CN102851362B - 一种基于质谱技术快速鉴定布鲁氏菌的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

一种基于质谱技术快速鉴定布鲁氏菌的方法及其用途，本发明公开了一种用于快速鉴定布鲁氏菌的方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。基于该方法，建立常见布鲁氏菌的核酸指纹图谱数据库。根据实验产生的质谱峰图，可对待检样品中的布鲁氏菌进行分类与鉴定，结果可广泛运用于布鲁氏菌的分型和分类、及环境卫生和公共安全检疫等领域。

Description

一种基于质谱技术快速鉴定布鲁氏菌的方法及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种布鲁氏菌核酸指纹图谱制备的方法，以及使用该方法，对布鲁氏菌进行快速鉴定的方法。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)又称地中海弛张热，马尔他热，波浪热或波状热，是由布鲁氏菌引起的人畜共患性全身传染病，主要通过皮肤、黏膜、消化道和呼吸道感染，尤其以感染羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌最为严重。猪种布鲁氏菌感染人较少见，犬种布鲁氏菌感染人罕见，绵羊附睾种布鲁氏菌、沙林鼠种布鲁氏菌基本不感染人。其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等。1886年英国军医Bruce在马尔他岛从死于“马尔他热”的士兵脾脏中分离出“布鲁氏菌”，首次明确了该病的病原体。1897年Wright与其同事发现病人血清与布鲁氏菌的培养物可发生凝集反应，称为Wright凝集反应，从而建立了迄今仍用的血清学诊断方法。我国古代医籍中对本病虽有描述，但直到1905年Boone于重庆对本病作正式报道。目前该病在世界分布，只有几个国家消灭此病，而在中国的东北，华北，西北一带有流行和分布，其它地区有散发，且日益广泛和危害严重。对畜牧业和人类来严重经济损失。

布鲁氏菌是一类革兰阴性的短小杆菌，两端钝圆，偶见两极浓染，一般长0.4-1.5um，宽0.4～0.8um，羊种布鲁氏菌较小，长0.3～0.6um，近似球状，猪种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌呈杆状。通常呈散在状态.很少成对或短链状排列。该菌无鞭毛，无芽孢.光滑型有荚膜。常在细胞内寄生。内毒素是重要的致病物质。布鲁氏菌有强侵袭力，细菌可通过完整皮肤和粘膜进入宿主。布鲁氏菌有6个生物型，我国流行的是羊布鲁氏菌，牛布鲁氏菌和猪布鲁氏菌三种，其中以羊布鲁氏菌最常见。自然情况下，有60多种动物可感染布鲁氏菌，其主要是山羊，绵羊，牛和猪，以流产为主，孕期动物最为宜感。人类对布鲁氏菌易感，细菌进入人体后，迁延不愈，反复发作，发热呈波浪式，如不治疗，后果严重。

布鲁氏菌是需氧菌.营养要求较高，需硫胺素.烟酸胺和酵母生长素。葡萄糖.甘油和复合氨基酸可促进布鲁氏菌的生长：泛酸钙和赤鲜醇也可促进某些布鲁氏菌的生长；来自人或动物的标本最好接种在胰酶消化液或血液培养基中。在固体培养基上，菌落为无色.半透明.圆形.表面光滑.边缘整齐.中央稍凸起.直径约2～3mm。有时可出现黏液样或干燥的硬皮样菌落；在血琼脂平板上，表现不溶血。在液体培养基中，呈均匀混浊生长，不形成菌膜；在柯氏染色法(沙黄与孔雀绿对染)培养基上，该菌为鲜红色，其它杂菌被染成绿色。该菌对磺胺及链霉京.四环素、庆大霉索等均较敏感，面对青霉素及头孢菌素则不敏感。根据临床症状、流行病学特点以及布鲁斯菌以上生化特性，不难做出布鲁氏菌病的初步诊断，但由于在临床上小肠结肠炎耶氏菌、乙型副伤寒杆菌、大肠杆菌O:157感染存在相似的症状，必须借助实验室诊断技术才能对布鲁氏菌病进行最后确诊。为了建立适合本病诊断和流行病学调查的快速、敏感、特异、准确的方法，国内外许多学者进行了大量研究，并取得了显著的成绩。先后建立了病原鉴定、荧光抗体中和检等检测方法。我国目前应用虎红和试管凝集的方法，它们的敏感性及特异性差，是国际贸易淘汰的技术，且反应时间较长，与我国实际检测普查工作需求存在一定的矛盾。

目前布鲁氏菌病的诊断主要依靠针对脂多糖的血清学试验，特异性不强，常常出现假阳性结果。而且，由于布病感染后2周血中才开始出现抗体，所以感染早期血清学诊断往往出现假阴性的结果。以PCR为基础的核酸检测方法，对布病的早期诊断和传染源的发现有重要意义。单重PCR检测，当引物针对的序列发生了突变时则可能出现假阴性结果。而针对同种病原的多重PCR检测，因为针对的是多个基因，虽假阴性率降低，但操作比较复杂。

近年来，已经出现质谱技术来检测核酸和蛋白质领域，其中质谱技术应用于核酸检测领域的理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次为271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da（其中ddTMP是经过修饰的），它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点（SNP）、插入/缺失（InDel）、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化（copy number variation，CNV）等多种DNA变化类型进行检测。

已有一些公开文献使用质谱技术对微生物进行分类和鉴定，例如，中国专利申请CN102337223A、“产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制备方法”，公开了一种检测产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-TOF鉴定方法，其中从平板上挑取产黄青霉A096孢子接种于SGY液体培养基培养，预处理得到粗蛋白溶液在色谱柱上分离纯化，并在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，各组分离心超滤浓缩至所需体积，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分判断获得蛋白的纯度；割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，进行MALDI-TOF鉴定。该方法仅适用于特定微生物，且需要多重蛋白纯化过程，最终用MALDI-TOF鉴定特征蛋白Pc-Arctin，其过程繁琐、适用面窄，不能实现质谱分类细菌或微生物的目的。

中国专利申请200910157210、“一种李斯特菌属细胞中脂肪酸组分的分析方法”公开了一种利用气相色谱质谱(GC-MS)分析法针对细菌脂肪酸进行分类的方法，包括：李斯特菌复壮，用牛津琼脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂平板分别分离和纯化李斯特菌，培养单个典型菌落的李斯特菌并制成菌悬液，用甲醛灭活处理，把经甲醛处理后的菌悬液平均分装在离心管洗涤，用盐酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸进行气相色谱质谱(GC-MS)分析。虽然该方法打破传统细菌分类学的局限，减少人为因素对传统形态分类带来的误差，同时为新的菌种和毒种的分类鉴定提供强有力的工具，但该法仍然属于利用质谱法进行细胞化学分析分类，并未针对核酸进行检测。

国际专利申请WO2010/021548、“Method for identifying biological material e.g.bacteria insample of patient,involves separating stream of liquid containing sample into successive portionsto form flying drops and ionizing flying drops to measure mass spectra”，公开了一种使用MALDI-MS(基质辅助激光解吸和电离质谱)用于识别生物材料的方法和装置，包括准备包含试样和MALDI基质材料的液体，并将其用于形成液体的连续流束。将该流束分散成接连的部分，以形成发射到飞行中的液滴，或将流束发射到飞行中，然后分散成液滴。可使用从喷墨印刷机中已知的液滴形成技术。对飞行中的液滴电离出材料。测量来自各个液滴的电离材料的质谱。但该方法目的在于如何改善MALDI-MS检测生物物质的灵敏度，并不涉及质谱鉴定和分类任意微生物，因此也不能解决上述技术问题。

由于质谱技术检测细菌存在着难以确定标准质谱特征图谱的问题。也就是说，尽管不同细菌之间的基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱，但如果没有建立标准的质谱图谱数据库，则因为出现每次质谱检测细菌的结果因待检的基因组过于庞大而缺乏重复性，导致准确度下降。

例如，朱健等人（“高效液相色谱-电喷雾多级质谱法对格尔德霉素粗品中各组分的初步判别及分类”，《中国抗生素》，2011年03期）报道了应用高效液相色谱-电喷雾多级质谱法(LC-ESI-MSn)对格尔德霉素(GDM)粗品中各组分进行与质量数相关的结构信息方面的初步判别及分类。该方法针对格尔德霉素(GDM)中不同组分的多级质谱碎片进行的分析整理，并对各种化合物进行了准确分类，但并不涉及针对细菌特定物质（如核酸）进行检测从而对细菌进行分类的方法。

刘海洪（“MALDI TOF MS在细菌检测和鉴定中的应用”，《微生物学免疫学进展》，2003年02期）报道了“细菌体内含有大量的生物标志分子能用于细菌的化学分类和鉴定，针对如根据细菌的组成成分获得指纹图谱检测和鉴定细菌”，并对该方法预测其理论上的可行性。然而，该研究仅仅是理论上探讨了利用MALDI TOF MS对细菌进行分类的方向，其既没有指明所针对细菌的何种组分进行检测，也没有说明具体研究方法和过程。由于细菌中可用于分类的组分（如蛋白、DNA、RNA、多糖等）种类太多，且质谱技术针对不同待测物也存在各种实验参数的组合和选择，因此在此之后的近10年内并没有利用MALDI TOF MS进行细菌鉴定的新的报道。

中国专利申请201110154723、“MALDI TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS辅助鉴定霍乱弧菌的方法”公开了一种利用MALDI TOFMS技术辅助鉴定细菌的方法，包括：预处理细菌培养物，采集所有菌株样品的MALDI TOFMS图谱，根据软件制备细菌标准图谱，使用相同的方法检测并采集待测细菌的图谱，以及比较二者图谱，根据匹配分数进行判定。由于该方法使用常规的处理（通过无水乙醇、甲酸和乙腈处理，并辅以离心，最后吸取上清液进行检测），尽管其在一定程度上能表征该细菌的特征图谱，但由于其待测物中含有蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体细菌而无法推广到其他大量的细菌检测中。

由于质谱技术检测细菌存在的上述缺陷，导致目前使用质谱技术检测细菌甚至布鲁氏菌一直没有进展。作为最接近的现有技术，顾超慧等人（“蛋白质组学在布鲁氏菌病研究中的应用”，《疾病监测》第24卷第5期，2009）和王玉飞等人（“羊布鲁氏菌的分泌蛋白质组分析”，《微生物学通报》，第36卷第8期，2009）报道了利用质谱技术分析羊布鲁氏菌分泌蛋白的指纹图谱，并根据NCBI数据库的相关蛋白序列库进行比对分析，从而鉴定布鲁氏菌的蛋白。然而该方法仍然停留在对布鲁氏菌的特征蛋白的分析上，并不涉及如何建立布鲁氏菌相关核酸质谱特征库并利用该库进行细菌鉴定、分型的用途，因此也无法解决上述问题。

因此目前需要新的布鲁氏菌的鉴定和分析方法（如质谱法）来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。

发明内容

本发明原理在于：组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，对布鲁氏菌基因组DNA上某个或某几个片段进行PCR和酶切后，将产生分子量和丰度各异的片段，使用质谱检测可产生核酸指纹图谱，不同布鲁氏菌之间基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱，建立数据库后，可以实验结果与数据库中布鲁氏菌标准图谱信息进行比对，即可完成对布鲁氏菌的鉴定。因此，针对布鲁氏菌属不同菌种的特定区域的DNA设计合适的引物进行PCR扩增，然后将PCR产物通过特定内切酶进行消化，产生一系列长度不一丰度不一的核酸片段，并通过MALDI-TOF MS质谱进行核酸分析检测，并形成谱图。对布鲁氏菌目标基因序列进行扩增后酶切，得到布鲁氏菌属不同菌种的图谱。可以实验结果与数据库中布鲁氏菌属标准图谱信息进行比对，即可完成对布鲁氏菌的分类和鉴定（鉴定、分型、分类等）。此方法具有特异性强，灵敏度高，成本低，操作简便，用时少等优势。

因此，本发明第一目的是提供一种基于酶切的布鲁氏菌属核酸指纹图谱制备方法。其特征在于，它至少包括如下步骤：

（1）PCR反应：使用针对细菌的PCR通用引物，分别扩增多个细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物；

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤（2）得到的各个细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到不同布鲁氏菌的特征核酸指纹谱图。

在一个实施方案中，PCR反应所扩增的细菌核酸序列，包括但不限定于布鲁氏菌DNA基因组上一个区域。

在一个实施方案中，所述通用引物包括但不限于SEQ ID No：1至SEQ ID No：2所示序列。

在另一实施方案中，步骤3所述的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。在一个具体实施方案中，步骤5的纯化包括在转录和酶切产物中加入超纯水，混匀后，再加入树脂，上下颠倒混匀15分钟。在另一个具体实施方案中，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪。

上述任一方案中，其中所述细菌包括但不限于羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）、牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)及猪种布鲁氏菌（Brucella suis）。

本发明的第二目的是建立布鲁氏菌属的标准图谱库，至少包括：上述步骤1-5，和；

（6）将步骤5得到的不同分离株的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到布鲁氏菌的标准核酸指纹特征图谱。

在一个实施方案中，所述软件是发明人自行研究开发的BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号、登记号2009SR10700。

本发明的第三目的是提供一种快速鉴定布鲁氏菌的方法，包括：

（1）PCR反应：使用针对布鲁氏菌的PCR通用引物，扩增待测菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物；

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该菌的核酸指纹特征图谱；

（6）将所得核酸指纹特征图谱与库中布鲁氏菌核酸指纹特征图谱进行比较，从而判断待测细菌的种属。

本发明的第四目的是提供能用于布鲁氏菌分类和鉴定、临床检验的试剂盒，包括：

（1）用于扩增细菌DNA的通用引物对及其缓冲液；

（2）SAP酶及其缓冲液；

（3）RNAase及其缓冲液；

（4）用于纯化酶切产物的树脂；

（5）用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件。

在一个实施方案中，其中所述引物是SEQ ID NO:1-2。

在另一实施方案中，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为（软著登字第136879号、登记号2009SR10700）。

定义

本发明所述的“细菌或布鲁氏菌分类和鉴定”，包括对细菌进行鉴定和识别、分型、分种、分类。例如在食品安全检测中（如奶制品、肉制品），通过布鲁氏菌分类或鉴定，能准确识别传染源和细菌组成，以备采用合理措施进行保障食品安全。又如，在研究细菌的进化中，通过对布鲁氏菌的识别和分类/分型，能够确定各种布鲁氏菌种属之间的亲缘远近关系。

本发明所述的布鲁氏菌DNA基因组上一个区域，优选是具有高度保守同时又具有一定多态性的区域。本发明所述的保守区域或保守片段，优选是布鲁氏菌rRNA区域。rRNA是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标，它含量达80%，并存在于所有细菌中，rRNA基因由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。

目前以16S rDNA进行布鲁氏菌分类和鉴定的方法主要是采用PCR产物直接测序，结果与数据库进行比对的方法。测序法应用于临床检测，目前存在如下问题：（1）成本高；（2）耗时；（3）对于混合样本，测序易产生套峰，难以进行有效区分；（4）16S rDNA全长1.5kb以上，一般需要经过两次测序并将结果进行拼接，在这个过程中易引入误差。

如前所述，16S rDNA对布鲁氏菌分类鉴定具有重要的意义，但是传统测序等方法检测成本高、耗时长；对于混合感染的样品，测序法将得到混合的序列峰图，难以进行有效的区分，并且利用质谱进行待测物分析，需要选择合适的待测物和优化质谱参数，因此目前需要新的细菌分类技术（如质谱法）来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。

本发明所述的“通用引物”是能位于各种细菌基因组的待扩增区域的上下游，能在不同细菌基因组中扩增相应片段的引物。其中，本发明所述的基因组上的待扩增区域选自与SEQ IDNO:3所示序列具有至少60%同源性的序列，优选该序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的序列。由于对于细菌DNA（例如16S rDNA）而言，其序列通常由保守区和可变区组成，且可变区多为不连续或短片段甚至SNP形式夹杂在保守区中间或两端，因此使用通用引物即能在不同细菌基因组中扩增相应片段。因各种细菌的该片段均具有一定同源性，故在与SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的片段中，经过酶切和质谱后能得到待测细菌的核酸指纹特征图谱。

在一个实施方案中，羊种布鲁氏菌16S rDNA的特定区域是16S rDNA序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCATTTGCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAATGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG，即SEQ ID NO:3。在一个具体实施方案中，该特定区域的引物是SEQ ID No：1和SEQ ID No：2。

有益效果

1、本发明基于质谱检测技术，由于质谱检测的高灵敏性，使用本方案对布鲁氏菌存在与否的检测下限能够远超出其他技术方案；

2、对于不同的样本，本发明可比对它们产生的核酸指纹图谱，将实验产生的核酸指纹图谱与数据库中布鲁氏菌标准菌株的图谱进行对比，经生物信息学分析，可以判断该菌是否为布鲁氏菌分离株；

3、使用本方案可以进行布鲁氏菌的分类与鉴定，并可用于临床检验等方面。

4、相对于现有技术，全过程仅仅数小时内完成，省时省力；

5、本发明的数据库是开放式的，可不断补充新的分离株，不断完善和扩大数据库，以便更为准确的完成布鲁氏菌的鉴定；

6、另外，本发明首次提出将布鲁氏菌的16S rDNA区域作为待测物进行质谱检测，以获得不同布鲁氏菌种的核酸指纹图谱，用于布鲁氏菌的分类与鉴定。

附图说明

图1、2为羊种布鲁氏菌的核酸指纹特征图谱。

图3为牛种布鲁氏菌的核酸指纹特征图谱。

图4为猪种布鲁氏菌的核酸指纹特征图谱。

图5为待测样品1的核酸指纹特征图谱。

图6为牛布鲁氏菌在抗生素SDA培养基上菌落形态图。

图7为牛布鲁氏菌在柯氏染色培养上菌落形态图。

图8为待测样品2的核酸指纹特征图谱。

图9为羊布鲁氏菌在柯氏染色培养上菌落形态图。

图10为待测样品2的电泳检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例一：羊种布鲁氏菌核酸指纹图谱的建立

一、设计并选择合适引物

根据羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)的16S基因序列，设计PCR引物，分别为：

SEQ ID No：1	5-cagtaatacgactcactatagggagaaggctAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3（SEQ ID No：1）
		SEQ ID No：2	5-aggaagagagCTGCTGCGTCCCGTAG-3（SEQ ID No：2）

其中序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG与CTGCTGCGTCCCGTAG分别与目标区域匹配，cagtaatacgactcactatagggagaaggct与aggaagagag是在上下游PCR引物上添加的额外序列，确保为了对PCR产物进行转录，SEQ ID No：1引物的5'端含有31bp的tag（cagtaatacgactcactatagggagaaggct），SEQ ID No：2引物的5'端含有10bp的tag（aggaagagag）。

相关引物在生工生物工程（上海）有限公司进行合成。

二、通用引物扩增

对布鲁氏菌的DNA，使用ABI9700型PCR仪，进行生物学实验操作。

1.PCR扩增

（1）PCR的反应体系为：

PCR反应缓冲液（10x PCR Buffer with20mM MgCl2）	0.5ul
		dNTP mix（25mM each）	0.04ul
Taq酶（PCR Enzyme，5U/ul）	0.04ul
		SEQ ID No：1（1μM）	1ul
SEQ ID No：2（1μM）	1ul
		细菌DNA	1ul
超纯水	1.42ul

以上试剂，除细菌DNA、超纯水、引物外，均来自于美国Sequenom公司。

（2）PCR的循环参数为：95℃，4分钟，1个循环，95℃，20秒，56℃，30秒，72℃，60秒，45个循环，72℃，3分钟，1个循环，

4℃，保存。

2.SAP酶消化

（1）SAP酶消化的反应体系为：

在5ul的PCR产物中，加入RNase-free ddH2O：1.7ul，SAP酶（SAP enzyme，1.7U/ul）：0.3ul。

以上试剂均来自于美国Sequenom公司。

（2）SAP酶消化的反应参数为：

37℃，20分钟，1个循环，85℃，5分钟，1个循环，

4℃，保存。

3.转录和核酸酶切

（1）转录和核酸酶切的反应体系为：

取2ul的消化产物，加入：

RNase-free ddH2O	0.5ul
		5xT7Polymerase Buffer	0.04ul
T Cleavage Mix	0.04ul
		DTT（100mM）	1ul
T7RNA&DNA Polymerase	1ul
		RNaseA	1ul

以上试剂，均来自于美国Sequenom公司。

（2）转录和酶切的反应参数为：37℃，3h。4.纯化

在7ul的转录和酶切产物中加入20ul超纯水，混匀后，再加入6mg树脂（resin，美国Sequenom公司），上下颠倒混匀15分钟。

三、建立单个布鲁氏菌核酸指纹图谱

纯化后的产物使用纳升点样仪（Nanodispenser，美国Sequenom公司），点至含基质的芯片上（SpectroCHIP，美国Sequenom公司），并使用飞行时间质谱仪（美国Sequenom公司）进行检测和结果判断。

由实验结果可以看出，本实施方案所选的羊布鲁氏菌16S基因序列的目标区域，经过生物学实验操作，产生了不同长度和不同丰度的核酸片段组合，经质谱检测，形成特异的核酸指纹图谱，检测结果经生物信息学分析，可用于对布鲁氏菌进行检测。图1和图2为重复实验得到的相同的核酸指纹图谱。

图1和图2为重复实验得到的相同的核酸指纹图谱。

因牛、猪布鲁氏菌的核酸指纹图谱的建立方法与实施例1相同，故省略过程。牛、猪布鲁氏菌的核酸指纹图谱如图3、图4所示。

实施例二、利用建立的细菌的核酸指纹特征图谱库，对待检奶制品进行检测

将待检鲜奶样品适度稀释后一分为二，其中使用以下方式对待测样品1进行检测：

一、以优化的CTAB-NaCl法提取牛奶样品的细菌染色体DNA，具体步骤如下：

(1)取1.5mL新鲜牛奶样品，10,000r/min离心10min，弃上清；

(2)用NET溶液(50mM NaCl，125mM EDTA，50mM Tris-HCl，pH7.6)悬浮沉淀至400μL，加200μL10％(w/v)SDS溶液至终浓度3.4％(w/v)，置80℃水浴10min，冰上冷却3min；

(3)分别加入3μL蛋白酶K(200mg/mL)和RNaseA(200mg/mL)至终浓度1mg/mL，50℃水浴2h；

(4)加100μL5M NaCl溶液，混匀后加入300μL预热至65℃的含10％(w/v)CTAB和0.7MNaCl的CTAB-NaCl溶液(称取4.1g NaCl溶于80mL水中，缓慢加入10g CTAB，加热溶解，定容至100mL)，CTAB和NaCl在提取液中的终浓度分别为3.4％(w/v)和0.7M，65℃水浴10min；

(5)加入600μL氯仿∶异戊醇(24∶1)，室温震荡2min，10,000r/min离心5min；小心将上清转移到干净离心管中，加600μL氯仿∶异戊醇(24∶1)重复抽提1次；

(6)在上清中加入2/3体积异丙醇，混匀，室温放置5min，10,000r/min离心10min，弃上清；沉淀用70％乙醇洗2次，37℃干燥10min；

(7)以5μL超纯水溶解DNA沉淀，用于PCR扩增。

二、根据实施例1的方法进行PCR扩增、酶切后，进行质谱检测，全过程耗时1-2小时。

将所得的质谱特征图5与实施三中获得的细菌核酸指纹特征图谱库进行比对，采用的判断标准是：

当2.300≤匹配分数≤3.000，表示菌种鉴定的可信度很高；

当2.000≤匹配分数＜2.300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；

当1.700≤匹配分数＜2.000之间，表示可能的菌属鉴定；

在0.000≤匹配分数＜1.700之间，表示不可信的鉴定。

对比分析结果如下：

待测样品图谱分别与本发明所建立的图谱库中的牛布鲁氏菌(Brucella abortus)的标准图谱比对，匹配分数为2.308，,大于2.300，报告为牛布鲁氏菌，与已知值完全符合，鉴定结果的可信度很高。

实施例三：待测样本1的生化分析对照实验

按照标准方法配制血清葡萄糖琼脂培养基SDA，并加入青霉素或头孢霉素（100μg/100ml）。

选取待测鲜奶样品，吸取0.5ml样品，在无菌环境下涂布在预先制备的抗生素SDA培养皿中，在37℃下培养3天，观察菌落生长情况，结果如图4所示。

图6显示，培养皿中生成湿润、闪光、无色透明、圆形、表面隆起、边缘整齐的小菌落。作为平行试验，选取0.5ml经过巴斯消毒法消毒的鲜奶样品作为对照，在SDA培养基上培养3天后无任何菌落生成。因此，抗生素SDA培养基中的菌落疑似为牛布鲁氏菌。

为进一步鉴定该疑似菌落，使用柯氏染色法(沙黄与孔雀绿对染)染色法检测待测鲜奶样品。

在无菌环境下，用无菌移液枪吸头挑取疑似菌落，置于10ml液体SDA培养基中，振荡混匀。

吸取1ml样品，在无菌环境下涂布在预先制备的柯氏染色培养皿中，在37℃下培养3天，观察菌落生长情况，结果如图7所示。

图7显示，疑似菌落在柯氏染色培养皿呈现红色小球杆菌状，且两端为钝圆形状，符合布鲁氏菌的生化特性。

上述测试都符合布鲁氏菌的生化特性，表明与MALDI TOF MS鉴定结果相一致。

通过实施二和实施例三的结果表明，该待检鲜奶制品所存在牛布鲁氏菌的污染，需要立即销毁，并对相关奶牛进行检疫处理。

实施例四：利用建立的细菌的核酸指纹特征图谱库，对烧烤店肉制品的快速检测

在路边烧烤店的羊肉检材中，以无菌操作，称取剪碎后的瘦肉样品25g，置于灭菌均质杯内，加入25mL，缓冲胨水增菌液（青霉素100μg/100ml），以8000～10000r/min均质1min，移入盛有200mL缓冲胨水增菌液的500mL广口瓶内，混合均匀，如pH低于6.6，用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液，调pH至6.8±0.2，于37℃水浴培养4h(以增菌液达到37℃时算起)，进行前增菌；其后，移取10mL转种于盛有100mLGN增菌液的250mL玻璃瓶内，摇匀，于42±1℃培养20±2h，进行选择性增菌（青霉素100μg/100ml）。必要时，同时另称取25g剪碎的瘦肉样品，加入25mLGN增菌液，同样进行均质。其后，移入盛有200mLGN增菌液的500mL广口瓶内（青霉素100μg/100ml），混合均匀，如pH低于6.6，用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.8±0.2，于37℃培养24±2h。而后将待检样本2一分为二，其中对待测样本2根据实施例1的方法进行PCR扩增、酶切后，进行质谱检测，全过程耗时1-2小时。

将所得的质谱特征图（图8）与实施一中获得的细菌核酸指纹特征图谱库进行比对，对比分析结果如下：

待测样品图谱分别与本发明所建立的图谱库中的羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）的标准图谱比对，匹配分数为2.420，大于2.300，报告为羊布鲁氏菌，与已知值完全符合，鉴定结果的可信度很高。

实施例五：待测样本2的生化方法检测

按照实施例三的方法，选取1ml实施例四中预备的待检样本2，在无菌环境下涂布在预先制备的柯氏染色培养皿中，在37℃下培养3天，观察菌落生长情况，结果如图9所示。

因实施例5中并非选用单一的菌落（如实施例三），且待检样品2中含有其他杂菌，因此图9显示在绿色杂菌周围，分布着圆状或球状红色单一菌落，这与羊布鲁氏菌的柯氏染色法结果完全一致。

实施例六：待测样本2的分子生物学检测

一、引物设计

针对羊布鲁氏菌(Brucella abortus))外膜蛋白(OMP)25kd基因设计的特异性PCR扩增用寡核苷酸引物：

BP1：5’-CGT GCC GCA ATT ACC CTC-3’(SEQ ID NO：1)

BP2：5’-CCG TCA GCT TGG CTT CGA-3’(SEQ ID NO：2)

二、PCR

根据实施例三的方法，选取实施例四中柯氏染色培养皿中单一红色菌落，常规方法增殖培养菌落，并提取细菌总DNA。

按照以下参数进行PCR：

反应条件为94℃10min，94℃1min，50℃1min，72℃2min，循环35次，72℃延伸10min。

反应结束后，取反应产物5μl加在1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)板上，在TAE电泳液中电泳观察结果。

三、结果和判定

在PCR试验中同时设立阳性对照和空白对照，全部成立后对PCR检测结果进行判定：在被检样品道出现419bp扩增带者为布鲁氏菌感染阳性；在被检样品道没有出现419bp扩增带者为布鲁氏菌感染阴性，结果如图10所示：泳道1是DL2000DNA Marker；泳道2和3是OMP25扩增片段；泳道4是阴性对照。

通过实施四、实施例五和六的核酸指纹特征图谱法鉴定的结果，可以确定该烧烤店出售的羊肉鲜肉已被羊布鲁氏菌感染，需要立刻进行销毁，并对相关人员进行隔离治疗。

   SEQUENCE LISTING

 

<110>  向华

 

<120>  一种基于质谱技术快速鉴定布鲁氏菌的方法及其用途

 

<130>  2012

 

<160>  5    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

aggaagagag agagtttgat cctggctcag                                        30

 

 

<210>  2

<211>  47

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cagtaatacg actcactata gggagaaggc tctgctgcgt cccgtag                     47

 

 

<210>  3

<211>  358

<212>  DNA

<213>  已知序列

 

<400>  3

ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct       60

 

caggtcggct atgcatcgtt gccttggtag gccattaccc taccaactag ctaatgcacc      120

 

gcgggcccat ctgtaagcga tagccgaaac catctttcaa aagcgtggca tgcgccacac      180

 

tttatcattc ggtattagcc ccggtttccc ggagttatcc ccaacttaca ggcaggttgc      240

 

ccacgtgtta ctcacccgtc cgccactaac tttggaagag caagctcttc ctccgttcgt      300

 

tcgacttgca tgtattaggc acgccgccag cgttcgtcct gagccaggat caaactct        358

 

 

<210>  4

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cgtgccgcaa ttaccctc                                                     18

 

 

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

ccgtcagctt ggcttcga                                                     18

 

Claims (5)

1.一种利用布鲁氏菌核酸指纹图谱来用于分类和鉴定的质谱试剂盒，包括以下引物：

（1）引物对及其的缓冲液，所述引物对序列选自SEQ IN NO:1-2所示的序列；

（2）SAP酶及其缓冲液；

（3）RNAase及其缓冲液；

（4）用于纯化酶切产物的树脂；

（5）用于比对核酸指纹特征图谱的分析软件；其中

所述引物对是用于扩增布鲁氏菌16S rDNA中目标区域的特定引物对；

所述16S rDNA中目标区域选自SEQ ID NO:3所示的区域；以及

所述布鲁氏菌包括但不限于羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）、牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)及猪种布鲁氏菌（Brucella suis）。

2.权利要求1的试剂盒，其中所述软件是BioExplore软件，其软著登字为第136879号、登记号为2009SR10700。

3.一种利用权利要求1或2的试剂盒制备布鲁氏菌核酸指纹图谱库的制备方法，包括步骤：

（1）PCR反应：使用针对布鲁氏菌16S rDNA中的目标区域的PCR通用引物对SEQ INNO:1-2，分别扩增各种分离株的布鲁氏菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物；

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，分别在一个反应体系中，对步骤（2）得到的各个细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到布鲁氏菌的特征核酸指纹谱图；

（6）将步骤（5）得到的各种布鲁氏菌核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到所述的布鲁氏菌的核酸指纹特征图谱库；

其中所述布鲁氏菌包括但不限于羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）、牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)及猪种布鲁氏菌（Brucella suis）。

4.利用权利要求1或2的试剂盒，用于布鲁氏菌分类的方法，包括：

（1）PCR反应：使用PCR通用引物对SEQ IN NO:1-2，扩增待测细菌的核酸模板，得到含扩增目标区域的PCR产物；

（2）SAP酶消化：用碱性磷酸酶（SAP酶）处理步骤（1）得到的PCR产物；

（3）转录和核酸酶切：使用特定的转录和内切酶，在一个反应体系中，对步骤（2）得到的细菌的消化产物进行转录和核酸酶切，获得一系列长度不一、丰度不一的核酸片段；

（4）纯化：使用树脂处理步骤（3）得到的酶切产物；

（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物上点在含有基质的靶片上，上质谱仪进行检测，得到该细菌的核酸指纹特征图谱；

（6）通过软件，将所得核酸指纹特征图谱与权利要求4所述的布鲁氏菌核酸指纹特征图谱库进行比较，从而判断待测细菌是否为布鲁氏菌。

5.权利要求5的方法，其中所述质谱仪是MALDI TOF MS质谱仪，所述软件是BioExplore软件，其软著登字为第136879号、登记号为2009SR10700。

Images