CN103245716A

CN103245716A - 基于小分子代谢物质谱分析的快速高灵敏度微生物鉴定方法

Info

Publication number: CN103245716A
Application number: CN2013101940005A
Authority: CN
Inventors: 聂宗秀; 王佳宁; 陈素明; 侯剑; 何清
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2013-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2013-08-14

Abstract

本发明公开了一种快速高灵敏度鉴定微生物的方法。该方法以微生物的小分子代谢物为检测对象，通过质谱法结合化学计量学方法实现对微生物的鉴定。具体步骤如下：1)培养单克隆生长的待鉴定微生物菌株；2)将获得的待鉴定单克隆微生物菌体样本离心去除培养基，再加入水或者pH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液洗涤，离心去除残余培养基；3)向待鉴定单克隆微生物菌体中加入2-4倍体积的体积分数为75-95％的乙醇水溶液进行灭活和提取，得到提取液样品；4)将提取液样品进行质谱测试；5)从获得的样品质谱谱图中采集5-20个谱峰，所得数据用基于多元统计分析的化学计量学方法进行分析，实现对菌体的鉴别。

Description

基于小分子代谢物质谱分析的快速高灵敏度微生物鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种基于小分子代谢物质谱分析的快速高灵敏度微生物鉴定方法。

背景技术

微生物快速鉴定在临床感染菌株检测，食品安全，公共卫生预警，以及生物反恐等领域具有重要实践意义。实现快速的鉴定可以大大缩短应对时间，为筹措治疗及应对方案提供更充分的时间。此外高区别灵敏度快速微生物鉴定可以更加精细区分种以下分类水平的突变菌株，可为临床检测耐药株以及病原微生物突变株的疾控安全监测提供参考。

有多种方法可以实现微生物的鉴定。当前可靠的鉴定方法，都是建立在将采集的样品在实验室中进行一定分离培养的样品。通过对培养的菌落特征和生化特征进行观察，测试，对表型特征综合分析实现微生物鉴定。这种方法较为普遍，成本低廉，但是依赖于人的经验对形貌和指标进行判读，难以实现高通量分析，可靠性受制于技术人员的能力、状态和经验。基于生化和抗体反应的方法尽管更加有效，但是速度很慢，并且样品分析成本高。基于核酸序列检测的方法，例如PCR扩增后进行测序，可以得到可靠的检测结果。这是因为基因组的序列相对稳定，受外界环境影响小，但是速度较慢，成本较高，难以应用到大量样品高通量分析。

上述方法都不能在这几方面满足可普遍推广的快速微生物鉴定的要求：方法具有普遍适应性，高通量分析，分析成本低廉，分析方法简单易于传授掌握。质谱法的引入为微生物快速鉴定起到了重大的推进作用，不但可以基本满足以上要求，而且种属水平的鉴别已经可以很可靠。

当前的方法主要是基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)法。该方法信号灵敏度高，通量高于电喷雾方法，常用的基质如DHB和CCA非常适合分析蛋白质、多肽以及核酸序列。根据中心法则，可知蛋白/多肽的序列与核酸序列关联密切，其蛋白组成具有种属特异性。因此测定蛋白/多肽的组成模式或者分析特定核酸序列，可以对微生物进行鉴定。

为了保证快速鉴定的时间限制因素，基于MALDI-TOF MS的快速微生物鉴定法所采取的样品提取方法都不能有太多的步骤。通常核酸样品的获取较为繁琐，故最常见的是测试范围通常是分子量在2000-20000Da的多肽和蛋白质。这一分子量范围主要是高丰度的核糖体蛋白，通过分析这一区间的谱峰模式，可以稳定、可靠的获得种属水平的鉴定。这是因为高丰度且遗传保守的核糖体蛋白不太容易发生改变。然而这一优点也是它的缺点，例如当某些菌株的差异仅为低丰度蛋白时则不能获得有效区别，例如耐药突变菌株。

微生物快速鉴定不仅需要实现种属水平的鉴别，也需要得到更高区别灵敏度的鉴别。很多方法都尝试进行了不同程度的种以下水平，即株的区别。这些方法当前还只能对差异较大的株实现区别，主要是因为上述蛋白质的影响。因此，改变质谱的质量检测窗口，避开蛋白干扰，利用代谢组可放大反映不同菌株基因组区别的特点，将有可能提供更高区别灵敏度的微生物快速鉴别方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速高灵敏度微生物鉴定方法。

本发明所提供的快速高灵敏度鉴定微生物的方法是通过以微生物的小分子代谢物为检测对象，以质谱法结合化学计量学方法实现的。

本发明方法的基础依据是微生物小分子代谢物是生物体实现其表型特征和发挥功能的直接参与者，而且也反应了不同菌株的物种特征。

本发明的方法具体包括下述步骤：

a、选取若干已知微生物采用下述方法得到相应微生物的小分子代谢物的质谱图，并用化学计量学方法进行分析，然后采用模式识别的算法建立不同已知微生物样本的基础数据库；

所述方法如下(技术方案路线参见图1)：

1)按照平行操作，指定的条件(包括培养条件，培养基，温度，转速等)，培养单克隆生长的待鉴定微生物菌株，于统一的生长浓度下收集待鉴定单克隆菌体；

2)将步骤1)获得的待鉴定单克隆微生物菌体样本离心去除培养基，再加入30-100倍体积的水或者pH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液洗涤，离心去除残余培养基，通常5-10mg湿重单克隆微生物菌体即足以用于鉴定；

3)向步骤2)处理后的待鉴定单克隆微生物菌体中加入2-4倍体积的体积分数为75-95％的乙醇水溶液灭活兼具提取，得到提取液样品；

4)将步骤3)所述的提取液样品进行质谱测试，获得质谱谱图；

5)每种样品采集5-20个质谱峰，所得数据用基于多元统计分析的化学计量学方法进行分析；

b、将待鉴定的微生物按照上述方法处理，获得待鉴定微生物的小分子代谢物的质谱谱图；

c、将待鉴定微生物的质谱谱图与数据库对比，实现对微生物的鉴别。

所用的化学计量学方法是以主成分分析为核心的方法。模型识别的算法有遗传算法(Genetic Algorithm)、支持向量机(Support Vector Machine)、有监督的神经网络(SNN)和快速分类器(QuickClassifier)算法。

不同微生物的质谱谱图的谱峰组成模式是不同的，化学计量学方法可以计算这种谱峰模式的类似性并以数值和图形的方式表示。将各个样品每张质谱谱图作为一个主成分分析的样本，构成每张谱图的数据点为变量。将样本和变量输入给主成分分析可以得到每一样本在主成分空间中的坐标。取前三个主成分-包含了样本的主要信息-作三维直角坐标图。同一类样本由于其相似性因而最终在主成分空间中聚在一起。主成分分析可以确定所建立的方法是否可以将不同类样本区分。这一点确定后可以进一步采用模式识别的算法建立不同样本的基础数据库，通过待测的质谱谱图与数据库对比，可实现数据归类，即鉴别。

其中，步骤1)中所述微生物包括细菌，真菌，病毒等。

步骤1)中通常对数生长期中晚期是菌株成熟稳定的收集时机，在此时收集单克隆菌体可降低假阳性鉴别。

步骤2)中，洗涤时，所述水或者磷酸盐缓冲液的用量为单克隆微生物菌体样本体积的30-100倍。

步骤3)中，通常取5-10mg湿重步骤2)处理后的待鉴定单克隆微生物菌体即足以满足鉴定需要。

根据菌株特性，提取时间在2-20分钟不等。

在将步骤3)中得到的提取液样品进行质谱分析前，还可对其进行离心，将离心得到的上清液用于质谱测试或置于冰箱保存。

步骤4)中，所述质谱测试中的质谱法，其常采用的质谱离子化方法包括基质辅助激光解吸电离(MALDI)，解吸电喷雾电离(DESI)，等离子体辉光放电电离等。上述所用电离方法均为软电离方法，其中基质辅助激光解吸电离(MALDI)采用低分子量区间背景干扰小的基质，例如盐酸萘乙二胺，硝酸奈乙二胺，质子海绵，1，5-二氨基萘等。

质量测试范围为微生物小分子代谢物分布范围，质荷比区间为m/z0-1500。

所用电离方法及条件均为仪器产品说明或常规文献报道的方法。

质量分析器为飞行时间、离子阱或四极杆，包括它们的组合或变种，如四极杆-飞行时间，四极杆离子阱，三级四极杆。

当采用解吸电喷雾电离(DESI)质谱或等离子体辉光放电质谱进行质谱测试时，可将提取液样品直接上样；当采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行质谱测试时，需将提取液样品与基质混合后点靶入基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，其中，所述提取液样品与基质溶液可按照体积比10∶1-1∶100的比例混合。

微生物小分子代谢物样品提取仅通过简单处理，无复杂费时步骤，可以满足快速鉴定的需要。

本发明所采用的样品提取液和基质溶液都较为温和，不造成菌体破裂，可以减少不同样本操作提取时间的析出物差异，也可降低菌体高丰度小分子组分的大量析出。

单个样品从制备到分析用时10-30分钟。对于批量制备和高通量分析，可实现平均每小时鉴别10-30个样品。

本发明适用上述多种质谱仪器及离子化方法，但采用通用统一的样品处理方法。

本发明所采用的数据分析手段是基于多元统计分析的化学计量学方法，如主成分分析法等。

本发明以微生物的小分子代谢物为分析对象，通过质谱和化学计量学方法实现微生物快速高灵敏度鉴定。该方法的基本原理是根据中心法则，基因组的变化往往影响行使表型功能的代谢组。对于突变菌株，其基因组或蛋白质组并不一定有显著的改变，然而其代谢组由于居于下游，则往往由于放大效应而得到显著变化。应用高通量高灵敏度的质谱法可以有效分析这种放大效应，同时利用化学计量学方法以实现通过谱图鉴别差异菌株。

本发明和以往的基于质谱的微生物快速鉴定技术相比，具有能够精细分辨在分类学上株水平的菌体，包括单基因改变的菌株。这一结果是当前已知最灵敏的结果。这是通过将测量小分子代谢物变化与基因组变化(株分类的遗传基础)相联系实现的。而以往的方法由于不能同避高丰度核糖体蛋白从而难以得到更灵敏的分辨，此外高分子质量区的谱图信噪比和谱数都低于低分子质量区。与基于核酸测序的方法相比，本发明具有快速和成本低廉的特点。

本发明以简洁明了的技术路线实现快速微生物鉴定。菌体经培养后，只需简单后处理，以一步法乙醇灭活兼提取后即可用质谱分析。样品用量少，样品制备方法统一通用，可向后兼容多种离子化方法和质谱仪器。所得质谱数据经基于多元统计分析的化学计量学方法实现鉴别。

附图说明

图1为本发明方法的技术路线图。

图2为实施例1中代表性质谱谱图。

图3为实施例1中细菌种-属鉴定的主成分分析结果。

图4为实施例2中突变体菌株鉴定的主成分分析结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明所涉及的不同的离子化方法采用统一的样品前处理方法，其中基质辅助激光解吸电离(MALDI)法在样品处理结束后再与基质液混合点靶上样检测。

下述实施例1，2中所使用方法为基质辅助激光解吸电离(MALDI)-飞行时间质谱法，所用基质为盐酸萘乙二胺。基质的质谱背景非常简单，对测试样本，包括复杂体系均无干扰。

下述实施例中所用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的型号为BIFLEXTM III(Bruker)和ultrafleXtreme(Bruker)。

本发明不同的离子化方法采用统一的样品前处理方法(见图1)。

下述实施例中所采用的耻垢分枝杆菌(Mycobaterium smegmatis)的菌株为mc²155；鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis，MAP)购自ATCC，ATCC19698^TM。

实施例1、鉴定区分不同种-属微生物(细菌)

培养的三种分枝杆菌(耻垢分枝杆菌，鸟分枝杆菌，海分枝杆菌)，K12大肠杆菌两种亚种(DH5α和HB101)细菌生长到大于OD₆₀₀＝0.8-1.0后收集。收集的菌体用50倍pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤后-20℃冷冻保存或者直接用于进一步处理。磷酸盐缓冲液悬浮的细菌用去离子水置换，5000rpm离心留沉淀，向10mg沉淀中加入3倍(即30ul)体积的体积分数为80％乙醇水溶液，悬浮后静置5min。再经5000rpm离心后取上清，或者不离心直接取适量样品用于质谱分析。

取样品和基质(盐酸萘乙二胺)溶液(20mg/ml)以1∶1体积比混合，向MALDI靶板加入1μl混合样品，充分干燥。入质谱分析，质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75-80％；负离子模式。

通过将获得的质谱谱图(图2为代表性谱图)进行化学计量学分析(主成分分析)，可以快速灵敏区分不同细菌的种，亚种(见图3)。图3的制备方法如下：将每张质谱谱图作为一个样本，构成每张谱图的数据点为变量。将样本和变量输入给主成分分析可以得到每一样本在主成分空间中的坐标。取前三个主成分-包含了样本的主要信息-作三维直角坐标图。同一类样本由于其相似性在空间中聚在一起。椭圆覆盖图是由每一类样本点在空间中定位的重心计算得到的。

实施例2、鉴定区分同种不同突变株微生物(细菌)

培养的耻垢分枝杆菌(野生型，菌株为mc²155)以及五种单基因突变株(Msmeg2415KO、Msmeg1640KO、Msmeg1641KO、Msmeg1804KO和Msmeg_3312KO)(Msmeg_2415KO为Hemerythrin HHE cation binding region基因敲除(起始位点2497580，结束位点2498158)，Msmeg_1640KO为mfpB基因敲除(起始位点1732495，结束位点1733076)；Msmeg_1641KO为mfpA基因敲除(起始位点1733082，结束位点1733657)；Msmeg_1804KO为结核分枝杆菌SigF同源基因敲除(起始位点1881660，结束位点1882412)；Msmeg_3312KO为Hemerythrin HHE cationbinding domain subfamily基因敲除(起始位点3391207，结束位点3391764)。所有基因信息均可通过该网站输入MSMEG_XXXX格式的基因名称后查得相关信息http://mycobrowser.epfl.ch/smegmalist.html。)生长到OD₆₀₀＝0.8-1.0后收集。收集的菌体用50倍pH值为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤后-20℃冷冻保存或者直接用于进一步处理。磷酸盐缓冲液悬浮的细菌用去离子水置换，5000rpm离心留沉淀，向10mg沉淀中加入3倍体积的体积分数为80％乙醇溶液，悬浮后静置10min。再经5000rpm离心后取上清，或者不离心直接取适量样品用于质谱分析。

取样品和基质(盐酸萘乙二胺)溶液(20mg/ml)以1∶1体积比混合，向MALDI靶板加入1μl混合样品，充分干燥。入质谱分析，质谱条件为：电压：加速电压：19.000kv；延迟引出电压：14.920kv；反射器电压：20.000kv；透镜电压：7.000kv；频率：1.000Hz；激光器能量：75-80％。负离子模式。

每株菌采集多张谱图，将获得的质谱谱图归一化后进行化学计量学分析(主成分分析)，可以快速灵敏的区分细菌的单基因突变，其结果优于当前已知的方法(图4)。图4的制备方法：将每张质谱谱图作为一个样本，构成每张谱图的数据点为变量。将样本和变量输入给主成分分析可以得到每一样本在主成分空间中的坐标。取前三个主成分-包含了样本的主要信息-作三维直角坐标图。同一类样本由于其相似性在空间中聚在一起。椭圆覆盖图是由每一类样本点在空间中定位的重心计算得到的。

Claims

1.一种鉴定微生物的方法，包括下述步骤：

所述方法如下：

1)培养单克隆生长的微生物菌株，待OD_600nm值大于0.8后，收集待鉴定单克隆微生物菌体；

2)将步骤1)获得的单克隆微生物菌体样本离心去除培养基，再加入水或者pH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液洗涤，离心去除残余培养基；

3)向步骤2)处理后的单克隆微生物菌体中加入2-4倍体积的体积分数为75-95％的乙醇水溶液进行灭活和提取，得到提取液样品；

4)将步骤3)所述的提取液样品进行质谱测试，获得测试样品质谱谱图；

5)从获得的样品质谱谱图中采集5-20个谱峰，所得数据用基于多元统计分析的化学计量学方法进行分析；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a)中所述微生物包括细菌、真菌及病毒。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述水或者pH值为7.2-7.6磷酸盐缓冲液的用量为所述单克隆微生物菌体体积的30-100倍。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述提取时间为2-20分钟。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述质谱测试中的质量测试范围为微生物小分子代谢物分布范围，质荷比区间为m/z0-1500。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：步骤4)中，所述质谱测试中采用的质谱离子化方法为基质辅助激光解吸电离、解吸电喷雾电离或等离子体辉光放电电离；

所述质谱测试中采用的质量分析器选自下述任意一种或它们的组合及变种：飞行时间、离子阱和四极杆。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述质谱测试采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱进行质谱测试；将所述提取液样品与基质溶液混合后点靶入基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱，其中，所述提取液样品与基质溶液按照体积比10∶1-1∶100的比例混合，所述基质选自下述任意一种：盐酸萘乙二胺，硝酸奈乙二胺，质子海绵和1，5-二氨基萘。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法将所述微生物鉴定到属水平、种水平或菌株水平。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述菌株包括单基因突变的菌株。