CN104142375A - 一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱以及利用指纹图谱鉴定霉菌菌种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱的方法，将已知霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和MetabolomicsXCMS分析，得到霉菌标志性代谢产物和其指纹图谱，将待鉴定霉菌采用同样方法获得指纹图谱；然后与建立的菌种代谢物数据库中已知霉菌标志性代谢产物进行匹配，当两者标志性代谢产物的精确质量数以及精确质量数的出峰时间误差不超过1%时，从而初步鉴定其为同一株菌株，通过筛选产毒真菌的培养条件，有机溶剂提取净化，高效液相色谱高分辨质谱检测，以非靶向代谢检测技术为手段，以靶向代谢检测为基础，具有检测成本低、分析毒素速度快、建立的指纹图谱可以简捷辨别该类产毒真菌，重现性好的优点。

Description

一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱以及利用指纹图谱鉴定霉菌菌种的方法

技术领域

    本发明涉及一种曲霉菌代谢物的检测和分类方法，具体地说，涉及一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱以及利用指纹图谱鉴定霉菌菌种的方法，属于食品安全检测和分类技术领域。 

背景技术

曲霉菌霉菌是自然界分布较普遍的腐生菌类之一，几乎无处不在，曲霉属的许多菌种引起谷物、食品、饲料和制品等的霉腐变质，一些曲霉菌霉菌在特定条件下能产生次级代谢产物真菌毒素，目前已发现的真菌毒素大约有400多种，是粮食中有害物质的重要来源，这些产毒真菌代谢产物可污染原料、饲料，进而污染食品，动物，进入人类食品链；真菌毒素不仅能导致食品腐败变质、营养损失及品质降低，还具有致癌、致畸、致突变和免疫抑制毒性，影响生长发育等不良效应。随着生活质量的提高，为保障食品安全，加强粮食及其食品中的真菌毒素的监测已经成为国内外学者研究的热点。 

目前，曲霉菌霉菌的分类一般采用传统的形态学特征结合生理生化性状的分类方法，并长期占据着主要地位。近年来, 为了寻求产毒曲霉菌霉菌的快速诊断技术及更加准确、快捷的分类方法, 产毒曲霉菌霉菌的分类、系统发育以及疑难种的鉴定已普遍应用遗传学、生物化学、分子生物学领域的相关技术。但后来证实, 这些分类特征的分类价值被估计过高。多数曲霉菌霉菌形态特征不稳定。有些种具有形态可变性或交叉性。分子鉴定技术比形态学分类有优越性, 但也存在其局限性。如分子杂交技术是对基因组 DNA 酶切后杂交, 杂交量大, 结果不易分析； AFLP 虽是非常有效的分子标记技术, 但是操作要求严格； RAPD 极易受反应条件的影响, 不同条件下的结果难以重复等。同时，曲霉菌的存在是产生有毒代谢物的条件，但有曲霉菌污染并不一定会带来曲霉菌毒素污染，比如黄曲霉有产霉毒素的菌株和不产毒素菌株，不产毒素菌株被用来作为有益菌对产毒菌株加以抑制，但二者从分类学和分子生物学的角度比较，差异非常小，但如果从食品安全角度，产毒与不产毒菌株完全是两个概念；曲霉菌代谢产物在一定条件下也可以相互进行转化，近来国外有研究表明，杂色曲霉毒素在合适条件下可以转化成黄曲霉毒素。目前，曲霉菌的检测和分类与真菌毒素的检测从生物学和化学的两个领域被严格区分开来，各自被独立进行研究，忽视了其内在的必然联系和规律。从经济价值比较，分子鉴定技术对技术人员要求高，提取过程复杂，使用试剂昂贵，检测周期长。 

发明内容

本发明要解决的问题是针对以上不足，提供一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱的方法，本发明利用高分辨质谱技术，通过对产毒曲霉菌代谢产物的分析，建立其相关的指纹图谱，对曲霉菌种类鉴定提供了一种新方法，具有检测成本低、分析毒素速度快、重现性好的优点。 

    本发明的另一目的是利用指纹图谱鉴定未知霉菌菌种的方法，简单、成本 

低、针对性强。

为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱的方法，其特征在于：所述方法为将已知霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和Metabolomics XCMS分析，得到霉菌标志性代谢产物和其指纹图谱。 

利用本发明可以快速准确的建立代谢物指纹图谱，并利用指纹谱库对其进行分类鉴定。 

一种优化方案，所述方法包括霉菌代谢产物的培养步骤： 

将霉菌接种到PDA液体培养基，摇床培养，然后将得到的菌种接种到无菌的含有PDA固体培养基的培养皿中，涂布均匀培养，PDA固体培养基内含有山梨酸。 

PDA固体培养基成分简单，有利于代谢物的提取纯化，可以减少质谱检测基质的干扰。在培养代谢产物的过程中，发明人偶然发现在PDA固体培养基中添加山梨酸可以诱导黄曲霉毒素代谢物的产生。 

进一步地，山梨酸占PDA固体培养基重量的0.07%。 

发明人经过大量试验，发现在PDA固体培养基中添加山梨酸的含量低于0.07%作用不明显，含量高于0.07%会产生抑制效果，0.07%时效果最好。 

进一步地，所述方法还包括高分辨质谱检测步骤： 

培养至15天、20天、30天时，分别按照以下步骤操作：

（1）取带有霉菌菌丝的样品，提取后超声再离心，取离心上清液后氮气吹干溶剂，定容，经滤膜过滤，得到样品c；

取装有PDA固体培养基的无菌平板，重复以上步骤得对照样品，以kb表示；（2）将样品c和kb在HPLC/TOF-MS上检测，高能量下做正离子全扫描，分别扫描3次，得到样品c和kb的三个全扫描数据。

进一步地，所述样品的数量为三个，第一个样品用乙酸乙酯和甲醇提取；第二个样品用水和乙腈提取；第三个样品用乙酸乙酯和叔丁醇提取；然后混合均匀。 

通过不同极性溶剂的提取，可以最大程度地提取代谢产物，离心分离过膜后直接上质谱检测，可以减少代谢物提取损失。通过高效液相色谱梯度洗脱，在减少检测时间的同时能够较好的分离代谢产物。因为本发明的目的是根据黄曲霉毒素建立霉菌代谢产物标志代谢产物和其指纹图谱，不是检测和建立其所有标志性代谢产物，由于黄曲霉毒素在正离子条件下响应值高，所以只是做了正离子全扫描，荷质比范围为50-500，能够达到本发明的要求，减少了分析时间。 

进一步地，所述方法还包括Metabolomics XCMS分析步骤： 

将九个样品扫描数据做为实验组，九个对照样品扫描数据做为对照组，使用Metabolomics XCMS软件处理，以离子扫描出峰时间和精确分子量与对照组进行差异性数据分析，得到霉菌的详细代谢物信息。

采用Metabolomics XCMS分析，可以快速对质谱的数据进行分析归类，提取代谢物详细信息，最大程度地节约人工分析时间。 

进一步地，所述方法还包括： 

根据霉菌的详细代谢物信息，利用统计学指标fold-change、pvalue、tstat确定实验组与对照组显著性差异，得到霉菌标志性代谢产物和其指纹图谱。

利用统计学指标分析，排除仪器误差，基质干扰，不同培养阶段产生的不同化合物，即找出其稳定的标志性代谢产物和其指纹图谱。 

进一步地，所述方法还包括： 

按照以上步骤建立已知霉菌菌株的代谢物指纹图谱，从而建立起一套完整的菌种代谢物数据库。

基于以上代谢物数据库，同样可以根据本发明建立未知霉菌的标志性代谢产物从而对其分类鉴定，其特征在于：所述方法将待鉴定霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和Metabolomics XCMS分析，得到待鉴定霉菌标志性代谢产物和标志性代谢产物的指纹图谱； 

然后与建立的菌种代谢物数据库中已知霉菌标志性代谢产物进行匹配，当两者标志性代谢产物的精确质量数以及精确质量数的出峰时间误差不超过1%时，从而初步鉴定其为同一株菌株。

能够简单、快速的以代谢产物对曲霉菌进行检测分类鉴定，非常有针对性，弥补了分子生物学分类的不足。 

一种优化方案，所述方法包括权利要求2-5任一项的方法。 

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：通过筛选产毒真菌的培养条件，有机溶剂提取净化，高效液相色谱高分辨质谱检测，以非靶向代谢检测技术为手段，以靶向代谢检测为基础，具有检测成本低、分析毒素速度快、建立的指纹图谱可以简捷辨别该类产毒真菌，重现性好的优点。 

    下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。 

附图说明

附图1为本发明实施例中8-Hydroxycarteolol的EIC图； 

附图2为本发明实施例中8-Hydroxycarteolol的spec图；

附图3为本发明实施例中2-O-Feruloyltartronic acid的EIC图；

附图4为本发明实施例中2-O-Feruloyltartronic acid的spec图；

附图5为本发明实施例中Lactaronecatorin A的EIC图；

附图6为本发明实施例中Lactaronecatorin A的spec图；

附图7为本发明实施例中Benzyl b-L-arabinopyranoside的EIC图；

附图8为本发明实施例中Benzyl b-L-arabinopyranoside的spec图；

附图9为本发明实施例中Mansonone C的EIC图；

附图10为本发明实施例中Mansonone C的spec图；

附图11为本发明实施例中Aflatoxin B1的EIC图；

附图12为本发明实施例中Aflatoxin B1的spec图；

附图13为本发明实施例中RITA的EIC图；

附图14为本发明实施例中RITA的spec图；

附图15为本发明实施例中N-Undecylbenzenesulfonic acid的EIC图；

附图16为本发明实施例中N-Undecylbenzenesulfonic acid的spec图；

附图17为本发明实施例中Kojic acid的EIC图；

附图18为本发明实施例中Kojic acid的spec图；

附图19为本发明实施例中Triphasiol的EIC图；

附图20为本发明实施例中Triphasiol的spec图；

附图21为本发明实施例中Ethylsuberenol的EIC图；

附图22为本发明实施例中Ethylsuberenol的spec图；

附图23为本发明实施例中Ala His Tyr的EIC图；

附图24为本发明实施例中Ala His Tyr的spec图；

附图25为本发明实施例中2-O-p-Coumaroylhydroxycitric acid的EIC图；

附图26为本发明实施例中2-O-p-Coumaroylhydroxycitric acid的spec图；

附图27为本发明实施例中Linusitamarin的EIC图；

附图28为本发明实施例中Linusitamarin的spec图。

具体实施方式

以寄生曲霉菌（3.6156）为例进行详细说明建立指纹图谱的方法，该方法是一种通用方法，不局限于寄生曲霉菌（3.6156）。 

实施例1，一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱的方法，包括霉菌代谢产物的培养步骤、高分辨质谱检测步骤、Metabolomics XCMS分析步骤，将已知霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和Metabolomics XCMS分析，得到霉菌标志性代谢产物和标志性代谢产物的指纹图谱。 

霉菌代谢产物的培养步骤： 

将冷藏的寄生曲霉菌（3.6156）接种到PDA液体培养基，28℃摇床培养3天，然后将得到的菌种接种到无菌的含有PDA固体培养基的培养皿中，涂布均匀，在25℃ 下培养，PDA固体培养基内含有山梨酸，山梨酸占PDA固体培养基重量的0.07%。

高分辨质谱检测步骤，采用高效液相色谱高分辨质谱联用仪，英文简写HPLC/TOF-MS： 

培养至15天时，按照以下步骤操作：

（1）取带有霉菌菌丝的样品，提取后超声再离心，取离心上清液后氮气吹干溶剂，定容，经滤膜过滤，得到样品c，本实施例中样品的数量为三个；

具体步骤为：使用打孔器垂直切下三个直径8mm包含真菌菌丝体和其下培养基的柱状样品，将样品转移至5mL的一次性离心管中，第一个样品用2 mL乙酸乙酯和2 mL甲醇提取；第二个样品用2 mL水和2 mL乙腈提取，第三个样品用2 mL乙酸乙酯和2 mL叔丁醇提取，各涡混1 min后超声1h，15000r/min离心17分钟，将三个样品离心上清液合样后氮气吹干，用1ml乙腈水（3:7，含0.1%甲酸）溶液定容，经0.22μm的滤膜过滤，得到样品c；

同时以装有PDA固体培养基的无菌平板做空白对照，重复以上步骤得对照样品，以kb表示；

（2）将样品c和kb在HPLC/TOF-MS上检测，高能量下做正离子全扫描，分别扫描3次，各得到样品c和kb的三个全扫描数据；

HPLC的检测条件如下：

反相C18 柱，流动相：A 0.1%甲酸水，B 乙腈，梯度洗脱程序：0→1.0min, 5%B； 1.0→6.0min，5%B→30%B; 6.0→11.0min，30%B→60%B； 11.0→16.0min，60%B→98%B； 16.0→18.0min，98%B；平衡2.0min；

TOF-MS的质谱参数如下：

Scanning Scope：50-500；

Gas Temp: 350°C；  

Drying Gas: 12L/min；

Nebulizer: 45psig；

Ion Polarity: Positive；

Date Storage: Centroid。

继续培养至20天时，取出重复步骤（1）和步骤（2）的操作，得到样品c和kb的三个全扫描数据； 

继续培养至30天时，取出重复步骤（1）和步骤（2）的操作，得到样品c和kb的三个全扫描数据。

Metabolomics XCMS分析步骤： 

将九个样品扫描数据做为实验组，九个空白对照扫描数据做为对照组，使用Metabolomics XCMS软件处理，以离子扫描出峰时间和精确分子量与对照组进行差异性数据分析，得到寄生曲霉菌（3.6156）的详细代谢物信息。

通过Metabolomics XCMS软件处理，得到5249个特征离子，利用统计学指标fold-change、pvalue、tstat等进一步分析确定实验组与对照组显著性差异，确定506个特征离子，最后经质谱图分析，筛选出14个标志性代谢产物，寄生曲霉菌（3.6156）菌种标志性代谢产物指纹图谱数据见表1-5。 

表1 

 表2

表3

 表4

表5

 

 结论分析

从表1-5看出，实验组和对照组经Metabolomics XCMS软件处理，得到的14种标志性代谢产物精确质量数的荷质比理论值（Theoretical value，M/Z）和TOF-MS设备对样品的实测值（Measured value，M/Z）误差不超过5ppm。变化倍数（Fold和log2fod）的绝对值大于2，T-值（Tstat）绝对值大于10，, P-值（pvalue） <0.01,说明差异性非常显著。各个代谢物的响应值（Maxint）大于3倍的信噪比，如图1至图28所示。

验证 

用纯标准品配制5ppb浓度的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1），用Metabolomics XCMS软件处理，黄曲霉毒素B1质谱结果见表6:

从表6结果与表1中序号6结果比较，两者检测精确质量数（313.07083/313.07113）和出峰时间（9.52/9.53）误差不超过1%，可确证表2中序号为6的化合物为黄曲霉毒素B1。

由于没有表1-5中其它特征代谢产物的对应标准品，需要从二级质谱图和其代谢途径推导其化合物名称。但是，本发明的目的不是看寄生曲霉（3.6156）产生何种代谢产物，而是通过实验和检测，找到其标志性代谢产物参数和相关图谱，用于对同类曲霉菌霉菌进行鉴别，若在同样的培养条件和检测条件下， 能产生相同的或误差不超过1%的结果，则可辨别其为同类菌株。 

按以上培养方法和检测条件对菌株3.6156重新培养验证，比较各共有指纹峰的相对保留时间和精确分子量，结果表明，各共有指纹峰的相对保留时间RSD<0.36％，精确分子量检测平均值小于0.1%；按以上培养方法对菌株3.6156在不同实验室培养，比较各共有指纹峰的相对保留时间和精确分子量，结果同上，各共有指纹峰的相对保留时间RSD<0.66％，精确分子量检测平均值小于2ppm，说明该方法有很好的稳定性和重现性。 

上面实施例中的内容是描述如何建立指纹图谱的步骤，从培养一直到得到标志性代谢产物即完成寄生曲霉菌（3.6156）这一株菌株指纹图谱的建立以及方法的验证。可以按照以上步骤和方法建立其它已知霉菌菌株指纹图谱，从而建立起一套完整的数据库。 

若鉴定未知菌种，则用以上同样的方法将待鉴定霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和Metabolomics XCMS分析，得到待鉴定霉菌标志性代谢产物；然后与建立的菌种代谢物数据库中已知霉菌标志性代谢产物进行匹配，当前者含有的标志性代谢产物的精确质量数以及精确质量数的出峰时间与数据库中某菌的代谢产物数据误差不超过1%时，从而鉴定其为同一株菌株。 

本发明提供的参照附图和实施例，不止局限在寄生曲霉3.6156，是一种通用型方法，在本发明技术范围内具有普通技术人员可以经过简单的变化，而获得本发明相同的技术效果，同样在本发明的保护范围内。 

本发明提供的检测方法主要通过固定培养方法，获得菌株代谢产物，在经过高分辨质谱检测和数据处理分析，实验了该类菌株的初步鉴定。采用该方法具有检测成本低、方法简单、分析毒素速度快、建立的指纹图谱可以简捷辨别该类产毒真菌，重现性好等优点。本发明方法与现有的分子鉴定方法相比，优点一是提取过程简单，仅用少数几种有机溶剂提取；而后者需要菌种富集培养，，DNA提取，DNA引物扩增等,使用试剂多，提取过程复杂。优点二是成本低，本发明成本不超过10元，而后者远远大于此数。优点三是有针对性，弥补了分子生物学分类的不足。使用分子生物学技术对霉菌鉴定，不能确定其代谢产物，比如某些霉菌在特定培养条件下会产生有毒代谢产物，其它培养条件下却不产生；本发明以霉菌代谢产物分类，弥补其不足。 

以上所述为本发明最佳实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识。本发明的保护范围以权利要求的内容为准，任何基于本发明的技术启示而进行的等效变换，也在本发明的保护范围之内。 

Claims (10)

1.一种利用霉菌代谢产物建立指纹图谱的方法，其特征在于：所述方法为将已知霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和Metabolomics XCMS分析，得到霉菌标志性代谢产物和其指纹图谱。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括霉菌代谢产物的培养步骤：

将霉菌接种到PDA液体培养基，摇床培养，然后将得到的菌种接种到无菌的含有PDA固体培养基的培养皿中，涂布均匀培养，PDA固体培养基内含有山梨酸。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述山梨酸占PDA固体培养基重量的0.07%。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括高分辨质谱检测步骤：

培养至15天、20天、30天时，分别按照以下步骤操作：

（1）取带有霉菌菌丝的样品，提取后超声再离心，取离心上清液后氮气吹干溶剂，定容，经滤膜过滤，得到样品c；

取装有PDA固体培养基的无菌平板，重复以上步骤得对照样品，以kb表示；

（2）将样品c和kb在HPLC/TOF-MS上检测，高能量下做正离子全扫描，分别扫描3次，得到样品c和kb的三个全扫描数据。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述样品的数量为三个，第一个样品用乙酸乙酯和甲醇提取；第二个样品用水和乙腈提取；第三个样品用乙酸乙酯和叔丁醇提取；然后混合均匀。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括Metabolomics XCMS分析步骤：

将九个样品扫描数据做为实验组，九个对照样品扫描数据做为对照组，使用Metabolomics XCMS软件处理，以离子扫描出峰时间和精确分子量与对照组进行差异性数据分析，得到霉菌的详细代谢物信息。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：

根据霉菌的详细代谢物信息，利用统计学指标fold-change、pvalue、tstat确定实验组与对照组显著性差异，得到霉菌标志性代谢产物和其指纹图谱。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：

按照以上步骤建立已知霉菌菌株的指纹图谱，从而建立起一套完整的菌种代谢物数据库。

9.一种利用指纹图谱鉴定霉菌菌种的方法，其特征在于：所述方法将待鉴定霉菌经PDA固体培养基培养后获得霉菌代谢产物，提取纯化后经高分辨质谱检测和Metabolomics XCMS分析，得到待鉴定霉菌标志性代谢产物和标志性代谢产物的指纹图谱；

然后与建立的菌种代谢物数据库中已知霉菌标志性代谢产物进行匹配，当两者标志性代谢产物的精确质量数以及精确质量数的出峰时间误差不超过1%时，从而鉴定其为同一株菌株。

10.如权利要求9所述利用指纹图谱鉴定霉菌菌种的方法，其特征在于：所述方法包括权利要求2-5任一项的方法。