CN102253111A - Maldi-tof ms辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
MALDI-TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法，包括如下步骤：①选取35～40株单增李斯特氏菌新鲜培养物，进行样品预处理；②采集所有菌株样品的图谱；③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化得单增李斯特氏菌标准图谱；④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱；⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱与步骤③所得的单增李斯特氏菌标准图谱对比，根据匹配分数判定检测结果。本发明成功创建了单增李斯特氏菌鉴定质谱图数据库及标准图谱，可以实现对单增李斯特氏菌简便、可微量化、高度自动化的准确鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及单增李斯特氏菌的检测新方法，尤其是利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)辅助鉴定的方法。
背景技术
单增李斯特氏菌是一种人畜共患病病原菌。该菌可引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症及造成孕妇流产、死胎等疾病。孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷人是易感人群。食源性李斯特氏菌发病率虽不高，但死亡率有时可达20％～50％。WHO在20世纪90年代已将其列为食品四大致病菌之一。该菌在自然界分布广泛，以家畜、家禽为主要宿主，很容易污染食品而引起食物中毒和李斯特病暴发[4]。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源[5]。
单增李斯特氏菌检测方法是进行增菌、选择性分离培养、初筛试 b验、鉴定等步骤。这种方法耗时长，程序繁琐，试剂和人力成本均较高。此外，还有免疫磁性分析法(用免疫磁珠捕集法快速检测食品中的单核细胞增生李斯特菌.检验检疫学，2001，11(6)：12-13)、PCR法(Application of 5′-Nuclease PCR forquantitative detection of L isteria monocy tog enes in pure cultures，water，skim milk，and unpasteurized milk.Applied and E nvironment Microbiology，2000，66(10)：4266-4271)、实时PCR法(Rapid detection of L isteria monocy tog enes in foodusing culture enrichment combined with real-time PCR.Food Microbiology，2009，26(1)：4-7.)等许多快速检测方法。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近几年发展起来的一种新型软电离生物质谱。它能完成细菌多种成分的分析，包括蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子。细菌含有一些成分，能给出唯一的质荷比，作为生物标志分子特异鉴定细菌。由于其具有快速、准确、灵敏、分辨率高和高质量检测范围等优点，MALDI-TOF-MS已经逐渐成为临床诊断、食品生产、环境检测以及军事领域研究的一种有力手段。但是细菌比对标准数据库的资源不足是其局限性之一(Rapid typing of bacteria using matrix-assisted laser desorption ionisationtime-of-flight mass spectrometry and pattern recognition software. J MicrobiolMethods 2002；48：127-38)。目前，Biotyper数据库仍需要不断补充单增李斯特氏菌的特征谱图。因此，需要获得特征指纹图谱，添加创建质谱图数据库，并进一步开展单增李斯特氏菌鉴定和分子分型研究。
发明内容
本发明的目的之一在于提供MALDI-TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法，包括如下步骤：
①选取35～40株单增李斯特氏菌新鲜培养物，进行MALDI-TOF-MS检测前的样品预处理；
②采集所有菌株样品的MALDI-TOF-MS图谱；
③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为单增李斯特氏菌标准图谱；
④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；
⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱；
⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱与步骤③所得的单增李斯特氏菌标准图谱对比，根据匹配分数判定检测结果。
上述本发明的方法中所述的步骤①的预处理方法是：取单增李斯特氏菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300μL纯净水，挑取5～10mg微生物培养物，混匀，再加入900μL无水乙醇，混匀后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50μL70％甲酸，混匀，再加入50μL乙腈，混匀，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干1h后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μL，晾干5min后用于后续检测。
上述本发明的方法中所述的步骤②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行图谱采集，仪器参数设定为：线性操作模式，正离子模式；检测质量范围：3000～13000Da；激光点击数：每个图谱50；激光频率：30.0Hz；离子源加速电压：20kv；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800～17378Da。
上述本发明中所述的步骤⑥根据匹配分数判定检测结果的标准为：
当2.300≤匹配分数≤3.000，表示菌种鉴定的可信度很高；
当2.000≤匹配分数＜2.300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；
当1.700≤匹配分数＜2.000之间，表示可能的菌属鉴定；
在0.000≤匹配分数＜1.700之间，表示不可信的鉴定。
最为优选地，本发明所述的MALDI-TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法包括如下步骤：
①选取37株单增李斯特氏菌，取新鲜培养物进行MALDI-TOF-MS检测前的样品预处理：取单增李斯特氏菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300μL纯净水，挑取5～10mg微生物培养物，混匀，再加入900μL无水乙醇，混匀后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50μL70％甲酸，混匀，再加入50μL乙腈，混匀，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干1h后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μL，晾干5min后用于后续检测；
②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集所有菌株样品的MALDI-TOF-MS图谱，器参数设定为：线性操作模式，正离子模式；检测质量范围：3000～13000Da；激光点击数：每个图谱50；激光频率：30.0Hz；离子源加速电压：20kv；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800～17378Da；
③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为单增李斯特氏菌标准图谱；
④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；
⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱；
⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱与步骤③所得的单增李斯特氏菌标准图谱对比，根据匹配分数按照下述原则判定检测结果：
当2.300≤匹配分数≤3.000，表示菌种鉴定的可信度很高；
当2.000≤匹配分数＜2.300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；
当1.700≤匹配分数＜2.000之间，表示可能的菌属鉴定；
在0.000≤匹配分数＜1.700之间，表示不可信的鉴定。
本发明的目的之二在于提供建立MALDI-TOF MS单增李斯特氏菌标准图谱的方法，包括上述本发明的“MALDI-TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”技术方案中的步骤①～③，即：
①选取35～40株单增李斯特氏菌新鲜培养物，进行MALDI-TOF-MS检测前的样品预处理；
②采集所有菌株样品的MALDI-TOF-MS图谱；
③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为单增李斯特氏菌标准图谱。
其中各个步骤的优选手段与前文所述的相同。基于此，建立MALDI-TOF MS单增李斯特氏菌标准图谱的方法的最优选技术方案是：
①选取37株单增李斯特氏菌，取新鲜培养物进行MALDI-TOF-MS检测前的样品预处理：取单增李斯特氏菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300μL纯净水，挑取5～10mg微生物培养物，混匀，再加入900μL无水乙醇，混匀后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50μL70％甲酸，混匀，再加入50μL乙腈，混匀，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干1h后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μL，晾干5min后用于后续检测；
②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集所有菌株样品的MALDI-TOF-MS图谱，器参数设定为：线性操作模式，正离子模式；检测质量范围：3000～13000Da；激光点击数：每个图谱50；激光频率：30.0Hz；离子源加速电压：20kv；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800～17378Da；
③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为单增李斯特氏菌标准图谱。
本发明的另一目标在于提供由上述方法建立的单增李斯特氏菌标准图谱。
本发明通过采集37株单增李斯特氏菌分离株的数据并获得特征指纹图谱，成功创建了单增李斯特氏菌鉴定质谱图数据库及标准图谱，可以实现对单增李斯特氏菌的准确鉴定。并且该方法操作上制样简便、可微量化、高度自动化。
附图说明
本发明附图2幅，
图1是本发明的单增李斯特氏菌的MALDI-TOF MS标准图谱；
图2是本发明的37株单增李斯特氏菌MALDI-TOF MS聚类分型树状图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明的技术方案及其应用，但不以任何方式限制本发明。如无特殊说明，本发明所使用的仪器和试剂包括：
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(Microflex LRF20，Bruker DaltonikGmbH公司)；
全自动细菌生化分析仪(BD PHOENIX-100，美国BD公司)。
α-氰-4-羟基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid，CHCA)，
乙腈(Acetonitrile，ACN)，
三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)，
肽标准品，蛋白标准品。
上述试剂均购自Bruker Daltonik GmbH公司。
检测样品配置基质的溶剂为ACN∶TFA∶水(50∶2.5∶47.5)。标准肽溶液配置基质的溶剂为ACN∶TFA∶水(30∶0.1∶69.9)。
MALDI-TOF-MS基质溶液是用溶剂将基质配成饱和溶液，基质溶液现用现配。营养琼脂(Nutrient Agar，NA)，均购于美国BD公司。API-20E生化鉴定试剂盒购于法国梅里埃公司。
实施例1
(1)选取标准单增李斯特氏菌菌株
选取由辽宁出入境检验检疫局收集保藏的37株单增李斯特氏菌，具体信息见表1。表1中所涉及的单增李斯特氏菌菌株经API-20E生化鉴定和全自动细菌生化分析仪鉴定，进一步确认为单增李斯特氏菌无误，可用于建立MALDI-TOFMS鉴定标准图谱。
表1
| 序号 | 菌株编号 | 序号 | 菌株编号 | 序号 | 菌株编号 | 序号 | 菌株编号 |
| 1 | DD-L20 | 11 | DD-L37 | 21 | SD-L-A5-6 | 31 | GD-L16 |
| 2 | DD-L21 | 12 | DD-L44 | 22 | SD-L-DAH1-11 | 32 | GD-L17 |
| 3 | DD-L25 | 13 | DD-L51 | 23 | SD-L-F1-1 | 33 | GD-L18 |
| 4 | DD-L26 | 14 | DD-L52 | 24 | GD-L5 | 34 | GD-L19 |
| 5 | DD-L29 | 15 | DD-L54 | 25 | GD-L6 | 35 | GD-L26 |
| 6 | DD-L31 | 16 | DD-L55 | 26 | GD-L9 | 36 | GD-L27 |
| 7 | DD-L32 | 17 | DD-L58 | 27 | GD-L10 | 37 | GD-L28 |
| 8 | DD-L33 | 18 | SD-L-A2-5 | 28 | GD-L12 | ||
| 9 | DD-L35 | 19 | SD-L-A5-5 | 29 | GD-L14 | ||
| 10 | DD-L36 | 20 | SD-L-A5-15 | 30 | GD-L15 |
(2)样品处理：
将单增李斯特氏菌分离株分别接种于NA培养基上，37℃培养24h，得到新鲜菌株培养物。取单增李斯特氏菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300μL纯净水，挑取适量(5～10mg)细菌，混匀，再加入900μL无水乙醇，混匀后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50μL70％甲酸，混匀，再加入50μL乙腈，混匀，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干1h后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μL。晾干5min后进样。
(3)MALDI-TOF MS图谱采集
将上样的样品板小心置于板孔中，加有样品一面朝上。盖上盖子，抽真空。打开仪器控制软件FlexControl，调好仪器参数，校准仪器。采集标准品及样品的质谱图。对采集的数据进行保存，每次试验前都要在采集数据的质量范围内使用标准肽蛋白进行校准，校正后进行质谱数据采集，通过Biotyper软件进行分析鉴定。
取每个菌株培养物再分别平行接种5个NA斜面，37℃培养24h，得到5个平行样品。按1.2.2.1的方法进行样品处理与点样，每个平行样品重复点两个样品孔。每株菌共点10个样品孔。校准仪器后，点击样品孔采集数据，每个样品孔点击10次，采集2个质谱图。每株菌可以采集20个质谱图。使用BioTyper软件，分别调入所采集的每株单增李斯特氏菌的20个质谱图，将此20个质谱图汇总生成整合图谱，对所得的图谱进行分析统一化，该图谱便是单增李斯特氏菌质谱图数据库的标准图谱(如附图1所示)，显示单增李斯特氏菌MALDI-TOF MS标准图谱的主要离子峰为m/z3252.30、3702.88、4325.83、4878.28、6365.26、7405.70、9757.97。
(4)待测样品制备，待测样品包括：
A组：标准菌株单增李斯特氏菌1a血清型ATCC 19111、2a血清型ATCC19112、4a血清型ATCC 19114、4b血清型ATCC 19115、4e血清型ATCC 19118、不溶血型ATCC 15313、ATCC BAA-751、ATCC 7644、NCTC 10890；
A组标准菌株分别购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和中国国家标准菌库(NCTC)；
B组：50株待测微生物(菌落形态疑似单增李斯特氏菌)，分离自：进口自朝鲜的冻章鱼、冻海螺、冻青柳蛤；进口自美国的冻猪耳；进口自新西兰的冻带鱼等样品。
该部分微生物样品的制备方法同上述步骤(2)。
(5)待测样品MALDI-TOF MS图谱采集，方法同上述步骤(3)。
(6)图谱比对及分析，采用的判断标准是：
当2.300≤匹配分数≤3.000，表示菌种鉴定的可信度很高；
当2.000≤匹配分数＜2.300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；
当1.700≤匹配分数＜2.000之间，表示可能的菌属鉴定；
在0.000≤匹配分数＜1.700之间，表示不可信的鉴定。
对比分析结果如下：
A组样品图谱分别与本发明所建立的单增李斯特氏菌标准图谱比对，匹配分数均大于2.300，报告为单增李斯特氏菌，与已知值完全符合，鉴定结果的可信度很高；
B组样品图谱分别与本发明所建立的单增李斯特氏菌标准图谱比对，其中15株匹配分数大于2.300，报告为单增李斯特氏菌。该15株菌采用经典的生化鉴定方法进行验证检测，主要生理生化特征为革兰氏阳性小杆菌，菌株刺种到5％的绵羊血或马血琼脂平板上，35℃培养48h，在明亮的光照下，观察经穿刺的血琼脂平板，可见产生界限明显的较大溶血环现象；做进一步的生化试验，生化反应表现为：触酶试验阳性；分解葡萄糖、鼠李糖、水杨苷，不分解蔗糖、木糖、甘露醇；吲哚、尿素酶和硝酸盐还原试验阴性，甲基红、VP和CAMP试验阳性。上述反应都符合单增李斯特氏菌的生化特性，与MALDI-TOF MS鉴定结果相一致。
实施例2
37株单增李斯特氏菌MALDI-TOF-MS聚类分型分析
在实施例1的基础上，通过模式匹配计算所得单增李斯特氏菌MALDI-TOF-MS数据库中37株单增李斯特氏菌主要谱图的相似性，采用相似分值构建系统树，对37株菌进行聚类分型分析，所得聚类分型树状图如附图2所示。差异水平代表彼此间的亲缘关系，其值在0到1.6之间。差异为0表示二个MALDI-TOF-MS质谱图完全相同，可归属为同一类；差异为1.6时表示两株菌之间的亲缘关系最远。所选择的差异水平不同，则单增李斯特氏菌被分型的数目不一。在差异水平为0.7～0.8之间时，MALDI-TOF-MS分型结果将37株菌分成4大型；在差异水平为0.5时，将37株菌分成7个型；在差异水平为0.3～0.4之间时，将37株菌分成9个型。
由图2的聚类分型结果来看，编号为DD-L21、DD-L25、DD-L26、DD-L36、DD-L37、DD-L44的单增李斯特氏菌与编号为DD-L51、DD-L58的单增李斯特氏菌属于同一型，亲缘关系非常近，表明这些菌株可能为同一个污染源。
编号为DD-L20、DD-L31、DD-L52、DD-L54、DD-L55的单增李斯特氏菌与编号为DD-L29、DD-L32、DD-L33、DD-L35的单增李斯特氏菌属于同一型，亲缘关系非常近，表明这些菌株可能为同一个污染源。
编号为GD-L12、GD-L15、GD-L16、GD-L17、GD-L18、GD-L19、GD-L27、GD-L28的单增李斯特氏菌，属于同一型，亲缘关系比较近，表明这些菌株可能为同一个污染源。
Claims (7)
1.MALDI-TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法，包括如下步骤：
①选取35～40株单增李斯特氏菌新鲜培养物，进行MALDI-TOF-MS检测前的样品预处理；
②采集所有菌株样品的MALDI-TOF-MS图谱；
③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为单增李斯特氏菌标准图谱；
④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；
⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱；
⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱与步骤③所得的单增李斯特氏菌标准图谱对比，根据匹配分数判定检测结果。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤①的预处理方法是：取单增李斯特氏菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300μL纯净水，挑取5～10mg微生物培养物，混匀，再加入900μL无水乙醇，混匀后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50μL70％甲酸，混匀，再加入50μL乙腈，混匀，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干1h后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μL，晾干5min后用于后续检测。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪进行图谱采集，仪器参数设定为：线性操作模式，正离子模式；检测质量范围：3000～13000Da；激光点击数：每个图谱50；激光频率：30.0Hz；离子源加速电压：20kv；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800～17378Da。
4.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤⑥根据匹配分数判定检测结果的标准为：
当2.300≤匹配分数≤3.000，表示菌种鉴定的可信度很高；
当2.000≤匹配分数＜2.300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；
当1.700≤匹配分数＜2.000之间，表示可能的菌属鉴定；
在0.000≤匹配分数＜1.700之间，表示不可信的鉴定。
5.权利要求1所述的方法，包括如下步骤：
①选取37株单增李斯特氏菌，取新鲜培养物进行MALDI-TOF-MS检测前的样品预处理：取单增李斯特氏菌新鲜培养物，在Eppendorf管中加入300μL纯净水，挑取5～10mg微生物培养物，混匀，再加入900μL无水乙醇，混匀后以13000r/min离心2min，弃去上清液，加入50μL70％甲酸，混匀，再加入50μL乙腈，混匀，同样以13000r/min离心2min，吸取上清液，涂布于96孔样品板上，自然晾干1h后，用基质溶液(CHCA)覆盖菌苔，用标准肽溶液覆盖校准孔，每孔1μL，晾干5min后用于后续检测；
②使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪采集所有样品的MALDI-TOF-MS图谱，器参数设定为：线性操作模式，正离子模式；检测质量范围：3000～13000Da；激光点击数：每个图谱50；激光频率：30.0Hz；离子源加速电压：20kv；采用氮激电源，质荷比(m/z)数据采集范围为800～17378Da；
③使用BioTyper软件对所得的图谱进行分析统一化，处理所得图谱作为单增李斯特氏菌标准图谱；
④使用同步骤①的方法制备待检测微生物的样品；
⑤按照步骤②的方法采集待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱；
⑥将步骤⑤所得的待检测样品的MALDI-TOF-MS图谱与步骤③所得的单增李斯特氏菌标准图谱对比，根据匹配分数按照下述原则判定检测结果：
当2.300≤匹配分数≤3.000，表示菌种鉴定的可信度很高；
当2.000≤匹配分数＜2.300，表示保守的菌属鉴定或可能的菌种鉴定；
当1.700≤匹配分数＜2.000之间，表示可能的菌属鉴定；
在0.000≤匹配分数＜1.700之间，表示不可信的鉴定。
6.建立MALDI-TOF MS单增李斯特氏菌标准图谱的方法，包括权利要求1的步骤①～③。
7.权利要求6的方法建立的单增李斯特氏菌标准图谱。
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