CN113219046B - 基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种基于基质辅助激光解吸电离‑飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法。本发明构建方法对菌株前处理方法进行优化，在确保前处理效果的前提下简化了前处理步骤，降低了前处理成本，降低了操作危险性。同时采用多维建库的方法，采集丝状真菌不同培养阶段的蛋白指纹图谱，优化建库参数，构建数据库，提高数据库库容量的同时，提高丝状真菌质谱鉴定准确性。

Description

基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维 蛋白指纹图谱数据库构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法。

背景技术

近年来，随着激素，免疫抑制剂和广谱抗生素在临床上的广泛使用，免疫功能低下人群数量不断增加，由真菌引起的感染越来越多，快速准确鉴定真菌成为病原学诊断的重点工作，目前真菌的鉴定主要还是以形态学鉴定为主，对真菌的准确鉴定与操作者的经验和工作年限密切相关，由于真菌形态特征复杂多变，且易随环境的变化而表现不同的形态特征，加之临床上抗真菌药物的使用使真菌的鉴定更加困难；免疫血清学检验1，3-β-D葡聚糖检测(G试验)和半乳甘露聚糖检测(GM试验)易受共同抗原影响，特异性低，检测菌种种类有限，且不能确定菌种种类；分子生物学方法虽然检测的准确性高，但操作复杂对人员操作要求高，且有些特殊的丝状真菌仍无法检测和鉴定。快速，准确的真菌鉴定方法成为临床诊断和治疗的关键要素。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，缩写MALDI-TOF MS)技术是近年来迅速发展起来的一种新型软电离质谱技术。得益于质谱技术在微生物鉴定方面的飞速发展，质谱仪在西方国家临床微生物实验室的逐渐普及，近年来国内学者们也越来越重视该技术。相比传统方法而言，MALDI-TOF MS质谱仪具有鉴定速度快、准确和低成本等绝对优势，CinziaBenagl等研究显示MALDI-TOF MS可以实现几分钟内得到鉴定结果且鉴定准确率高达98％以上，明显优于传统的分类学方法。在临床微生物、海关进出口商品的检验检疫、疾控中心的微生物传染病原的鉴定与监测和食品生产中的微生物检测等领域应用广泛。然而在丝状真菌鉴定方面受到诸多因素的影响，鉴定效果有待提升。主要表现在鉴定分值低，准确率低且操作繁琐，没有标准的操作流程。主要原因由于丝状真菌特殊的细胞壁结构而破壁困难，导致蛋白释放率低，表现为蛋白指纹图谱峰数量少，强度低，而影响质谱鉴定效果；数据库的容量低，且不同培养阶段菌种的特征性图谱峰差异较大。为解决丝状真菌破壁的问题，黄艳飞，鲁辛辛等对丝状真菌的前处理方法进行了研究并申请了专利《丝状真菌质谱鉴定蛋白提取技术》，丝状真菌液体培养后，通过洗涤及乙醇灭活，在甲酸乙腈提取法的基础上，加入玻璃珠涡旋震荡并利用超声波进行破壁，使蛋白充分释放出来。操作复杂繁琐，用时较长，单个样品处理需要近50分钟的时间。马庆伟、冯立平等结合研究者们的方法并进行积极的探索设计了操作简单的试剂盒，用于微生物质谱鉴定的样品制备。苍金荣、王翠等利用“双甲酸夹心法”实现对丝状真菌的鉴定，操作更加简单。而最常用的方法是乙腈甲酸提取法(乙醇/甲酸法)，众多文献中使用此方法进行丝状真菌的前处理，同时结合自建库得到较好的鉴定结果；在《中国临床微生物质谱应用专家共识》中微生物专家们系统地总结了微生物质谱鉴定的流程、影响因素等内容，而在丝状真菌的鉴定中专家共识推荐使用液体旋转培养法结合乙醇/甲酸提取法进行。

在数据库构建方面，各厂家及专家学者们都在探索不同的构建方法及参数，主要过程包括菌株的标准化、菌株培养及前处理、蛋白指纹图谱采集、构建数据库。相对于细菌而言，丝状真菌由于其生长周期内的变化较大，不同菌龄差异大，难以实现不同菌龄菌株的准确鉴定，因而制约了丝状真菌质谱鉴定的发展和在临床中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法，使得所述构建方法能够以更简化的步骤高效构建丝状真菌指纹图谱，并且丝状真菌的质谱鉴定不受培养基、培养时间，以及孢子和菌丝的影响，在不同培养基和不同培养时间的菌株都能得到准确的鉴定。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法，包括：

步骤1、将预建库的丝状真菌培养，选择丝状真菌培养完整生长周期内的至少两个不同时间点采集样品构建指纹图谱，每个时间点采集的样品为丝状真菌菌丝体和/或孢子，所有时间点采集的样品中需要同时有菌丝体和孢子；

步骤2、向样品中加入清洗液涡旋振荡，然后离心取沉淀干燥，向沉淀中加入裂解液；

步骤3、裂解后取裂解液上清点样，干燥后附加基质溶液，再次干燥后上机采集样品图谱；

步骤4、将所有样品的图谱分别进行筛选整合形成该样品的蛋白指纹图谱，并将每个样品整合后的蛋白指纹图谱构建数据库。

作为优选，所述构建方法包括：

步骤1、将预建库的丝状真菌通过沙保罗琼脂平板的固体培养方式培养；选择培养12-18h、3d和7d的三个时间点采集样品构建指纹图谱，每个时间点采集的样品为丝状真菌菌丝体和/或孢子，所有时间点采集的样品中需要同时有菌丝体和孢子；

步骤2、向样品中加入乙醇涡旋振荡，然后离心取沉淀干燥，向沉淀中加入甲酸裂解；

步骤3、裂解后取裂解液上清点样，干燥后附加基质溶液，再次干燥后上机检测；

步骤4、仪器参数设置为微生物鉴定最适参数，手动或自动采集图谱，在对仪器校准后进行每个样品的图谱采集，将图谱导入分析软件进行图谱筛选并合成一张蛋白指纹图谱，构建获得指纹图谱数据库。

本发明从丝状真菌的培养开始，对丝状真菌数据库构建的流程进行规范化的研究，结合丝状真菌本身的生长周期及生长特征，确定了丝状真菌数据库构建的方法即多维蛋白指纹图谱数据库；优化了丝状真菌的前处理方法，采用固体培养法，有助于形态学观察和判断是否污染，优化之后的方法更为简单，省时省力，保证不同生长阶段的菌种均能得到准确的鉴定。

作为优选，步骤2(丝状真菌前处理方法)为：

收集0.5-1mg的菌丝体和孢子加入0.5-2mL 75％乙醇中，涡旋振荡，离心弃上清，沉淀完全干燥后，向沉淀中加入20-50μL甲酸，吹打或涡旋振荡直至菌体裂解；或采用物理破碎手段破碎沉淀，然后再加入甲酸裂解。

作为优选，所述点样的个数为每个样品2-12个。

作为优选，所述基质溶液为α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液。

作为优选，步骤4中图谱采集为每个样品采集6-36张图谱；导入分析软件的图谱不少于6张。

作为优选，所述仪器参数为微生物鉴定最适参数，手动或自动采集图谱，质量范围1000-20000，延时时间为0-500，图谱累加次数为100-1000次，峰强度为12000-120000。

作为优选，步骤4中合成一张蛋白指纹图谱的要求为：各张图谱之间的最大差异为按照仪器默认设定值，峰数量30-100，各峰间误差为50-500，图谱间最大误差1500-3000。

在本发明具体实施方式中，本发明选则烟曲霉、构巢曲霉或黄曲霉来展示本发明的技术方案。本发明通过烟曲霉比较了5种不同的丝状真菌前处理方法，结果显示，本发明方法能够在更加简便的前提下达到目前常规使用的乙腈甲酸提取法(乙醇/甲酸法)的图谱质量；通过烟曲霉、构巢曲霉确定了较佳的取样时间点和取样部位；

在以黄曲霉为对象进行检测的试验中，仅采集1个时间点的图谱构建数据库，黄曲霉在10天和15天时无法完成鉴定，而本发明多维建库后，不同时间点采集到的图谱均能完成鉴定，且鉴定分值高，鉴定准确。由此可见丝状真菌多维数据库的构建可以提高菌株的鉴定检出率及鉴定准确性，并且不受培养时间的限制。

由以上技术方案可知，本发明构建方法采用多维建库的方法，采集丝状真菌不同培养阶段的蛋白指纹图谱，优化建库参数，构建数据库，在提高数据库库容量的同时大大提高丝状真菌质谱鉴定准确性。同时，本发明对质谱鉴定前处理方法进行了优化，取消了常规前处理方法中乙腈的使用，降低了试剂成本，因乙腈有毒性且易挥发，降低了操作危险性。

附图说明

图1所示为不同前处理方法处理丝状真菌图谱比对；A-E分别表示80％三氟乙酸提取法、50％乙腈2.5％三氟乙酸提取法、乙腈甲酸提取法、超声破碎法和乙醇甲酸法；

图2所示为不同培养基培养的丝状真菌图谱对比分析；

图3所示为不同培养时间丝状真菌图谱比对分析；

图4所示为丝状真菌不同真菌组分图谱对比分析。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述构建方法已通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述构建方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明致力于建立一种简单高效的丝状真菌前处理方法，并建立一套多维的丝状真菌蛋白指纹图谱库的建库方法。虽然丝状真菌在生物进化过程中具有一定的保守性，但是性状特征易随环境的改变而发生变化，在培养的不同生长阶段，图谱之间存在明显的差异，易受到不同阶段的产物如孢子、子实体、气生菌丝和基内菌丝体等的影响。依据不同种丝状真菌在不同培养基上不同培养阶段蛋白的质量分布特征及丰度进行鉴定，通过MALDI-TOFMS质谱仪采集其蛋白图谱，并经过数学模型和统计学处理，选取真实有效的特征蛋白构建每种丝状真菌的特征图谱，构建丝状真菌蛋白指纹图谱库，用于表征丝状真菌的种属关系，通过采集未知的丝状真菌蛋白指纹图谱与构建的标准数据库进行比对，实现丝状真菌鉴定。丝状真菌蛋白质指纹图谱库的建立，在临床上将极大提高丝状真菌的鉴定效率和鉴定准确度。

在本发明的对比实验中，各项处理如未明确说明，除去应有的区别外，其他实验条件保持一致。

以下就本发明所提供的一种基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法做进一步说明。

实施例1：不同前处理方法效果分析

1、前处理方法

A)80％三氟乙酸提取法：收集1mg的菌丝体，加入10-50μL80％三氟乙酸，充分混匀，静置30min，加入等体积的超纯水混合，13000rpm，离心2min，取上清备用。

B)50％乙腈2.5％三氟乙酸提取法：收集1mg的菌丝体加入10-50μL超纯水充分混匀，再加入等体积50％乙腈2.5％三氟乙酸，13000rpm，离心2min，取上清备用。

C)乙腈甲酸提取法(目前使用最多的方法)：收集1mg的菌丝体加入300μL超纯水，混匀，加入900μL无水乙醇，涡旋振荡1min。13000rpm，离心2min，弃上清(用移液枪尽可能的吸去上清)，向沉淀中加入20-50μL70％甲酸，稍振荡，加入等体积的乙腈，混合均匀，13000rpm，离心2min，取1μL上清点样，自然晾干，加1μL基质溶液，自然晾干，上机鉴定。

D)超声破碎法

取1mg的菌丝于1.5ml离心管中，加入50μL的70％甲酸中，于超声破碎仪中。功率600w，温度5℃，超声30min，取1μL上清点样，自然晾干，加1μL基质溶液，自然晾干，上机鉴定。

E)乙醇甲酸法(本发明方法)

收集1mg的菌丝体加入1mL 75％乙醇中，涡旋振荡1min；13000rpm，离心2min，弃上清(用移液枪尽可能的吸去上清)，沉淀干燥约5min，直至沉淀菌体表面无明显水渍，向沉淀中加入30μL 70％甲酸，吹打直至菌体裂解，取1μL上清点样，自然晾干，加1μL基质溶液，自然晾干，上机鉴定。

2、试验结果

将烟曲霉按照上述5种前处理方法进行处理并上机鉴定，图谱见图1，5种方法处理烟曲霉后均能采集到图谱，但从图谱的质量来看，方法D的效果较差，所采集图谱的峰强度较低，基线高，峰数量少。方法B整体看效果较好，但峰数量偏少；A和C分别用三氟乙酸和甲酸乙腈进行处理，所得到的图谱较好，峰数量多，基线相对较低，但A用的80％的三氟乙酸易挥发，腐蚀性强，操作危险系数高；方法C操作复杂，步骤多，方法C和方法E同样用甲酸处理菌体，操作方法不同，相比较而言方法E操作步骤少，但得到的图谱峰数量，峰强度，基线等方面与方法C相当。所以方法E(本发明方法)作为丝状真菌的前处理方法能够更加简化操作，且可以保证图谱质量。

实施例2：培养条件效果分析

固体培养菌体获取方法：用牙签或枪头从培养基表面刮取菌丝体/孢子。

液体培养菌体获取方法：取下培养瓶静置10min，小心吸去上清液，吸取1ml含菌丝体/孢子的培养液，13000rpm，2min，弃去上清，加入1ml超纯水洗涤，再次离心13000rpm，2min，弃上清，再重复洗涤2次，充分去除上清。

(1)菌体培养在沙保罗琼脂平板、1640液体培养基或营养肉汤琼脂平板上25或35℃培养12h、3d，5d、7d、9d、15d；

(2)在生物安全柜中用牙签挑取菌体(菌丝和/或孢子)于装有1mL70％乙醇的1.5mL离心管中，涡旋震荡0.5-1min；

(3)13000rpm，离心2min，弃去上清，再次离心，用移液枪尽可能去除上清。沉淀干燥5-10min；

(4)加入10-50μL70％甲酸，用移液枪吹打至菌体裂解；

(5)取1μL蛋白提取液点于靶板(钢板)上，每个样品点2个点，并点1μL校准品，自然晾干或烘干，加1μL基质溶液覆盖样品点，自然晾干；

(6)校准仪器后，手动采集图谱；

(7)分析软件比对图谱。

图2为赭曲霉在不同培养基培养3d的菌丝图谱比对结果，在琼脂平板上培养的菌株的图谱峰数量较多，而在液体培养基中培养的同株菌，峰数量相对较少，另外液体培养前处理过程复杂，获得菌体稍困难，故采用固体培养的方法较好。

在沙保罗琼脂平板上培养不同时间的构巢曲霉的图谱如图3，12h(菌丝体)是图谱峰数量较少，且基线较高，3d(菌丝体)和5d(菌丝体)峰数量增多，7d(孢子)以后峰数量最多，基线平稳，峰型比较稳定。所以选择12h，3d和7d的图谱作为建库图谱，保证在不同时间包含不同图谱状况。

图4为在沙保罗琼脂平板上培养7d后烟曲霉菌丝和孢子的图谱，从图谱来看，图谱差异较大，从整体峰型及特征峰的位置都存在差异，因此菌丝和孢子的图谱同时建库。

实施例3：丝状真菌多维数据库构建及验证

构建多维数据库：按照实施例1和2的方法得出的最佳方案处理黄曲霉并采集图谱，分别构建12h菌丝库，3d菌丝库，3d孢子库，7天菌丝库、7天孢子库，并对所构建的数据库进行验证：

质谱鉴定：分别选取不同时间段(具体为3d、5d、7d、10d、15d)的黄曲霉进行质谱鉴定。

结果统计如下：

表1多维建库后不同时间菌体鉴定结果统计

按照所用全自动微生物质谱检测系统Autof ms系列质谱仪微生物鉴定结果统计，各鉴定分值区间及意义如下：

[9.5-10]种水平置信，可能的亚种；

[9.0-9.5]种水平置信；

[6.0-9.0]属水平置信；

[0.0-6.0]不可信；

根据表1中的统计结果可知，采用多维建库后，不同时间点采集到的图谱均能完成鉴定，且鉴定分值高，鉴定准确可靠。

对比例：丝状真菌常规数据库构建及验证

构建常规数据库：按照实施例1和2的方法得出的最佳方案处理黄曲霉并采集图谱，采用常规建库方法，例如选取3d(即三天)菌丝构建3d菌丝库。

质谱鉴定：并分别选取不同时间段(具体为3d、5d、7d、10d、15d)的黄曲霉进行质谱鉴定。

结果统计如下：

表2常规建库方法不同时间菌体鉴定结果统计

质谱鉴定分值意义见前述。

根据表2的统计结果看，仅采集3天时的菌丝图谱构建数据库，黄曲霉在10天和15天时无法完成鉴定(表2)。

由实施例3和对比例可见丝状真菌多维数据库的构建可以提高菌株的鉴定检出率及鉴定准确性，并且不受培养时间的限制。

以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱的丝状真菌多维蛋白指纹图谱数据库构建方法，其特征在于，包括：

步骤1、将预建库的丝状真菌培养，选择丝状真菌培养完整生长周期内的至少两个不同时间点采集样品构建指纹图谱，每个时间点采集的样品为丝状真菌菌丝体和/或孢子，所有时间点采集的样品中需要同时有菌丝体和孢子；

步骤2、向样品中加入清洗液涡旋振荡，然后离心取沉淀干燥，向沉淀中加入裂解；

步骤3、裂解后取裂解液上清点样，干燥后附加基质溶液，再次干燥后上机采集样品图谱；

步骤4、将所有样品的图谱分别进行筛选整合形成该样品的蛋白指纹图谱，并将每个样品整合后的蛋白指纹图谱构建数据库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括：

步骤1、将预建库的丝状真菌通过沙保罗琼脂平板的固体培养方式培养；选择培养12-18h、3d和7d的三个时间点采集样品构建指纹图谱，每个时间点采集的样品为丝状真菌菌丝体和/或孢子，所有时间点采集的样品中需要同时有菌丝体和孢子；

步骤2、向样品中加入乙醇涡旋振荡，然后离心取沉淀干燥，向沉淀中加入甲酸裂解；

步骤3、裂解后取裂解液上清点样，干燥后附加基质溶液，再次干燥后上机检测；

步骤4、仪器参数设置为微生物鉴定最适参数，手动或自动采集图谱，在对仪器校准后，分别采集每个样品的图谱，将图谱导入分析软件进行图谱筛选并合成一张蛋白指纹图谱，将每个样品合成后的蛋白指纹图谱构建数据库。

3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤2为：

收集0.5-1mg的菌丝体和/或孢子加入0.5-2mL 75％乙醇中，涡旋振荡，离心弃上清，沉淀完全干燥后，向沉淀中加入20-50μL甲酸，吹打或涡旋振荡直至菌体裂解；或采用物理破碎手段破碎沉淀，然后再加入甲酸裂解。

4.根据权利要求1或2所述构建方法，其特征在于，所述点样的个数为每个样品2-12个。

5.根据权利要求1或2所述构建方法，其特征在于，所述基质溶液为α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液。

6.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤4中图谱采集为每个样品采集6-36张图谱。

7.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤4中导入分析软件的图谱不少于6张。

8.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，所述仪器参数为微生物鉴定最适参数，手动或自动采集图谱，质量范围1000-20000，延时时间为0-500，图谱累加次数为100-1000次，峰强度为12000-120000。

9.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤4中合成一张蛋白指纹图谱的要求为：各张图谱之间的最大差异为按照仪器默认设定值，峰数量30-100，各峰间误差为50-500，图谱间最大误差1500-3000。

10.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述丝状真菌选自烟曲霉、构巢曲霉或黄曲霉。

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