNA某特定区域进行质谱检测，同时该方法又能普遍用于绝大多数细菌的质谱分类和鉴定中。 

发明内容

本发明原理在于：发明人经过大量摸索和比对，针对841种细菌的研究，发现选用通用引物对细菌DNA保守DNA区域进行PCR扩增后，使用特殊酶对扩增产物处理后，进行质谱检测可以得到各种细菌核酸指纹特征图谱。本发明所述的细菌DNA基因组上一个区域，优选是具有高度保守同时又具有一定多态性的区域。由于细菌属于低等生物，各种细菌的基因组中普遍呈现为一定同源性的保守性，因此针对细菌基因组中任一相对保守的区域，使用通用引物即可扩增出各种细菌彼此对应的核酸区域。不同微生物的DNA片段酶切，具有不同的特征图谱，因而将实际核酸质谱图谱进行生物信息学分析，即可实现细菌的分类与鉴定。 

因此，本发明第一目的是提供一种基于酶切的细菌核酸指纹图谱制备方法。其特征在于，它至少包括如下步骤： 

（1）PCR反应：使用针对细菌16S rDNA的PCR通用引物，分别扩增多个细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物； 

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物； 

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤（2）得到的各个细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； 

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物； 

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到不同细菌的特征核酸指纹谱图。 

在一个实施方案中，PCR反应所扩增的细菌核酸序列，包括但不限定于细菌16S rDNA上一个区域。在另一个具体实施方案中，所述细菌16S rDNA区域选自SEQ ID NO:3所示的区域，或者与SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的序列。在其中的优选实施方案中，优选该序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的序列。  

在一个实施方案中，所述通用引物包括但不限于SEQ ID No：1至SEQ ID No：2所示序列。 

在另一实施方案中，步骤3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中，步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟。在另一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。 

上述任一方案中，其中所述细菌包括如表1所列的836种细菌。 

表1  

在上述任一方案中，其中所述细菌还包括布鲁氏菌(Brucella)、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）。其中，布鲁氏菌包括羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）、牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)、猪种布鲁氏菌（Brucella suis）。 

本发明的第二目的是提供建立细菌核酸指纹特征图谱库的方法，至少包括：上述步骤1-5，和； 

(6)将步骤5得到的各种细菌16S rDNA的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到所述的细菌核酸指纹特征图谱库。 

在一个实施方案中，所述软件是发明人自行研究开发的BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700。 

本发明的第三目的是提供一种利用上述特征图谱库进行细菌鉴定的方法，包括： 

（1）PCR反应：使用针对细菌16S rDNA的PCR通用引物，扩增待测细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物； 

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物； 

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段； 

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物； 

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该细菌的核酸指纹特征图谱； 

（6）将所得核酸指纹特征图谱与细菌核酸指纹特征图谱库进行比较，从而判断待测细菌的类别或种属。 

在一个实施方案中，PCR反应所扩增的细菌核酸序列，包括但不限定于细菌16S rDNA上一个区域。在另一个具体实施方案中，所述基因组上的区域选自SEQ ID NO:3所示的区域，或者与SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的序列。在其中的优选实施方案中，优选该序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的序列。  

在一个实施方案中，所述通用引物包括但不限于SEQ ID No：1至SEQ ID No：2所示序列。 

在另一实施方案中，步骤3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。在另一个具体实施方案中，步骤6通过BioExplore软件进行比较检测。 

本发明的第四目的是提供能用于细菌分类和鉴定、耐药筛选用途的试剂盒，包括： 

（1）用于扩增细菌DNA的通用引物对及其缓冲液； 

（2）SAP酶及其缓冲液； 

（3）RNAase及其缓冲液； 

（4）用于纯化酶切产物的树脂； 

（5）用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。 

在一个实施方案中，其中所述引物是SEQ ID NO:1-2。 

在另一实施方案中，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为（软著登字第136879号、登记号2009SR10700）。 

定义 

本发明所述的“细菌分类和鉴定”，包括对细菌进行鉴定和识别、分型、分种、分类。例如在食品安全检测中，通过细菌分类或鉴定，能准确识别污染源和细菌组成，以备采用合理措施进行保障食品安全。又如，在研究细菌的进化中，通过对细菌的识别和分类/分型，能够确定各种细菌种属之间的亲缘远近关系。 

本发明所述的细菌DNA基因组上一个区域，优选是具有高度保守同时又具有一定多态性的区域。由于细菌属于低等生物，各种细菌的基因组中普遍呈现为一定同源性的保守性，因此针对细菌基因组中任一相对保守的区域，使用通用引物即可扩增出各种细菌彼此对应的核酸区域。不同微生物的DNA片段酶切，具有不同的特征图谱，因而将实际核酸质谱图谱进行生物信息学分析，即可实现细菌的分类与鉴定。 

本发明所述的“通用引物”是能位于各种细菌基因组的待扩增区域的上下游，能在不同 细菌基因组中扩增相应片段的引物。其中，本发明所述的基因组上的待扩增区域选自与SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的序列，优选该序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的序列。由于对于细菌DNA（例如16S rDNA）而言，其序列通常由保守区和可变区组成，且可变区多为不连续或短片段甚至SNP形式夹杂在保守区中间或两端，因此使用通用引物即能在不同细菌基因组中扩增相应片段。因各种细菌的该片段均具有一定同源性，故在与SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的片段中，经过酶切和质谱后能得到待测细菌的核酸指纹特征图谱。 

在一个实施方案中，细菌16S rDNA的特定区域是细菌16S rDNA序列CTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTTGCCTTGGTAGGCCATTACCCTACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGCCCATCTGTAAGCGATAGCCGAAACCATCTTTCAAAAGCGTGGCATGCGCCACACTTTATCATTCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCCAACTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTAACTTTGGAAGAGCAAGCTCTTCCTCCGTTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCT，即SEQ ID NO:3（李斯特菌，358bp）。在一个具体实施方案中，该特定区域的引物是SEQ ID No：1和SEQ ID No：2。 

在另一个实施方案中，步骤5中涉及使用BioExplore软件进行数据分析，并建立标准菌株的数据库。 

在另一实施方案中，所述的用于核酸酶切的特定酶是RNaseA酶。 

还在另一实施方案中，所述质谱是MALDI-TOF质谱。 

有益效果 

1、本发明反复研究836种细菌的酶切和质谱检测结果，发现并获得各种细菌核酸指纹特征图谱，能有效鉴定各种细菌的存在，且不受到与细菌基因组相似的非细菌类微生物（如真菌、病毒等）的干扰。 

2、由于质谱检测的高灵敏性，使用本方案对细菌存在与否的检测下限能够远超出其他技术方案（如生化检测、测序检测等）； 

3、对于不同的样本，本发明可比对它们产生的核酸指纹图谱，将实验产生的核酸指纹图谱与数据库中标准菌株的图谱进行对比，经生物信息学分析，可以判断属于哪一种属，或与某一种属的亲缘关系远近； 

4、对于易产生各类突变的细菌，将实验产生的核酸指纹图谱与数据库中非突变株的图谱进行对比，经生物信息学分析，可以判断是否存在突变； 

5、对于多种细菌混合的样本，将实验产生的核酸指纹图谱与数据库中标准菌株的图谱的进行对比，经生物信息学分析，可以判断样本中含哪些种属的细菌。 

6、使用本方案可以进行细菌的分类与鉴定，并广泛运用于细菌分类、食品安全检测、疾病预防与控制、疾病传染途径研究、流行病学调查、临床耐药突变筛查、进出口检验检疫等多个方面。 

7、相对于测序分类法，全过程仅仅数小时内完成，省时省力； 

8、相对于测序峰图，细菌核酸指纹图谱对于混合样品有更好的分辨能力。经过摸索，首次设计出利用质谱检测检测16S rDNA区域，获得细菌指纹图谱的流程； 

9、另外，本发明首次提出将细菌的16S rDNA区域作为待测物进行质谱检测，以获得不同细菌的核酸指纹图谱，用于细菌的遗传进化分析以及分类与鉴定的研究。 

附图说明

图1为李斯特菌的核酸指纹特征图谱。 

图2为醋酸杆菌的核酸指纹特征图谱。 

图3为固氮根瘤菌的核酸指纹特征图谱。 

图4-图100为表2中所示97种细菌的核酸指纹特征图谱，其中，图4：表2中第1号菌种(Acaryochloris marina MBIC11017 chromosome)，图26：表2中的第23号菌株（Capnocytophaga ochracea DSM 7271 chromosome），图49：第46号菌种（Megasphaera elsdenii DSM 20460），图72：第69号菌种（Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 chromosome chromosome 1），图95：第92号菌种(Thiomicrospira crunogena XCL-2 chromosome)，图100：第97号菌种（Xanthobacter autotrophicus Py2 chromosome）。 

图101-103为羊种(Brucella melitensis)、牛种(Brucella abortus)、猪种布鲁氏菌（Brucella suis）的核酸指纹特征图谱。 

图104为结核分枝杆菌的核酸指纹特征图谱。 

图105为幽门螺杆菌的核酸指纹特征图谱。 

图106为实施例四的待测自养黄杆菌（Xanthobacter autotrophicus Py2 chromosome）的核酸指纹特征图谱。 

图107为实施例五中待测奶制品的细菌核酸指纹特征图谱。 

图108为实施例五中对照实验的细菌培养图。 

图109为实施例五对照实验的柯氏染色图。 

图110为实施例六的肉制品细菌检测的核酸指纹特征图谱。 

图111为实施例六对照实验的柯氏染色图。 

图112为实施例六对照实验的PCR扩增后凝胶电泳图。 

图113为实施例七的待检污染源的细菌核酸指纹特征图谱。 

图114为实施例七的对照实验的罗氏固体培养基的培养图。 

图115为实施例七的对照实验的萋钠抗酸性涂片法染色图。 

图116为实施例八的痰样的细菌核酸指纹特征图谱。 

图117为实施例八的荧光定量PCR检测图。 

图118为实施例九的待检污染源的细菌核酸指纹特征图谱。 

图119为实施例九对照实验的细菌培养的碱性品红法结果图。 

图120为实施例十的待检鲜奶的细菌核酸指纹特征图谱。 

图121为实施例十对照实验的细菌PCR扩增后凝胶电泳图。 

图122为实施例十一所构建的细菌遗传进化树。 

图123为实施例十一待测菌的核酸指纹特征图谱。 

图124为实施例十一中根据进化树所确定待测菌的遗传进化关系。 

具体实施方式

现在仅用参考下面非限制性的实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。除非有其它说明，本发明的实施例使用本领域中的传统分子生物学、细胞生物学、PCR扩增和突变技术等等。这些技术是技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。参见，例如， 

Sambrook and Russell″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″(2001)； 

Cloning：A Practical Approach，″Volumes I and II(D.N.Glover， ed.，1985)″； 

T.A Brown  “Genome”  BIOS Scientific Publishers Limited; 

PY Kwok Annu. Rev. Genomics Hum. Genet.(2001), 235–58. 

实施例一、单个细菌核酸指纹特征图谱的建立 

一、设计并选择通用引物 

根据李斯特菌(Listeria monocytogenes EGD-e, NCBI登录号：NC_003210.1)的16S rDNA的保守区域（SEQ ID No:3）中，设计通用PCR引物，分别为： 

5-aggaagagagAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3（SEQ ID No：1） 

5-cagtaatacgactcactatagggagaaggctCTGCTGCGTCCCGTAG-3（SEQ ID No：2） 

其中序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG与CTGCTGCGTCCCGTAG分别与16S rDNA待扩增区域匹配，aggaagagag与cagtaatacgactcactatagggagaaggct是在上下游PCR引物上添加的额外序列，确保为了对PCR产物进行转录， SEQ ID No：1引物的5'端含有10bp的tag（aggaagagag），SEQ ID No：2引物的5'端含有31bp的tag（cagtaatacgactcactatagggagaaggct）。 

相关引物在生工生物工程（上海）有限公司进行合成。 

二、通用引物扩增 

对李斯特菌等细菌的DNA，使用ABI 9700型PCR仪，进行生物学实验操作。 

1、PCR 

（1）PCR的反应体系为：  

PCR反应缓冲液（10x PCR Buffer with 20mM MgCl₂）：0.5ul； 

dNTP mix（25mM each）：0.04ul； 

Taq酶（PCR Enzyme，5U/ul）：0.04ul； 

SEQ ID No：1（1μM）：1ul 

SEQ ID No：2（1μM）：1ul； 

细菌DNA：1ul；  

超纯水：1.42ul。 

以上试剂，除细菌DNA、超纯水、引物外，均来自于美国Sequenom公司。 

（2）PCR的循环参数为：  

95℃，4分钟，1个循环，  

95℃，20秒，56℃，30秒，72℃，60秒，45个循环，  

72℃，3分钟，1个循环， 

4℃，保存。 

2、SAP酶消化 

（1）SAP酶消化的反应体系为： 

在5ul的PCR产物中，加入RNase-free ddH₂O：1.7ul，SAP酶（SAP enzyme，1.7U/ul）：0.3ul。 

以上试剂均来自于美国Sequenom公司。 

（2）SAP酶消化的反应参数为： 

37℃，20分钟，1个循环，  

85℃，5分钟，1个循环， 

4℃，保存。 

3、转录和核酸酶切 

（1）转录和核酸酶切的反应体系为： 

取2ul的消化产物，加入： 

RNase-free ddH2O：3.21ul， 

5xT7 Polymerase Buffer：0.89μl 

T Cleavage Mix：0.22μl 

DTT（100mM）：0.22μl 

T7 RNA & DNA Polymerase：0.4μl 

RNaseA：0.06μl 

以上试剂，均来自于美国Sequenom公司。 

（2）转录和酶切的反应参数为：  

37℃，3h。  

4、纯化 

在7ul的转录和酶切产物中加入20ul超纯水，混匀后，再加入6mg树脂（resin，美国Sequenom公司），上下颠倒混匀15分钟。 

三、建立单个细菌李斯特菌(Listeria monocytogenes EGD-e)的核酸指纹特征图谱 

纯化后的产物使用纳升点样仪（Nanodispenser，美国Sequenom公司），点至含基质的芯片上（SpectroCHIP，美国Sequenom公司），并使用飞行时间质谱仪（美国Sequenom公司）进行检测和结果判断。 

通过实验结果可以看出，本方案所选的李斯特菌的16S rDNA的保守区域，经过生物学实验操作，在该菌产生了不同长度和不同丰度的核酸片段组合，经质谱检测，形成特异的核酸指纹图谱，检测结果经生物信息学分析，可进行相关细菌的分类与鉴定。 

重复两次，均得到相同的核酸指纹特征图谱（图1）。  

实施例二、小范围验证实施一的核酸指纹特征图谱的制备方法 

使用实施例一所述的方法以及引物，对醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus IFO 3283-01）、固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans ORS 571 chromosome）进行酶切和质谱鉴定。 

重复两次，均得到相同的核酸指纹特征图谱，其中图2、图3分别显示醋酸杆菌和固氮根瘤菌的核酸指纹特征图谱。  

实施例三、细菌的核酸指纹特征图谱库的建立 

根据实施例一所述的方法以及引物，对表1中所列的细菌进行酶切和质谱鉴定，得到所有细菌的核酸指纹特征图谱。 

将这些特征图谱，通过Bioexplore软件进行整合分析，从而得到包括绝大多数细菌在内的核酸指纹特征图谱库。 

如表2所示，图4-图100分别显示97种细菌的核酸指纹特征图谱。 

表2（注：表2为表1中的斜体内容） 

图101-103为羊种、牛种、猪种布鲁氏菌的核酸指纹特征图谱，图104为结核分枝杆菌的核酸指纹特征图谱，图105为幽门螺杆菌的核酸指纹特征图谱。 

实施例四、利用建立的细菌的核酸指纹特征图谱库，对医院的环境安全进行鉴定 

在疑似爆发婴幼儿发热症的某医院的水龙头、水沟等处，收集污染源样本，待测样本适度稀释后一分为二，其中对待测样本1根据实施例1的方法进行PCR扩增、酶切后，进行质谱检测，全过程耗时1-2小时。 

使用BioExplore软件（其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700），将所得的质谱特征图（图106）与实施三中获得的细菌核酸指纹特征图谱库进行比对，采用的判断标准是： 

当2.300≤匹配分数≤3.000，表示菌种鉴定的可信度很高；  

当2.000≤匹配分数＜2.300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；  

当1.700≤匹配分数＜2.000之间，表示可能的菌属鉴定；  

在0.000≤匹配分数＜1.700之间，表示不可信的鉴定。  

对比分析结果如下：  

待测样品图谱（图106）与实施例三所建立的图谱库中的图100相比，匹配分数为2.412，大于2.300，与预期值完全符合，表明该待测样品为自养黄杆菌（Xanthobacter autotrophicus Py2 chromosome），其鉴定结果的可信度很高。 

对照实验：待测样本2的生化方法的检测 

1、将待测样本进行镜检，呈现革兰氏染色阴性，菌体呈杆状或球杆状，无动力芽孢和荚膜。 

2、分离培养的待测样本2先用肉汤增菌培养，而后直接种于血琼脂或巧克力平板，35℃培养24小时，挑取可疑的淡黄色菌落进一步生化试验和镜检。 

3、生化反应表现为：氧化酶、触酶为阳性，能分解甘露糖，发酵糖的能力缓慢而稍弱，需氧生长，能水解七叶苷和液化明胶。增殖后的单一菌落呈淡黄色、圆形、直径约1-1.5mm，光滑、透明或半透明，稍凸，边缘整齐。上述反应都符合单增自养黄杆菌的生化特性，表明与MALDI TOF MS鉴定结果相一致。 

通过实施四的核酸指纹特征图谱法鉴定的结果表明，该公告场所存在黄杆菌的污染，需要对相应设施进行消毒处理，以防止公共场所爆发散发性传染。 

实施例五、利用建立的细菌的核酸指纹特征图谱库，对待检奶制品进行检测 

将待检奶制品适度稀释后一分为二，其中使用以下方式对待测样品1进行检测： 

一、以优化的CTAB-NaCl法提取牛奶样品的细菌染色体DNA，具体步骤如下：  

(1)取1.5mL奶制品，10,000r/min离心10min，弃上清；  

(2)用NET溶液(50mM NaCl，125mM EDTA，50mM Tris-HCl，pH7.6)悬浮沉淀至400μL，加200μL 10％(w/v)SDS溶液至终浓度3.4％(w/v)，置80℃水浴10min，冰上冷却3min；  

(3)分别加入3μL蛋白酶K(200 mg/mL)和RNaseA(200mg/mL)至终浓度1mg/mL，50℃水浴2h；  

(4)加100μL 5M NaCl溶液，混匀后加入300μL预热至65℃的含10％(w/v)CTAB和0.7M NaCl的CTAB-NaCl溶液(称取4.1g NaCl溶于80mL水中，缓慢加入10g CTAB，加热溶解，定容至100mL)，CTAB和NaCl在提取液中的终浓度分别为3.4％(w/v)和0.7M，65℃水浴10min；  

(5)加入600μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温震荡2min，10,000r/min离心5min；小心将上清转移到干净离心管中，加600μL氯仿∶异戊醇(24∶1)重复抽提1次；  

(6)在上清中加入2/3体积异丙醇，混匀，室温放置5min，10,000r/min离心10min，弃上清；沉淀用70％乙醇洗2次，37℃干燥10min；  

 (7)以5μL超纯水溶解DNA沉淀，用于PCR扩增。 

二、根据实施例1的方法进行PCR扩增、酶切后，进行质谱检测，全过程耗时1-2小时。 

使用BioExplore软件（其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700），将所得的质谱特征图107与实施三中获得的细菌核酸指纹特征图谱库进行比对，对比分析结果如下： 

待测样品图谱与本发明所建立的图谱库中的牛布鲁氏菌(Brucella abortus) (图102)的标准图谱相比，匹配分数为2.308，,大于2.300，报告为牛布鲁氏菌，与预期值完全符合，鉴定结果的可信度很高。 

实施例五的对照实验：待测样本1的生化方法的检测 

按照标准方法配制血清葡萄糖琼脂培养基SDA，并加入青霉素或头孢霉素（100μg/100ml）。 

选取待测鲜奶样品，吸取0.5ml样品，在无菌环境下涂布在预先制备的抗生素SDA培养皿中，在37℃下培养3天，观察菌落生长情况，结果如图4所示。 

图108显示，培养皿中生成湿润、闪光、无色透明、圆形、表面隆起、边缘整齐的小菌落。作为平行试验，选取0.5ml经过巴斯消毒法消毒的鲜奶样品作为对照，在SDA培养基上培养3天后无任何菌落生成。因此，抗生素SDA培养基中的菌落疑似为牛布鲁氏菌。 

为进一步鉴定该疑似菌落，使用柯氏染色法(沙黄与孔雀绿对染)染色法检测待测鲜奶样品。 

在无菌环境下，用无菌移液枪吸头挑取疑似菌落，置于10ml液体SDA培养基中，振荡混匀。 

吸取1ml样品，在无菌环境下涂布在预先制备的柯氏染色培养皿中，在37℃下培养3天，观察菌落生长情况，结果如图7所示。 

图109显示，疑似菌落在柯氏染色培养皿呈现红色小球杆菌状，且两端为钝圆形状，符合布鲁氏菌的生化特性。 

上述测试都符合布鲁氏菌的生化特性，表明与MALDI TOF MS鉴定结果相一致。 

实施例五的结果表明，该待检鲜奶制品所存在牛布鲁氏菌的污染，需要立即销毁，并对相关奶牛进行检疫处理。 

实施例六、利用建立的细菌的核酸指纹特征图谱库，对烧烤店肉制品进行检测 

在路边烧烤店的羊肉检材中，以无菌操作，称取剪碎后的瘦肉样品25 g，置于灭菌均质杯内，加入25 mL，缓冲胨水增菌液（青霉素100μg/100ml），以8000～10000r/min均质1min，移入盛有200 mL缓冲胨水增菌液的500mL广口瓶内，混合均匀，如pH低于6.6，用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液，调pH至6.8±0.2，于37℃水浴培养4h(以增菌液达到37℃时算起)，进行前增菌；其后，移取10mL转种于盛有100mLGN增菌液的250mL玻璃瓶内，摇匀，于42±1℃培养20±2h，进行选择性增菌（青霉素100μg/100ml）。必要时，同时另称取25g剪碎的瘦肉样品，加入25mLGN增菌液，同样进行均质。其后，移入盛有200mLGN增菌液的500mL广口瓶内（青霉素100μg/100ml），混合均匀，如pH低于6.6， 用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.8±0.2，于37℃培养24±2 h。而后将待检样本2一分为二，其中对待测样本2根据实施例1的方法进行PCR扩增、酶切后，进行质谱检测，全过程耗时1-2小时。 

使用BioExplore软件（其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700），将所得的质谱特征图（图110）与实施三中获得的细菌核酸指纹特征图谱库进行比对，对比分析结果如下：  

待测样品图谱与本发明所建立的图谱库中的羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）（图101）的标准图谱相比，匹配分数为2.420，大于2.300，报告为羊布鲁氏菌，与已知值完全符合，鉴定结果的可信度很高。 

实施例六的对照实验一：待测样本2的生化方法检测 

按照实施例五对照实验的方法，选取1ml待检样本2，在无菌环境下涂布在预先制备的柯氏染色培养皿中，在37℃下培养3天，观察菌落生长情况，结果如图111所示。 

因本实验中并非选用单一的菌落（如实施例五），且待检样品2中含有其他杂菌，因此图111显示在绿色杂菌周围，分布着圆状或球状红色单一菌落，这与羊布鲁氏菌的柯氏染色法结果完全一致。 

实施例六的对照实验二：待测样本2的分子生物学检测 

一、引物设计 

针对羊布鲁氏菌(Brucella abortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计的特异性PCR扩增用寡核苷酸引物： 

BP1：5’-CGT GCC GCA ATT ACC CTC-3’  

BP2：5’-CCG TCA GCT TGG CTT CGA-3  

二、PCR 

选取柯氏染色培养皿中单一红色菌落，常规方法增殖培养菌落，并提取细菌总DNA。 

按照以下参数进行PCR： 

反应条件为94℃ 10min，94℃ 1min，50℃1min，72℃2min，循环35次，72℃延伸10min。 

反应结束后，取反应产物5μl加在1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)板上，在TAE电泳液中电泳观察结果。 

三、结果和判定  

在 PCR 试验中同时设立阳性对照和空白对照，全部成立后对 PCR 检测结果进行判定：在被检样品道出现419bp扩增带者为布鲁氏菌感染阳性；在被检样品道没有出现419bp扩增带者为布鲁氏菌感染阴性，结果如图112所示：泳道1是DL 2000DNA Marker；泳道2和3是OMP  25扩增片段；泳道4是阴性对照。 

根据实施例六的结果，可以确定该烧烤店出售的羊肉鲜肉已被羊布鲁氏菌感染，需要立刻进行销毁，并对相关人员进行隔离治疗。 

实施例七、利用建立的结核分枝杆菌核酸指纹特征图谱库，对幼儿园的环境安全进行鉴定 

在疑似儿童肺结核传染源的某公共幼儿园的水龙头、水沟等处，收集污染源样本，待测样本适度稀释后一分为二，其中对待测样本1根据实施例1的方法进行PCR扩增、酶切后，进行质谱检测，全过程耗时1-2小时。 

使用BioExplore软件（其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700），将所得的质谱特征（图113）与实施三中获得的细菌核酸指纹特征图谱库进行比对，对比分析结果如下：  

待测样品图谱（图113）与本发明所建立的图谱库中的结核分枝杆菌的标准图谱104相比，匹配分数为2.470，大于2.300，报告为结核分枝杆菌，与已知值完全符合，鉴定结果的可信度很高。 

实施例七的对照实验：待测样本1的生化分析对照实验 

一、待测样本1的初步分析 

1、分离培养的待测样本1在罗氏固体培养基（包括马铃薯、孔雀绿等）上35℃培养2周，产生颗粒、或菜花状的乳白色菌落（见图114），挑取可疑的菌落进一步生化试验和镜检。 

2、将待测样本进行镜检，萋钠抗酸性涂片法呈现红色，菌体呈细长，端极钝圆，无动力芽孢和荚膜（图115）。 

由此，可初步确定待测样本为结核分枝杆菌。 

二、待测样本1的生化分析 

1、按以下配方配制结核分枝杆菌培养基： 

其中，培养基制作方法：先将蒸馏水与甘油混合后，再依次加入各成分，待溶解后以10％ HCl调ph值至6.6～6.8，高压0.7×105pa，20min灭菌。待冷却至56℃。，加入已除菌 小牛血清，混均，分装在培养皿中， 37℃无菌测定24h后，贮存4℃冰箱备用。 

另外，在无菌条件下，使用超微过滤的无菌注射器将利福平（100mg/L）加入已制的平板培养皿中，涂布均匀后，再于37℃无菌测定24h后。 

2、实验测试 

将实施例二中的待测样本1和空白对照（无菌水）制成菌悬液，取0.1ml，徐徐均匀地涂布于空白培养基和利福平培养基的培养皿上，置37℃恒温箱中，2周后报告结果。  

试验结果判定标准如下：  

(-) 培养基的平板无菌落生长；  

(+)菌落数约占 培养基的平板面积1/4；  

(++)菌落数约占 培养基的平板面积1/2；  

(+++)菌落数约占 培养基的平板面积3/4；  

(++++)菌落呈菌苔样生长。  

报告菌落数：当含药培养基 菌落数在20个以下时，报告菌落的个数。  

上述测试都符合结核分枝杆菌的生化特性，表明与MALDI TOF MS鉴定结果相一致。 

通过实施例七的结果表明，该公告场所存在结核分枝杆菌的污染，需要立即封园，且对相应设施进行消毒处理，以防止幼儿园爆发散发性传染。 

实施例八、利用建立的细菌的核酸指纹特征图谱库，对国境口岸疑似患者的快速检测 

在某机场入境口岸，对出现发热、剧烈咳嗽且X光肺部出现疑似结块的某外籍旅客，进行隔离后，选取其痰样5ml，加入50 ml无菌离心管中，加入等量NACL-NaOH溶液，旋涡震荡器振荡，充分液化痰标本，室温静置15min，加入0.067 mol/L PBS溶液，充分混匀以中和消化液作用，3 000 g离心15 min，小心弃上清，沉淀物中加入0.067mol/LPBS约2ml重新混匀，即为消化后的痰待测样本2。 

将待检样本一分为二，其中对待测样本2根据实施例1的方法进行PCR扩增、酶切后，进行质谱检测，全过程耗时1-2小时。 

使用BioExplore软件（其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700），将所得的质谱特征图（图116）与本发明所建立的图谱库中的结核分枝杆菌的标准图谱104相比，对比分析结果匹配分数为2.380，大于2.300，报告为结核分枝杆菌，与已知值完全符合，鉴定结果的可信度很高。由此判定该旅客为结核分枝杆菌阳性患者。 

实施例八的对照实验：待测样本2的荧光定量PCR检测 

将消化处理后的痰液标本加入4倍体积的4%NaOH，液化30min左右，取0.5ml至离心管中，加入0.5ml 4%NaOH，10min后10000 r/min离心5 min。去上清，沉淀加无菌生理盐水1ml混匀，10000r/min离心5min，重复洗涤1次。沉淀加50μlDNA提取液混匀，沸水浴10min，转至4℃静置6-8h以保证充分裂解。10000r/min离心5min，取上清液2μl做扩增，93℃2min预变性、93℃45s、55℃60s扩增10个循环、93℃30s、55℃45s、扩增30个循环。 

另取阴性质控品、阳性质控品各40μl加等量DNA提取液混匀，沸水浴10min处理。根据检测试剂说明书的结果判断标准进行结果分析，结果如图117所示。 

根据实施例八的结果，可以确诊该旅客为肺结核患者，需要对其进行隔离治疗。  

实施例九、利用建立的结核分枝杆菌核酸指纹特征图谱库，对水源地的安全进行鉴定 

在疑似幽门螺杆菌传染源的某自来水厂的水源地，收集污染源样本，待测样本适度稀释后一分为二，其中对待测样本1根据实施例1的方法进行PCR扩增、酶切后，进行质谱检测，全过程耗时1-2小时。 

使用BioExplore软件（其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700），将所得的质谱特征（图118）与实施三中获得的细菌核酸指纹特征图谱库进行比对，对比分析结果如下： 待测样品图谱分与本发明所建立的图谱库中的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的标准图谱105相比，匹配分数为2.340，大于2.300，报告为幽门螺杆菌，与已知值完全符合，鉴定结果的可信度很高。 

实施例九的对照实验：待测样本1的生化分析对照实验 

一、待测样本1的生化分析 

1、按以下配方配制幽门螺杆菌分离培养基： 

在无菌条件下，在预制的脑心浸出液琼脂 (购自于Difco)液体培养基150ml中，加入脱纤维羊血8ml，并加入混合抗生素（万古霉素 10mg/L、三甲氧苄胺嘧啶乳酸盐 0.005mg/L、两性霉素B 10mg/L、多粘菌素B 0.005mg/L），调节pH为7.5，然后倒入多个培养皿中，制备幽门螺杆菌分离培养基。 

同时设置对照培养基（即抗生素替换为阿莫西林 10mg/L、左氧氟沙星2mg/L） 

3、实验测试 

将实施例二中的待测样本1和空白对照（无菌水）制成菌悬液，取0.1ml，徐徐均匀地涂布于分离培养基和对照培养基的培养皿上，置37℃恒温箱中，3天后报告结果。  

试验结果判定标准如下：  

(-) 培养基的平板无菌落生长；  

(+)菌落数约占 培养基的平板面积1/4；  

(++)菌落数约占 培养基的平板面积1/2；  

(+++)菌落数约占 培养基的平板面积3/4；  

(++++)菌落呈菌苔样生长。  

(+-)细菌可疑生长 

报告菌落数：当含药培养基 菌落数在20个以下时，报告菌落的个数。  

4、使用碱性品红法，从分离培养基上挑取单个菌落，染色处理后进行镜检。 

显微镜下显示该菌为红色弯曲杆状或螺旋状，且背景为白色，对比度清晰（参见图119）。 

上述测试都符合幽门螺杆菌的生化特性，表明与MALDI TOF MS鉴定结果相一致。 

实施例九的结果表明，该自来水厂的水源地已经被幽门螺杆菌的污染，需要对该水源地进行卫生消毒，除去周边粪便、牲畜、排泄物的污染源。 

实施例十、利用建立的细菌的核酸指纹特征图谱库，对待检鲜奶进行检测 

根据田雨等人（《乳业科学与技术》，2006年）的报道，使用优化CTAB-NaCl法提取鲜奶中的细菌DNA，并根据实施例1的方法进行PCR扩增、酶切后，进行质谱检测，全过程 耗时1-2小时。 

使用BioExplore软件（其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700），将所得的质谱特征（图120）与实施三中获得的细菌核酸指纹特征图谱库进行比对，对比分析结果如下：  

待测样品图谱（图120）与本发明所建立的图谱库中的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）的标准图谱105相比，匹配分数为2.470，大于2.300，报告为幽门螺杆菌，与已知值完全符合，鉴定结果的可信度很高。 

实施例十的对照实验：鲜奶的分子生物学检测 

根据幽门螺杆菌尿素酶基因，在Genebank 中检索到1 个基因序列(Accession M60398)。根据基因序列设计如下引物，以扩增约250bp的片段： 

正向引物：5＇-AAGCTTTTAGGGGTGTTAGGGGTTT-3＇； 

反向引物：5＇-CAAGCCATCGCCGG TTTTAGC-3＇ 

设置幽门螺杆菌标准菌株液和无菌鲜奶标准对照，进行PCR扩增。 

PCR反应体系： 

反应条件： 

5℃预变性2mi n ；94℃变性1min，61℃退火20s，72℃延伸30s，35 个循环； 

72℃延伸5mi n 。 

将扩增产物进行凝胶电泳，结果如下表和图121所示 

泳道	测试样品	目的片段
			1	10 ml标准菌液	++
2	10ml待测鲜奶	+
			3	10ml待测鲜奶	+
4	9ml鲜奶+1ml标准菌液	+
			5	10ml无菌鲜奶对照	-

通过实施十的核酸指纹特征图谱法鉴定和PCR检测方法，可以确定该鲜奶已被幽门螺杆菌，需要立刻进行销毁，并彻查相关病源。 

实施例十一、利用建立的细菌核酸指纹特征图谱，用于不同细菌分离株的遗传进化树的建立以及分类 

利用已有的细菌核酸指纹特征图谱库，提取其中核酸酶切信息，利用Clustalx2.0及MEGA4.1软件构建所述841种细菌种属的遗传进化树或系统发育树（图122）。在进化树上可以直观的观察到各种菌属不同种及不同分离株的进化关系，同时可以明确判断出待测菌株与该属各菌的进化关系。另外，系统发育树的建立也可以验证BE软件的分析结果，进一步证明细菌鉴定的准确性。 

例如，自口腔中分离得到一株链球菌，根据前述实施例的方法，将其图谱（图123）分别与本发明所建立的图谱库中相比，结果表明其与血链球菌（Streptococcus parasanguinis ATCC 15912）的标准图谱比对，匹配分数大于2.300，报告为血链球菌，与已知值完全符合，鉴定结果的可信度很高。 

根据系统发育树也验证了待测菌属于链球菌属，同时与血链球菌（Streptococcus parasanguinis ATCC 15912）的亲缘关系最近。 

  SEQUENCE LISTING

 

<110>  向华

 

<120>  基于16S rDNA的细菌核酸指纹特征谱的制备方法及其用途

 

<130>  2012

 

<160>  7    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

aggaagagag agagtttgat cctggctcag                                        30

 

 

<210>  2

<211>  47

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tctgctgcgt cccgtag                     47

 

 

<210>  3

<211>  358

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct       60

 

caggtcggct atgcatcgtt gccttggtag gccattaccc taccaactag ctaatgcacc      120

 

gcgggcccat ctgtaagcga tagccgaaac catctttcaa aagcgtggca tgcgccacac      180

 

tttatcattc ggtattagcc ccggtttccc ggagttatcc ccaacttaca ggcaggttgc      240

 

ccacgtgtta ctcacccgtc cgccactaac tttggaagag caagctcttc ctccgttcgt      300

 

tcgacttgca tgtattaggc acgccgccag cgttcgtcct gagccaggat caaactct        358

 

 

<210>  4

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cgtgccgcaa ttaccctc                                                     18

 

 

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ccgtcagctt ggcttcga                                                     18

 

 

<210>  6

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

aagcttttag gggtgttagg ggttt                                             25

 

 

<210>  7

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

caagccatcg ccggttttag c                                                 21

Claims (11)

1.一种基于细菌16S DNA的核酸指纹图谱制备方法，其特征在于，它至少包括如下步骤：

（1）PCR反应：使用针对细菌16S rDNA的PCR通用引物，分别扩增多个细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物；

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤（2）得到的各个细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到不同细菌的特征核酸指纹谱图。

2.根据权利要求1的方法，其中细菌16S rDNA区域选自SEQ ID NO:3所示的区域，或者与SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的序列，在其中的优选实施方案中，优选该序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的序列；通用引物包括但不限于SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟；所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述细菌包括如表1所列的836种细菌。

5.在上述任一方案中，其中所述细菌还包括布鲁氏菌(Brucella)、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis），以及幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）。

6.利用权利要求1的方法用于建立细菌核酸指纹特征图谱库的方法，至少包括：上述步骤1-5，和；

(6)将步骤5得到的各种细菌16S rDNA的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到所述的细菌核酸指纹特征图谱库。

7.权利要求7的方法，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700。

8.利用权利要求5或6的方法所建立的细菌核酸指纹特征图谱，用于细菌鉴定或分类的方法，包括：

（1）PCR反应：使用针对细菌的PCR通用引物，扩增待测细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物；

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该细菌的核酸指纹特征图谱；

（6）将所得核酸指纹特征图谱与细菌核酸指纹特征图谱库进行比较，从而判断待测细菌的类别或种属。

9.权利要求7的方法，其中步骤6通过BioExplore软件进行比较检测。

10.提供能用于细菌分类和鉴定、耐药筛选用途的试剂盒，包括：

（1）用于扩增细菌16S rDNA的通用引物对及其缓冲液；

（2）SAP酶及其缓冲液；

（3）RNAase及其缓冲液；

（4）用于纯化酶切产物的树脂；

（5）用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。

11.权利要求9的试剂盒，其中所述引物是SEQ ID NO:1-2，所述软件是BioExplore软件，所述细菌16S rDNA区域选自SEQ ID NO:3所示的区域。

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