CN103308696B - 基于质谱技术的布鲁氏菌快速检测试剂盒 - Google Patents
基于质谱技术的布鲁氏菌快速检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种快速检测血液样本中布鲁氏菌的试剂盒,涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域。本发明基于质谱技术,构建了针对血液中布鲁氏菌检测的特异性多肽质谱模型,以及使用质谱技术进行布鲁氏菌检测的试剂盒。本发明试剂盒能够通过特异性指纹图谱鉴定血液样本中的布鲁氏菌,准确度高、重复性好,2小时内可完成96个样本的检测,比传统检测方法至少提前5天完成检测,且检测成本低廉,结果可靠,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质指纹图谱检测技术领域,具体地,涉及用于检测布鲁氏菌特征蛋白的质谱模型以及基于该质谱模型的检测布鲁氏菌的试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌(Brucella)是一种无芽孢、无鞭毛的对人畜有致病力的革兰阴性胞内寄生菌,是布鲁氏菌病(brucellosis,简称布病)的病原体。布病作为一种严重人畜共患传染病,已成为我国重要的公共卫生问题之一。人畜间疫情近10年强势走高,且疫情呈现出从牧区、半牧区向农区甚至城市蔓延的趋势,每年新发病例数为4万人左右,防控形势十分严峻。布鲁氏菌种型包括羊种(3个型)、牛种(8个型)、猪种(5个型)、犬种(1个型)、绵羊附睾种(1个型)及沙林鼠种(1个型),共6个种19个型。布病患者有发热、多汗、肝脾肿大、关节和全身肌肉痛等症状;布病因误诊误治容易转为慢性期,慢性期布病病程长,易复发或发生再感染,可导致病人劳动力降低甚至丧失。动物感染后可导致流产、不孕、繁殖成活率下降等。在我国,布病被列为乙类传染病。
布鲁氏菌因其高致病性、预后差等因素,被卫生部2006年制定的《人间传染的病原微生物名录》定位高致病性的二类微生物,实验活动危险程度高,需在BSL-3实验室中操作,对实验室生物安全环境要求很高。诊断布病的金标准是分离培养布鲁氏菌,然而这种方法风险较大、耗时,阳性率仅为15%~70%。目前,对布鲁氏菌的鉴定主要是基于传统的微生物学检测,操作繁琐,周期较长(7天),约有10%~30%成为无法鉴定的非典型菌株。同时在进行血清学检测时,由于与布鲁氏菌密切相关的菌株间易发生交叉反应,使其检测的特异性降低。以16SrDNA为代表的分子生物学方法可对布鲁氏菌进行鉴定,但需要提取DNA,进行基因测序,费力耗时。
因此迫切需要一种更加快速,可靠,高通量的鉴定方法来应对布病临床诊断与疫情控制。
基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)方法是近年来出现的用于病原识别的方法,许多国家的科研人员对该方法进行了验证,均表明MALDI-TOF MS满足现代传染病快速诊断的所有要求:快速、准确、易操作、廉价、高通量。目前商业化的用于质谱的微生物鉴定系统有德国布鲁克公司的Biotyer系统及生物梅里埃的Saramis系统。但这两套商业化的数据库内均没有布鲁氏杆菌的标准肽谱,无法识别布鲁氏杆菌。诊断布鲁氏菌感染的临床标本最常见的是血液,急性期病人的菌血浓度很低,临床须在血培养瓶中增菌至一定的浓度才能用于分离检测病原。因菌血样本成分复杂,无法直接用MLADI-TOF MS进行检测。目前,采用MALDI-TOF MS进行菌血的鉴定均是依赖于前端试剂盒(MALDI Sepltyper kit,布鲁克公司)富集病原体,后端病原数据库判定的模式,迄今国内外尚无采用MALDI-TOF MS技术直接检测体液中病原体的技术报道,更无直接检测体液中布鲁氏菌的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服目前体液中布鲁氏菌检测技术的不足,以血液中直接检测布鲁氏菌为例提供一种用于直接、快速从体液样本中检测感染布鲁氏菌的方法。
本发明首先提供了一种检测布鲁氏菌(Brucella)特征蛋白的质谱模型,含有以下8个特征蛋白,其质荷比m/z分别为:3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9。
进一步,本发明提供了上述质谱模型在制备布鲁氏菌检测试剂盒或检测试剂中的应用。
本发明提供了一种检测布鲁氏菌特征蛋白质谱模型的制备方法,包括以下步骤:
1)将在培养基上培养至对数生长期的布鲁氏菌标准菌株接种于培养瓶中,使菌浓度达到1010CFU/ml,依次稀释7个数量级至103CFU/ml,37℃培养,0天、2天、4天、10天、15天;同时设阴性对照;
2)每一取样时段,取上述8个数量级的菌液样本,采用乙醇/甲酸法进行质谱前预处理,制备蛋白样品;
3)将上述8个数量级的菌液、在5个时间段的40个蛋白样品和阴性对照血液样品处理得到的蛋白分别上质谱仪样品靶,设定参数对蛋白质指纹图谱进行标准化处理;采集2000-20000Da范围内的肽图谱;对所得数据进行统计学处理,得到具有统计学意义的布鲁氏菌8个特征蛋白,其质荷比分别为:3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9,将上述8个特征蛋白作为检测布鲁氏菌特征蛋白的质谱模型。
上述8个特征蛋白的出现频率分别为98.3%、95.2%、100%、98.7%、100%、93.4%、100%、100%。
优选地,步骤1)布鲁氏菌接种的培养瓶中,培养基为血液,接种后使菌血浓度达到1010CFU/ml。在本发明的一个实施例中,使用麦氏比浊管测定菌血浓度。所述的培养瓶为双向血液培养瓶。
步骤2)的乙醇/甲酸法具体为:取4mL菌液样本,16000g,离心2min,去除上清,加入200ul18.2兆欧的超纯水混匀,再加入600ul色谱级乙醇,充分混合;16000g,离心2min,去除上清,不可残留液体;加入50ul70%色谱级甲酸,混匀,再加入50ul色谱级乙腈混匀,16000g高速离心2min,上清液体即为制备好的蛋白样品。
本发明制备方法中,步骤3)将1ul蛋白样品上质谱仪样品靶,样品干燥后,覆盖基质,所述基质为α-氢基-4-羟基肉桂酸在50%乙腈、2.5%三氟乙酸中的饱和液。在本发明的一个实施例中,每个样品覆盖1ul基质。
步骤3)中质谱仪为MALDI-TOF质谱仪,氮激光器波长377nm,质量采集范围2000至20000Da,源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV;延时提取,320ns;激光频率20Hz,调整总采集频次使谱图总强度大于10000;每次数据采集前,采用大肠杆菌ATCC8739质控校正仪器,使分子量误差<0.02%。
步骤3)所述的标准化处理包括归一化、基线修正、平滑、去噪;通过设定MSP参数,质量偏差小于0.02%、信噪比大于3、峰出现频率最小值25%,最多峰数目70,每个浓度的布鲁氏菌由20张谱图构建标准参考谱,并通过MSP自带统计学方法提取的特征峰。
本发明还提供了用于布鲁氏菌检测的试剂盒,含有以下8个特征蛋白的质谱模型的图谱,这8个特征蛋白的质荷比m/z分别为:3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9。
本发明的试剂盒还含有以下试剂:
蛋白提取试剂:18.2兆欧超纯水、100%色谱级乙醇、70%色谱级甲酸、色谱级乙腈;基质:α-氰基-4羟基肉桂酸,基质溶解液:50%18.2兆欧超纯水,50%乙腈,2.5%三氟乙酸;布鲁氏菌标准菌株蛋白样品为阳性对照。
本发明的试剂盒,其工作步骤为:
1)取待测体液样品,离心,弃上清,加入纯水;再按体积比1:3加入100%色谱级乙醇,充分混合,再次离心,弃上清,不残留液体;
2)加入70%色谱级甲酸,混匀,再加入同体积的色谱级乙腈,混匀后离心,取上清液;
3)将步骤2)得到的上清液1ul上质谱仪样品靶,设定参数对蛋白质指纹图谱进行标准化处理;采集2000-20000Da范围内的肽谱图;肽谱图结果与本发明的布鲁氏菌特征蛋白的质谱模型特征谱比对,若得到的蛋白质谱图中含有以下8个特征蛋白的质荷比m/z分别为:3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9中的至少5个,则待测体液样品中存在布鲁氏菌。
进一步地,本发明试剂盒适用于针对血液、尿液、肺泡灌洗液及滑膜腔液中布鲁氏菌的检测。
本发明构建了具有血清本底的、不同菌含量的布鲁氏菌参考谱库,建立了血液中布鲁氏菌的特征肽指纹图谱参考数据库,构建了布鲁氏菌特征蛋白的质谱模型,在此基础上开发的检测试剂盒能快速准确的对临床血液样品中的布鲁氏菌进行快速检测。使得血培养物的直接MALDI-TOF MS检测成为可能。采用本发明的方法,样品经预提取处理后,菌体全部死亡,可在普通分子生物学实验室进行操作,消除了对人员及环境的危害。
利用本发明检测了32份临床血液样本,验证结果显示,32份临床样本中的10份布鲁氏菌感染样本全部被准确检出,检出率(敏感性)达100%,特异性为100%。与布鲁氏菌的其它检测方法比较,本发明在2小时内可完成96个样本的检测、每个样本检测成本为1元人民币,比传统方法至少提前5天完成检测。目前,布鲁氏菌诊断试剂盒主要由国外进口,但价格昂贵(英国卫桥兽医实验室的ELISA试剂盒,96人份/盒需2000元人民币),订货期长,不适用于常规临床检测及流行病学调查。本发明的基于质谱技术的布鲁氏菌检测试剂盒成本只有目前使用的布鲁氏菌诊断试剂盒的二十分之一,极大地节省了检测时间和成本,真正意义上实现了高通量、快速、经济的理想病原检测标准,完全适用于临床确诊、疾病监测、流行病学调查、公共卫生应急处理,具有十分重要的现实意义。
附图说明
图1为模拟布鲁氏菌菌血中肽指纹谱图,图中,横坐标为质荷比,纵坐标为相对强度。其中1-8分别对应菌血中布鲁氏菌的浓度为1010~103CFU/ml。
图2为临床菌血样本肽质量指纹图谱。
图3~图12分别为阳性临床菌血样本与质谱模型匹配图示。图中,横坐标为质荷比,纵坐标为相对强度,图3~图12的阳性样本标号分别为2013001、2013002、2013008、2013009、2013011、2013014、2013020、2013025、2013029;各图上部为阳性样本峰;下部为本发明所构建的特征蛋白峰值,从左至右峰值依次为:3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用的试剂为市售。
实施例1菌血布鲁氏菌质谱模型的构建
1、样本和仪器
布鲁氏菌国际标准株犬种的RM6-66、羊种16M、牛种544A及临床血液样本32例。其中,3株国际标准株用于构建布鲁氏菌特征蛋白质谱模型,32例临床血液作为测试样本。所有菌株都已采用传统的Tb噬菌体特异裂解实验确认。
基质辅助激光解析飞行时间质谱为美国布鲁克公司的MicroflexLT。数据采集采用布鲁克公司的FlexControlTM(version3.0)软件采集数据,Biotyper软件进行谱图优化、参考谱构建及验证数据搜索,搜索参数为:谱图校正频率临界值:50;分值计算频率临界值:5;原始谱图最大质量偏差:2000;校正谱图质量容忍度:250;单峰质量偏差限:600;强度校正参数:0.25。
2、菌血样品的处理
采用国际标准株犬种RM6-66、羊种16M、牛种544A为研究菌株。将在布氏培养基上培养至对数生长期的菌株,加入30mL双向血液培养瓶(生物梅里埃公司),使得菌浓度在1010CFU/ml(使用麦氏比浊管测定)。将原始的菌血在另外的双向培养瓶中稀释7个数量级,即10-1(109CFU/mL)、10-2(108CFU/mL)、10-3(107CFU/mL)、10-4(106CFU/mL)、10-5(105CFU/mL)、10-6(104CFU/mL)、10-7(103CFU/mL)。同时设没有布鲁氏菌的正常血液标本为阴性对照。每个菌种分别做3个平行试验。将这8个样本各取4mL乙醇/甲酸法预处理样本,提取蛋白样品,剩下的样本置于37℃培养2天、4天、10天、15天,在每个时间点均取4mL样本制备蛋白样品。
样品预处理采用乙醇/甲酸法,将4mL样本16000g,离心2min,去除上清,加入200ul18兆欧的超纯水混匀,再加入600ul色谱级乙醇,充分混合;16000g,离心2min,去除上清(不可残留液体);加入50ul70%色谱级甲酸,混匀,再加入50ul色谱级乙腈混匀,16000g高速离心2min,上清液体即为制备好的蛋白样品,用于后续质谱检测。
取1ul蛋白样品点于样品靶上,干燥后,覆盖1ul基质(α-氢基-4-羟基肉桂酸饱和液,基质溶解液:50%18.2兆欧超纯水,50%乙腈,2.5%三氟乙酸),放干后采集数据,每个样本采集20张谱图。
3、质谱数据采集
采集的质量范围为2000-20000Da,参数设定为:源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV;延时提取,320ns;激光频率,20.0Hz.80shots采集一个样品结晶点,平均每个样本结晶点收集8次,共计640shots形成一张谱图。采用大肠杆菌ATCC8739做为仪器校正用标准品,校正后分子量平均偏差小于200ppm。
4、特征蛋白质谱模型构建
采用布鲁克Biotyper标准处理方法(version1.5)处理原始谱图,对谱图进行基线校正、平滑、去噪;采用Biotyper2.0的主谱图预测(MSP)功能分别构建不同种菌株的参考谱,并加入到Biotypr MSP数据库。采用Biotyper(version2.0)软件包的MSP创建功能构建特异肽谱系列。参数如下:MSP质量偏差,200;信噪比大于3,峰出现频率最小值,25%;MSP最大峰数目:70。
对所得数据采用MSP内置的统计学功能进行统计学处理,布鲁氏菌血液样本中质谱图中,存在8个特征蛋白,其质荷比与出现频率(质荷比/出现频率)分别为:3782.9/98.3%、4338.6/95.2%、4539.6/100%、5025.1/98.7%、5045.2/100%、5292.3/93.4%、7395.6/100%、9077.9/100%,参见图1。每个浓度的参考谱由该浓度的所有肽谱的共同特征形成,包括峰质量,相对强度及出现频率(其中相对强度为参考值,不为比对所用)。所形成的菌血特异肽谱峰系列见表1。可见,在以布鲁氏菌国际标准株犬种RM6-66、羊种16M、牛种544A为研究菌株的菌血中,8个稀释度1010~103CFU/mL共3次平行试验中,发现以下蛋白的质荷比与出现频率的关系。MSP分析显示出现频率达90%以上的特征蛋白质荷比为优选特征蛋白。因此,本发明将扣除菌血背景蛋白之后的出现频率90%以上的质荷比蛋白确定为检测布鲁氏菌的特征蛋白。
表1布鲁氏菌菌血特征蛋白
实施例2临床实际样本的检测
灵敏度(sensitivity),又称真阳性率(true positive rate),即实际上是该病原并按照该检测方法的标准被正确地判为该病原体的百分比。特异度(specificity),又称真阴性率(true negative rate),即实际上不是该病原体而按照该检测方法的标准被正确地判为该病原体的百分比。
应用实施例1所构建的布鲁氏菌特征蛋白质谱模型,对32例具有发热、多汗、关节及肌肉疼痛的疑似临床病人的菌血样本进行检测分析。检测步骤为:
1)分别取32份待测菌血样品,将4mL样品,离心16000g,2min,去除上清,加入200ul18.2兆欧的超纯水混匀,再加入600ul色谱级乙醇,充分混合;16000g,离心2min,去除上清(不可残留液体);
2)加入50ul70%色谱级甲酸,混匀,再加入50ul色谱级乙腈混匀,16000g高速离心2min,得到制备好的蛋白样品,用于后续质谱检测。
3)取1ul蛋白样品点于样品靶上,干燥后,覆盖1ul基质(α-氢基-4-羟基肉桂酸饱和液,基质溶解液:50%18.2兆欧超纯水,50%乙腈,2.5%三氟乙酸),放干后采集数据,采集2000-20000Da范围内的肽图谱;参见图2。每个样本采集3张谱图。
参数设定为:源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV;延时提取,320ns;激光频率,20.0Hz.80shots采集一个样品结晶点,平均每个样本结晶点收集8次,共计640shots形成一张谱图。采用大肠杆菌ATCC8739做为仪器校正用标准品,校正后分子量平均偏差小于200ppm。
4)采用布鲁克Biotyper标准处理方法(version1.5)处理原始谱图,对谱图进行基线校正、平滑、去噪;得到的蛋白质谱图与本发明构建的特征蛋白质谱模型对比(8个特征蛋白的质荷比m/z分别为:3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9),结果发现,32例具有发热、多汗、关节及肌肉疼痛的疑似临床病人的菌血中,有10例样本被检测出布鲁氏菌阳性,与Tb噬菌体特异裂解实验结果一致,且经后期增菌培养均分离到病原菌(金标准)。10例阳性布鲁氏菌的菌血质谱图及其于上述8个特征蛋白的对比情况如下表2、图3。
表2阳性临床菌血样本特征峰
另外,本检测方法检测的为阴性的菌血样品,采用Tb噬菌体特异裂解实验验证,结果仍未阴性,并且后续培养没有分离到病原菌。证实本发明检测布鲁氏菌的方法准确率高,检测结果与现有的鉴定方法结果一致,一致率为100%。可见,采用本发明的方法检测临床实际样本,灵敏度(准确率)为100%。
采用本发明的特征蛋白质荷比通过Biotyper MSP功能构建模拟谱图,并与Biotyper原有1600多个种的3995个参考谱(不含布鲁氏菌)进行比对,没有非特异性的错误匹配,表明本发明提供的8个特征蛋白的特征谱为布氏菌所特有。同时,将验证的32个样本谱图与Biotyper的3995个参考谱进行比对,没有非特异性的错误匹配。可见,采用本发明的方法检测临床实际样本,检测布鲁氏菌的特异性为100%。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种检测布鲁氏菌(Brucella)特征蛋白的质谱模型的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)将在培养基上培养至对数生长期的布鲁氏菌标准菌株接种于培养瓶中,使菌浓度达到1010CFU/ml,依次稀释7个数量级至103CFU/ml,37℃培养,0天、2天、4天、10天、15天;同时设阴性对照;布鲁氏菌接种的培养瓶中,培养基为血液,使用麦氏比浊管测定菌血浓度,所述的培养瓶为双向血液培养瓶;
2)每一取样时段,取上述8个数量级的菌液样本,采用乙醇/甲酸法进行质谱前预处理,制备蛋白样品;
3)将上述8个数量级的菌液、在5个时间段的40个蛋白样品以及阴性对照血液样品处理得到的蛋白分别上质谱仪样品靶,设定参数对蛋白质指纹图谱进行标准化处理;采集2000-20000Da范围内的肽图谱;对所得数据进行统计学处理,得到具有统计学意义的布鲁氏菌8个特征蛋白,其质荷比分别为:3782.9、4338.6、4539.6、5025.1、5045.2、5292.3、7395.6、9077.9,将上述8个特征蛋白作为检测布鲁氏菌特征蛋白的质谱模型;
其中,步骤3)中,将蛋白样品上质谱仪样品靶,样品干燥后,覆盖基质,所述基质为α-氢基-4-羟基肉桂酸在50%乙腈、2.5%三氟乙酸中的饱和液;
并且,步骤3)中质谱仪为MALDI-TOF质谱仪,氮激光器波长377nm,质量采集范围2000至20000Da,源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV;延时提取,320ns;激光频率20Hz,调整总采集频次使谱图总强度大于10000;每次数据采集前,采用大肠杆菌ATCC8739质控校正仪器,使分子量误差<0.02%。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤2)的乙醇/甲酸法具体为:取4mL菌液样本,16000g,离心2min,去除上清,加入200ul18.2兆欧的超纯水混匀,再加入600ul色谱级乙醇,充分混合;16000g,离心2min,去除上清,不可残留液体;
加入50ul 70%色谱级甲酸,混匀,再加入50ul色谱级乙腈混匀,16000g高速离心2min,上清液体即为制备好的蛋白样品。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤3)所述的标准化处理包括归一化、基线修正、平滑、去噪;通过设定MSP参数,质量偏差小于0.02%、信噪比大于3、峰出现频率最小值25%,最多峰数目70,每个浓度的标准由20张谱图构建标准参考谱。
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