CN111239235A - 一种巴尔通体菌株maldi-tof ms的数据库建立方法和鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物质谱检测领域，具体涉及一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI‑TOF MS)的巴尔通体菌株的数据库建立方法和鉴定方法。上述建立方法包括：靶板制备和MALDI‑TOF MS检测步骤，形成巴尔通体菌株标准数据库；上述鉴定方法包括：将待测菌株进行MALDI‑TOF MS检测，得到待测菌株的质谱图，在上述数据库中进行分析，得到鉴定分值。本发明是基于自主建立的巴尔通体蛋白指纹图谱数据库，该数据库包括200株、21种巴尔通体参考菌株，涵盖全部重要致病种；巴尔通体是苛养菌，难生长，该数据库已经涵盖了足够多的巴尔通体菌株；实现了MALDI‑TOF MS对巴尔通体的快速、准确鉴定，缩短鉴定时间，节省操作步骤，对临床上巴尔通体病的实验室检验与诊断具有重要意义。

Description

一种巴尔通体菌株MALDI-TOF MS的数据库建立方法和鉴定 方法
技术领域
本发明属于微生物质谱检测领域，具体涉及一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的巴尔通体菌株的数据库建立方法和鉴定方法。
背景技术
巴尔通体(Bartonella species)是一群寄生于哺乳动物体内的营养要求苛刻、革兰染色阴性的需氧杆菌，宿主范围广泛，全球分布，部分种类对人和动物具有致病性，分类学上属于α-变形菌纲、根瘤菌目、巴尔通体科，目前有33种巴尔通体被正式命名，与其近源的致病菌有引起人布鲁氏菌病的布鲁氏菌和植物致病菌根癌土壤杆菌。巴尔通体侵袭哺乳动物，在其体内复制繁殖，可持续感染红细胞形成菌血症，通过动物间打斗、抓咬行为或者吸血节肢动物在宿主与宿主、宿主与人之间传播[1]，引起猫抓病、战壕热、心内膜炎和卡瑞恩病等多系统疾病，临床表现复杂多样。巴尔通体是苛养菌，生长缓慢，生化反应不活泼、没有特征性的菌落形态和染色鉴定方法，鉴定手段只能依靠DNA序列分析，增加实验室操作难度，使得诊断更为困难[2,3]。
质谱技术是上世纪发展起来的生物大分子分析技术，主要用于蛋白质、肽分子鉴定。近年，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术 (matrix assisted laserdesorption/ionization-time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS)大量应用于细菌、真菌鉴定，成为细菌微生物鉴定最成功的生物技术之一[4,5]。该技术操作简单方便，鉴定准确快速，高通量和低成本也是主要优势，目前已快速成为临床微生物实验室的常规配备。
MALDI-TOF MS技术对于巴尔通体的鉴定方法的发展无疑将是重要的补充和发展。(以上参考文献为：
[1]Breitschwerdt EB,Kordick DL.Bartonella infection in animals:carriership, reservoir potential,pathogenicity,266and zoonotic potential forhuman infection. Clinical Microbiology Reviews,2000,13(3):428.267.
[2]Breitschwerdt EB.Bartonellosis,One Health and all creatures greatand small.Veterinary Dermatology,268 2017,28(1):21-96.269.
[3]Buffet JP,Kosoy M,Vayssier-Taussat M.Natural history ofBartonella- infecting rodents in light of new 270knowledge on genomics,diversity and evolution. Future Microbiology,2013,8(9):1117-1128.271.
[4]Schubert S,Kostrzewa M.MALDI-TOF MS in the MicrobiologyLaboratory: Current Trends.Current Issues 272in Molecular Biology,2017,23:17-20.273.
[5]Van Belkum A,Welker M,Pincus D,Charrier JP,Girard V.Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization 274Time-of-Flight Mass Spectrometry inClinical Microbiology:What Are the Current Issues？Annals of Laboratory275Medicine, 2017,37(6):475-483.)
国内尚无对于巴尔通体质谱鉴定方法的研究，且进口和国产的微生物 MALDI-TOFMS仪的数据库中均无巴尔通体的参考蛋白指纹图谱，在疾控系统和临床实验室均无法应用该技术进行巴尔通体鉴定，限制了该技术在巴尔通体相关疾病诊断和控制中的应用和发展。因此，在目前的科研和实践中，需要研发出一种利用MALDI-TOF MS对巴尔通体菌株的鉴定方法。
发明内容
本发明提供一种利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的巴尔通体菌株的数据库建立方法和鉴定方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种巴尔通体菌株MALDI-TOF MS的数据库建立方法，包括如下步骤：
靶板制备步骤：将两种或更多种的备选巴尔通体菌株的点靶物分别加至靶位，干燥后加基质溶液，得到靶板；MALDI-TOF MS检测步骤：将所述靶板分别放入仪器，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测处理得到质谱图，形成所述巴尔通体菌株标准数据库。
在一些实施方式中，所述点靶物为备选菌株的新鲜菌体。
在一些实施方式中，所述建立方法还包括样品预处理步骤；所述预处理步骤中，通过乙醇-甲酸法提取得到所述备选菌株的样品蛋白溶液，作为所述点靶物。
在一些实施方式中，所述靶板制备步骤中，将同一备选菌株的点靶物滴加到8个不同靶位，将仪器校准品滴加到位于所述8个不同靶位中间的靶位上。
在一些实施方式中，所述MALDI-TOF MS检测步骤中，所述MALDI-TOF MS检测的参数设置为：在Autof Acquirer软件中选择Microbe方法，加速电压 20kV，激光源波长355nm，延迟提取时间250ns，相对激光强度为44％，频率为60Hz，累加数40，质量检测范围2-20kDa，容差300ppm；优选地，每个靶位采集3张谱图，每张谱图由3次累加组成，峰强度4000-10000，最终每个菌株获得24张图谱；优选地，在Autof Analyzer软件中设置建库参数，谱图匹配容差200ppm，最大峰数目70。
在一些实施方式中，所述MALDI-TOF MS检测步骤中，利用Autof Analyzer 软件对所述质谱图进行分析，形成所述巴尔通体菌株标准数据库。
在一些实施方式中，所述巴尔通体菌株选自：汉赛巴尔通体、伊丽莎白巴尔通体、格拉汉姆巴尔通体、科勒巴尔通体、道志巴尔通体、五日热巴尔通体、文森巴尔通体文森亚种、文森巴尔通体阿鲁潘亚种、文森巴尔通体伯格霍夫亚种、克氏巴尔通体、杆菌样巴尔通体、日本巴尔通体、黑瞎子巴尔通体、昆州巴尔通体、森林巴尔通体、库珀巴尔通体、非洲跳鼠巴尔通体、丽松鼠巴尔通体、特利波契巴尔通体、地松鼠巴尔通体和泰勒巴尔通体。
一种巴尔通体菌株MALDI-TOF MS的鉴定方法，包括如下步骤：靶板制备步骤：将待测菌株的点靶物滴加至靶位，干燥后加基质溶液，得到靶板； MALDI-TOF MS检测步骤：将所述靶板放入仪器，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测处理，得到待测菌株的质谱图；判定步骤：将所述待测菌株的质谱图在所述巴尔通体标准数据库中进行数据分析，得到鉴定分值。
在一些实施方式中，所述判定步骤中，所述鉴定分值为10分制，其中：9.5 分至10分为精确鉴定，小于9.5分且大于等于9分为可靠鉴定，小于9分且大于等于6分为可参考鉴定，小于6分为无效鉴定。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明是基于自主建立的巴尔通体MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱数据库，该数据库包括200株、21种巴尔通体参考菌株，涵盖全部重要致病种。巴尔通体是苛养菌，难生长，本发明已经将足够多的巴尔通体菌株录入数据库。
2、本发明实现了MALDI-TOF MS对巴尔通体的快速、准确鉴定，缩短了鉴定时间，节省了操作步骤，对临床上巴尔通体病的实验室检验与诊断具有重要意义。
3、本发明经重复性实验测试，质谱得分均>9分，CV值显示组内和组间测量值变异非常小，实验组内和组间上样进行谱图采集均不会影响鉴定结果，方法稳定。
4、本发明利用了MALDI-TOF MS技术的操作简便、快速和准确，操作人员只需把菌培养出来，菌量无需过多、单个菌落即可，直接涂抹在靶面上或经过预处理，装载到仪器中，简单按几次鼠标，1分钟内结果就展示出来。对于巴尔通体这种苛养菌，没有表型特征、没有生化代谢特异反应，目前只能通过PCR 测序进行鉴定，本发明建立质谱鉴定方法将大大推动临床实验室对这类细菌的识别能力。
附图说明
图1：巴尔通体MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱数据库建库靶板制备示意图。
图2：实施例1的汉赛巴尔通体的MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱之单次采集质谱图。
图3：实施例1中汉赛巴尔通体的MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱之24次采集叠加质谱图。
图4：实施例1的格拉汉姆巴尔通体的MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱之单次采集质谱图。
图5：实施例1中格拉汉姆巴尔通体的MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱之24 次采集叠加质谱图。
图6：实施例2中173株巴尔通体测试菌株质谱得分图。
图7：实施例2中汉赛巴尔通体菌株M59SHD质谱鉴定匹配图。
图8：实施例3中应用2种方法处理的巴尔通体菌株质谱得分差值分布图。
具体实施方式
第一方面，本发明提供一种利用MALDI-TOF MS的巴尔通体数据库的建立方法，上述建立方法包括如下步骤：
步骤一、备选菌株复苏培养和鉴定：将备选菌株在预处理之前先经过复苏培养和鉴定，以保证均为巴尔通体菌株。
分步骤一、复苏培养：备选菌株中，杆菌样巴尔通体(B.bacilliformis)的培养条件为：在28℃条件下，5％CO2培养箱中，用10％脱纤维羊血的TSA培养基上复苏培养；其他巴尔通体菌株的培养条件为：在37℃条件下，5％CO2培养箱中，用5％脱纤维羊血的TSA培养基上复苏培养。按菌落生长速度收获培养第4-7d，优选为4-6d的新鲜菌体。
分步骤二、鉴定：应用引物BhCS.781p-BhCS.1137n扩增巴尔通体属的特异性基因枸橼酸合酶基因进行分类鉴定；序列校对后用GenBank进行比对，确定是否为巴尔通体。
上述备选菌株均为巴尔通体菌株，包括：汉赛巴尔通体(B.henselae)、伊丽莎白巴尔通体(B.elizabethae)、格拉汉姆巴尔通体(B.grahamii)、科勒巴尔通体(B.koehlerae)、道志巴尔通体(B.doshiae)、五日热巴尔通体(B. quintana)、文森巴尔通体文森亚种(B.vinsonii subsp.vinsonii)、文森巴尔通体阿鲁潘亚种(B.vinsoniisubsp.arupensis)、文森巴尔通体伯格霍夫亚种(B. vinsonii subsp.berkhoffii)、克氏巴尔通体(B.clarridgeiae)、杆菌样巴尔通体 (B.bacilliformis)、日本巴尔通体(B.japonica)、黑瞎子巴尔通体(B. heixiaziensis)、昆州巴尔通体(B.queenslandensis)、森林巴尔通体(B.silvatica)、库珀巴尔通体(B.coopersplainsensis)、非洲跳鼠巴尔通体(B.jaculi)、丽松鼠巴尔通体(B.callosciuri)、特利波契巴尔通体(B.tribocorum)、地松鼠巴尔通体(B.washoensis)和泰勒巴尔通体(B.taylorii)。
步骤二、样品预处理：将备选菌株进行预处理，得到样品蛋白溶液。
上述预处理包括：利用乙醇-甲酸提取法得到样品蛋白溶液。
分步骤一：挑取鉴定正确的巴尔通体新鲜菌体加入到去离子水中，震荡混匀；再加入无水乙醇混匀，得到保存液于-40℃保存，也可以直接进行之后的处理。
分步骤二：再将上述保存液进行离心处理，5000-15000r/min，1-4min，优选为10000r/min，2min，离心次数优选为2次，每次均弃上清液保留沉淀物。
分步骤三：再将上述沉淀物在室温干燥后，加入含甲酸的裂解液(例如：该裂解液仅有甲酸)，震荡混匀，再加入含乙腈的裂解液(例如：该裂解液仅有乙腈)，震荡混匀，得到菌体裂解物。
分步骤四：再将上述菌体裂解物进行离心处理，5000-15000r/min，1-4min，优选为10000r/min，2min，取上清液，即为样品蛋白溶液，该样品蛋白溶液作为点靶物。
上述新鲜菌体和去离子水的质量比为1：(30-60)，上述新鲜菌体和无水乙醇的质量体积比为1：(90-180)，上述新鲜菌体和含甲酸的裂解液的质量体积比为1：(5-10)，上述新鲜菌体和含乙腈的裂解液的质量体积比为1：(5-10)。上述质量体积比指的是：新鲜菌体的质量与无水乙醇的体积、或与含有甲酸的裂解液的体积、或与含有乙腈的裂解液的体积之间的比例。例如：取新鲜菌体5 mg，加入无水乙醇900μL，之后加入含有甲酸的裂解液50μL，之后再加入含有乙腈的裂解液50μL，则新鲜菌体与无水乙醇的质量体积比为1:180，新鲜菌体与含有甲酸的裂解液的质量体积比为1:10，新鲜菌体与含有乙腈的裂解液的质量体积比为1:10。
步骤三、靶板制备：将上述样品蛋白溶液滴加至靶位，干燥后加基质溶液 (优选为α-CHCA饱和溶液)，干燥后得到靶板。优选地，在每行3个×每列3 个的9个靶位中，将同一备选菌株的蛋白溶液滴加到8个不同靶位，将仪器校准品滴加到上述8个不同靶位之外的那个靶位，滴加校准品的靶位位于滴加蛋白溶液的8个靶位的中间，参见图1。
在现有技术中，每个平行样品仅重复在两个样品孔点样，这样对于靶板位点不同引起的误差不能很好地解决。
本发明中，将校准品滴加到8个样品靶位的中心靶点上，且每个样品靶位采集3张累加图谱，每个菌株共采集24张图谱，所以就有效地解决了因靶点位置不同引起的误差。
上述样品预培养处理步骤也可以省略，直接在步骤一之后通过直接涂抹的方式进行靶板制备，具体操作包括：
挑取步骤一鉴定正确的巴尔通体新鲜菌体的1-2个单菌落作为点靶物，在靶位上涂抹均匀，干燥后覆盖的基质溶液，得到靶板。以备将样品靶放入质谱仪进行鉴定。
对于一般生长在固体琼脂平板上的细菌，直接涂靶是常规做法，有效的节省了中间步骤、试剂和操作过程中增加污染的可能性，是最简单、快速有效的方法，在临床实验室中广泛应用。但是，在某些细菌或特殊菌株的鉴定时，乙醇–甲酸或者乙酸–乙腈等提取法可以增加细菌蛋白的裂解质量，提高鉴定准确率。巴尔通体菌落小但是形态多样，有些干燥，有些向琼脂平板下陷生长，还有些粘滑不易挑取，一次直涂操作不易成功，这种情况下提取法是良好的解决办法。
步骤四、MALDI-TOF MS检测：将上述靶板放入仪器，进行MALDI-TOF MS 检测处理，得到质谱图，形成巴尔通体菌株标准数据库，又称为巴尔通体 MALDI-TOF MS蛋白指纹谱图数据库。
上述MALDI-TOF MS的参数设置为：
在Autof Acquirer软件中选择Microbe方法，加速电压20kV，激光源波长 355nm，延迟提取时间250ns，相对激光强度为44％，频率为60Hz，累加数 40，质量检测范围2-20kDa，容差300ppm；
优选地，每个靶位采集3张谱图，每张谱图由3次累加组成，峰强度 4000-10000，最终每个菌株获得24张图谱；
优选地，上述MALDI-TOF MS的建库参数设置为：
在Autof Analyzer软件中设置所述建库参数，谱图匹配容差200ppm，最大峰数目70。
上述设定的参数值均为适用于巴尔通体菌图谱采集的参数；加速电压、激光源波长和延迟提取时间为细菌建库适宜参数；若上述激光强度过低将影响峰强度，使其达不到最低要求的峰强度4000，频率和累加数不足，影响图谱采集，使得所获图谱代表性不足。
第二方面，本发明提供基于第一方面所述的巴尔通体数据库的巴尔通体鉴定方法，该鉴定方法包括：
步骤一、待测菌株培养：将待测菌株在预处理之前先经过复苏培养，得到新鲜菌体。
具体的培养方法的操作和参数如第一方面所述。
MALDI-TOF MS识别细菌体内稳定且丰富的核糖体蛋白，质量在2-20kDa 之间，因此，相较于其他化学分类法如细胞壁脂肪酸法，不易受培养条件的影响，全菌蛋白质谱峰信号稳定，有利于鉴定和比较。依据常规方法，操作人员选取统一培养条件的、平板培养的对数和稳定生长期的菌落，通常为4–6d，虽然有些种类如杆菌样巴尔通体生长更为缓慢，这也使得一切基于菌落培养的鉴定方法降低了检测速度，成为MALDI-TOF MS鉴定巴尔通体的限速步骤，但是，一旦平板上开始出现菌落就可以快速完成鉴定。
步骤二、样品预处理：将新鲜菌体进行预处理，得到样品蛋白溶液作为点靶物。
具体的预处理方法的操作和参数如第一方面所述。步骤二所需要的总时间优选为1-10min。
上述样品预培养处理步骤也可以省略，直接在步骤一之后通过直接涂抹的方式进行靶板制备，具体操作方式和参数如第一方面所述。
步骤三、靶板制备：将上述样品蛋白溶液滴加至靶位，干燥后加基质溶液 (优选为α-CHCA饱和溶液)，得到靶板。
具体的靶位设置方式如第一方面所述。步骤三所需要的总时间优选为不多于3min。
步骤四、MALDI-TOF MS检测：将上述靶板放入仪器，进行MALDI-TOF MS 检测处理，得到待测菌株的质谱图。
具体的MALDI-TOF MS参数设置如第一方面所述。步骤四设置参数、编辑样品表单、采集图谱鉴定并输出结果的时间优选为不大于1min。
步骤五、判定：将待测菌株的质谱图在第一方面所述的数据库中进行分析比对和判断，得到该待测菌株的鉴定分值，以此鉴定该待测菌株是否属于数据库中所记录的巴尔通体菌株品种。
鉴定分值为10分制，9.5分至10分为精确鉴定，小于9.5分且大于等于9 分为可靠鉴定，小于9分且大于等于6分为可参考鉴定，小于6分为无效鉴定。
下面结合实例对本发明作进一步的说明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。对外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下实施例的采用的仪器和试剂如下：
Autof ms1000全自动微生物质谱检测系统(郑州安图实验仪器有限公司)， 371型CO2培养箱(美国Thermo公司)，NU-425-600E生物安全柜(美国 NUAIRE公司)，LabCyclerPCR仪(德国SensoQuest公司)；胰酶大豆琼脂(TSA) 和脑心浸液(BHI)培养基(美国BD公司)，三氟乙酸(质谱级，Fluka)，α- 氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA，质谱级，美国Sigma-Aldrich)，质谱样本预处理试剂盒、质谱仪校准品和样品靶板(郑州安图实验仪器有限公司)。
以下实施例的采用的实验菌株如下：
实施例1中，选取200株、21种巴尔通体菌株用于建立MALDI-TOF MS 鉴定数据库，其中包含11种巴尔通体ATCC标准菌(表1第3列)。实施例2 中，应用173株巴尔通体野生分离菌株用于评价所建数据库的鉴定可信度(表1 第4列)。所用实验菌株由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室提供。
表1：用于建立和评价巴尔通体菌MALDI-TOF-MS数据库的菌株信息
Figure BDA0002368417700000091
注：1、*为致病性巴尔通体；2、“本实验室”为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室；“本实验室”的巴尔通体菌株可以从公共的菌种保藏中心或者利用现有技术分离获得。
实施例1
本实施例为利用MALDI-TOF MS的巴尔通体数据库的建立方法，该方法包括以下步骤：
(1)巴尔通体菌株培养和鉴定
表1的巴尔通体菌株(备选菌株)中，杆菌样巴尔通体(B.bacilliformis) 的培养条件为：在28℃条件下，5％CO2培养箱中，在10％脱纤维羊血的TSA 培养基上复苏培养。其他巴尔通体菌株的培养条件为：在37℃条件下，5％CO2培养箱中，70％湿度环境下培养，在5％脱纤维羊血的TSA培养基上复苏培养。按菌落生长速度收获培养第4-6d的新鲜菌体。
应用引物BhCS.781p-BhCS.1137n扩增巴尔通体属的特异性基因枸橼酸合酶基因(Citrate synthase gene，gltA)进行分类鉴定[6]。鉴定所使用的PCR引物如下：上游引物BhCS781.p：5′-GGGGACCAGCTCATGGTGG-3′；下游引物 BhCS1137.n：5′-AATGCAAAAAGAACAGTAAACA-3′。
简述如下，挑取适量菌落加ddH2O后100℃加热制备粗制DNA模板，用高保真扩增酶PCR反应扩增DNA模板，通过常规方式进行扩增，将产物送北京奥科鼎盛生物技术有限公司测序。序列校对后用BLAST进行同源搜索，确定是否为巴尔通体。
(上述参考文献[6]为：Norman AF,Regnery R,Jameson P,Greene C,KrauseDC.Differentiation of Bartonella-like isolates at the species level by PCR-restriction fragment length polymorphism in the citrate synthase gene.Journalof Clinical Microbiology,1995,33(7):1797-1803.)
(2)样品预处理
在1.5mL离心管中加入300μL去离子水，取适量(5-10mg)巴尔通体菌新鲜培养物(即鉴定确定是巴尔通体菌株的新鲜菌体)，漩涡震荡，再加入900μL 无水乙醇充分混匀，检测前置于-40℃保存。将上述含样品的保存液10000r/min 离心2min，重复离心弃上清液，室温干燥沉淀2-3min，加50μL裂解液1(含甲酸)漩涡震荡混匀，再加50μL裂解液2(含乙腈)混匀，10000r/min离心2 min，保留上清液，为样品蛋白溶液。
其中，裂解液1和裂解液2均来自安图实验仪器(郑州)有限公司的质谱样本预处理试剂盒的试剂。
(3)靶板制备
取1μL上清液(样品蛋白溶液)，滴加到样品靶上，晾干至样品点无明显水迹，再取1μL基质溶液(α-CHCA饱和溶液)覆盖在样品点上，晾干至样品点无明显水迹。
将同一备选菌株的样品蛋白溶液滴加到8个不同的靶位，同时选择一个靶位滴加仪器校准品，点样方式如图1所示；干燥后加基质溶液，结晶完成后，放入质谱仪，每株菌建库之前先按照仪器校准要求校准仪器。校准峰值为 3637.772、4365.343、5096.776、5381.446、6255.444、7274.467、10300.032、 13683.173和16952.332，按照仪器校准要求进行自动校准，达到4个峰值符合即为校准成功。
(4)MALDI-TOF MS检测：将上述靶板放入仪器，进行MALDI-TOF MS 检测处理，得到质谱图，针对所有备选菌株，形成上述巴尔通体菌株标准数据库。
MALDI-TOF MS参数设置及数据采集：
针对某一个菌株，在Autof Acquirer软件中选择Microbe方法，加速电压20 kV，激光源波长355nm，延迟提取时间250ns，相对激光强度为44％，频率为 60Hz，累加数40，质量检测范围2-20kDa，容差300ppm；每个靶位采集3张谱图，每张谱图由3次累加组成，峰强度4000-10000，最终每个菌株获得24张图谱。在Autof Analyzer软件中设置建库参数，谱图匹配容差200ppm，最大峰数目70。
至此，巴尔通体MALDI-TOF MS蛋白指纹谱图数据库建立完成。应用标准建库方法采集了200株巴尔通体菌的蛋白指纹图谱，包含汉赛、五日热、杆菌样、文森和伊丽莎白等主要致病性巴尔通体，建立了拥有21种(包括3个亚种) 巴尔通体MALDI-TOF MS蛋白指纹图谱数据库。
这200株来自不同地区巴尔通体菌株在种水平的主要离子峰一致，每株菌 24次采集峰谱数据稳定，最终形成每个种的巴尔通体标准蛋白指纹图谱，以汉赛巴尔通体标准菌株为例，展示单次质谱图(图2)和24次叠加图(图3)。以格拉汉姆巴尔通体标准菌株为例，展示单次质谱图(图4)和24次叠加图(图 5)。
(5)建库后的再验证：建库后，每株菌株按照样品模式进行谱图采集打靶验证，即采用步骤(1)-(4)的操作，将表1中所有的菌株再进行MALDI-TOF MS检测得到质谱图，总得分范围(平均值±标准差)为9.019-9.863(9.631±0.156) (表2)，全部为9分以上，符合可靠或精确鉴定。
得分的判断方法为：对某个待测菌株进行MALDI-TOF MS检测，得到一个图谱；在鉴定时，利用Autof ms1000全自动微生物质谱检测系统的Autof Acquirer 软件，将该图谱与数据库中所有菌株的图谱进行比较，最后给出10个匹配结果，其中第一个结果得分最高，最后数据均选择得分最高的结果，即该待测菌株即为最高得分所对应的数据库所记录的菌种。
MALDI-TOF MS的工作原理如下：
仪器工作部分有两大模块：基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品靶板上的样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比，检测离子。最后由数字控制系统将信号输出得到质谱图谱。被测高分子样品以一定的比例与一小分子基质化合物溶液相混合，使得所测高分子以单分子状态分散在基质中，自然干燥后在真空下用脉冲激光照射，样品和基质混合点在样品靶板上形成共结晶，脉冲激光照射晶体后，基质分子吸收能量与样品解吸附并使其电离(通常是基质的质子转移到样品分子上)。样品离子在加速电场下获得相同动能，经高压加速、聚焦后进入飞行时间检测器，离子的质荷比与飞行时间的平方成正比，从而对样品进行分析，通过与数据库信息比对，筛选并确定相应图图谱，进而得到鉴定结果，从而实现对不同细菌属、种的鉴定。
表2：巴尔通体菌株质谱鉴定结果
Figure BDA0002368417700000121
Figure BDA0002368417700000131
实施例2：野生菌株实测
本实施例为利用实施例1建立的MALDI-TOF MS的巴尔通体标准数据库，鉴定待测菌株(14种、共计173株)是否为巴尔通体的方法，该方法包括以下步骤：
(1)巴尔通体菌株培养和鉴定：
将待测菌株复苏培养，得到新鲜菌体；再对新鲜菌体进行PCR反应并测序，确定是否为巴尔通体。具体操作方法和参数如实施例1所述。
(2)样品预处理：
将鉴定后的新鲜菌体进行预处理，得到样品蛋白溶液。具体操作方法和参数如实施例1所述。
(3)靶板制备：
将样品蛋白溶液滴加至靶位，制备为靶板。具体操作方法和参数如实施例1 所述。
(4)MALDI-TOF MS检测：
将上述靶板放入仪器，进行MALDI-TOF MS检测处理，得到待测菌株的质谱图。具体的MALDI-TOF MS参数设置及数据采集设置如实施例1所述。
(5)判定：将待测菌株的质谱图在实施例1建立的巴尔通体MALDI-TOF MS蛋白指纹谱图数据库验证。
将14种、共计173株巴尔通体菌株基于新建的巴尔通体数据库进行质谱鉴定。这173株菌已经在步骤(1)经过gltA基因扩增、测序鉴定到种水平。173 株测试菌株全部鉴定到巴尔通体种水平，总得分为9.014-9.796(9.462±0.195)，全部菌株均在9分以上(如图6)，准确率为100％，与步骤(1)的PCR产物测序结果完全相符。以菌株M59SHD为例，质谱鉴定结果前10位均为数据库中汉赛巴尔通体菌株，得分为9.505-9.642，匹配最高分为ATCC标准菌株(如图7，图7中水平轴以上为新建数据库中汉赛巴尔通体ATCC标准菌株，以下为测试菌株M59SHD，该菌株由本实验室分离培养)。
实施例3：不同样品处理方法对巴尔通体MALDI-TOF MS鉴定结果的影响
本实施例为利用实施例1建立的MALDI-TOF MS的巴尔通体标准数据库，鉴定待测菌株(13种、共计60株，同时采用提取法和直涂法两种方法处理)是否为巴尔通体的方法，并采用2种不同的样品处理方式，每种方式的步骤如下：
方式1：鉴定方法如实施例2所述，预处理中采用乙醇-甲酸提取法。
方式2：鉴定方法包括：
(1)巴尔通体菌株培养和鉴定：
将待测菌株复苏培养，得到新鲜菌体；再对新鲜菌体进行PCR反应并测序，确定是否为巴尔通体。具体操作方法和参数如实施例1所述。
(2)靶板制备：
用接种针在新鲜的培养菌落(新鲜菌体)中挑选1-2个单菌落，在靶板上涂抹均匀，干燥后覆盖1μL的基质溶液。
(3)MALDI-TOF MS检测：
将上述靶板放入仪器，进行MALDI-TOF MS检测处理，得到待测菌株的质谱图。具体的MALDI-TOF MS参数设置及数据采集设置如实施例1所述。
(4)判定：将待测菌株的质谱图在实施例1建立的巴尔通体MALDI-TOF MS蛋白指纹谱图数据库验证。
鉴定结果的比较：不同样品处理方法对巴尔通体MALDI-TOF MS鉴定结果的影响如下：
2种不同样品处理方法分别对60株、13种巴尔通体菌株MALDI-TOF MS 鉴定得分均>9分，符合可靠或精确鉴定。乙醇-甲酸提取法处理细菌培养物再涂板，全部菌株得分为9.067-9.775，直接涂抹得分为9.016-9.689，准确率均为100％。两种处理方法的质谱得分比较，差异有统计学意义，P＝0.000(见表3)，有44 株采用乙醇-甲酸提取法处理后的菌株质谱得分高于直接涂抹法得分(如图8，图8为采用乙醇-甲酸提取法与直接涂抹法质谱得分差值作图，纵坐标1-60为样品，横坐标为差值)。
表3：不同样品处理方法的巴尔通体MALDI-TOF MS鉴定结果
Figure BDA0002368417700000151
注：*2种处理方法差异有统计学意义，P＝0.000(Z＝-4.366，Wilcoxon带符号秩检验)。
实施例4：重复性实验
本实施例为利用实施例1建立的MALDI-TOF MS的巴尔通体数据库，鉴定待测菌株是否为巴尔通体的重复性实验。
选择8种巴尔通体，每种包含建库菌株和测试菌株各1株，进行MALDI-TOF MS鉴定的重复性实验。每株菌每次采集6个重复靶点质谱得分，共计重复6次实验。具体操作方法和参数如实施例2所述。
上述8种、16株巴尔通体在各自的组内及组间重复实验中质谱得分均>9分，均值为9.078±0.031至9.776±0.006，鉴定正确；组间CV值在0.06％-1.12％之间，实验结果重复性好，质谱得分稳定(表4)。
表4：MALDI-TOF MS鉴定巴尔通体菌株的重复性
Figure BDA0002368417700000152
Figure BDA0002368417700000161
注:a,建库菌株；b,测试菌株。

Claims (9)

1.一种巴尔通体菌株MALDI-TOF MS的数据库建立方法，所述建立方法包括如下步骤：
靶板制备步骤：将两种或更多种的备选巴尔通体菌株的点靶物分别加至靶位，干燥后加基质溶液，得到靶板；
MALDI-TOF MS检测步骤：将所述靶板分别放入仪器，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测处理得到质谱图，形成巴尔通体菌株标准数据库。
2.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于：所述点靶物为备选菌株的新鲜菌体。
3.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于：所述建立方法还包括样品预处理步骤；所述预处理步骤中，通过乙醇-甲酸法提取得到所述备选菌株的样品蛋白溶液，作为所述点靶物。
4.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于：所述靶板制备步骤中，将同一备选菌株的点靶物滴加到8个不同靶位，将仪器校准品滴加到位于所述8个不同靶位中间的靶位上。
5.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于：所述MALDI-TOF MS检测步骤中，所述MALDI-TOF MS检测的参数设置为：
在Autof Acquirer软件中选择Microbe方法，加速电压20kV，激光源波长355nm，延迟提取时间250ns，相对激光强度为44％，频率为60Hz，累加数40，质量检测范围2-20kDa，容差300ppm；
优选地，每个靶位采集3张谱图，每张谱图由3次累加组成，峰强度4000-10000，最终每个菌株获得24张图谱；
优选地，在Autof Analyzer软件中设置建库参数，谱图匹配容差200ppm，最大峰数目70。
6.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于：所述MALDI-TOF MS检测步骤中，利用Autof Analyzer软件对所述质谱图进行分析，形成所述巴尔通体菌株标准数据库。
7.根据权利要求1-5中任一项所述建立方法，其特征在于：所述巴尔通体菌株选自：汉赛巴尔通体、伊丽莎白巴尔通体、格拉汉姆巴尔通体、科勒巴尔通体、道志巴尔通体、五日热巴尔通体、文森巴尔通体文森亚种、文森巴尔通体阿鲁潘亚种、文森巴尔通体伯格霍夫亚种、克氏巴尔通体、杆菌样巴尔通体、日本巴尔通体、黑瞎子巴尔通体、昆州巴尔通体、森林巴尔通体、库珀巴尔通体、非洲跳鼠巴尔通体、丽松鼠巴尔通体、特利波契巴尔通体、地松鼠巴尔通体和泰勒巴尔通体。
8.一种巴尔通体菌株MALDI-TOF MS的鉴定方法，该鉴定方法包括：
靶板制备步骤：将待测菌株的点靶物滴加至靶位，干燥后加基质溶液，干燥后得到靶板；
MALDI-TOF MS检测步骤：将所述靶板放入仪器，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测处理，得到待测菌株的质谱图；
判定步骤：将所述待测菌株的质谱图在如权利要求1所述巴尔通体菌株标准数据库中进行数据分析，得到鉴定分值。
9.根据权利要求8所述鉴定方法，其特征在于：所述判定步骤中，所述鉴定分值为10分制，其中：9.5分至10分为精确鉴定，小于9.5分且大于等于9分为可靠鉴定，小于9分且大于等于6分为可参考鉴定，小于6分为无效鉴定。
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