CN102676506A - 单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品、其建立方法及应用，其通过菌株培养、鉴定、核酸标准样品的制备、核酸标准样品的干燥、均匀性和稳定性检查、定性检定、核酸标准样品定值等项工作,获得一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品。本发明解决了国内食品中致病菌核酸标准样品紧缺的状况，对解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义，并对开展食品中致病菌分子生物学检测工作，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。

Description

单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品制备、其建立方法及其在检测单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。

背景技术

食品安全是重大公共卫生问题，是制约我国经济发展的重要因素。而微生物污染造成的食源性疾病，是我国食品安全中最突出的问题。近年来，随着食品产业结构的调整、经济全球化与国际贸易的迅速发展，我国食源性疾病的防控面临一系列新问题和挑战。

食品中微生物引起食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注，食品中微生物的检测技术是预防与控制的关健的技术环节。目前我国食品中微生物的检测仍以传统的病原菌培养、血清抗体检测、和生化特征比较水平为主，不能满足日益发展的检验检疫工作的需要。常规分离培养耗时长，灵敏度低，某些微生物的培养极为困难。随着2007年《食品中致病菌检测方法——实时PCR法》（SN/T1870-2007）和《食品中多种致病菌快速检测方法——PCR法》（SN/T1869-2007）两项检验检疫行业标准的发布实施，以及即将发布实施的《食品中致病菌检测方法——DHPLC法》等系列分子生物学检测国家标准和行业标准。简单快速，灵敏度高的PCR、实时荧光PCR技术，正在食品致病菌检测领域开始发挥重要作用。

由于食品中细菌的特殊性，人们很难获得细菌分子生物学检测阳性样品，加之食品中致病菌分子生物学检测技术的研究刚刚起步，而配套的标准样品的研究工作则起步较晚，制备技术复杂，样品定值和不确定度的评估存在很多困难，因而国内外食品致病菌核酸标准样品（定量、定性测试）基本上是一片空白。目前国内外没有适用于食品中致病菌分子生物学检测用核酸标准样品，仅有成套分子生物学检测试剂盒中配备的阳性对照品，价格非常昂贵，也不具备核酸标准样品的效能，不能适时地满足检验检疫工作的需要。研究制备新型的食品致病菌核酸标准样品，对于保证灵敏、特异、快速检测食品中致病菌，具有十分重要的意义。

为了解决食品中致病菌核酸标准样品目前国内外均处于空白状况，本项目主要针对食品中致病菌核酸定性和定量检测项目，研究制备食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）核酸标准样品。通过对致病菌核酸标准样品的关键制备技术和保存技术的研究，并进行定值技术和定值方式的研究，开展均匀性和稳定性研究，并对食品中致病菌核酸标准样品的不确定度进行深入细致的研究，最终研制出具有较好的均匀性和稳定性的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品。开发处于世界领先水平，具有我国自主知识产权的食品中致病菌核酸标准样品制备技术；满足食品安全检测的需求，满足国内外食品微生物检测实验室的需求。

发明内容

鉴于食品中致病菌单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品紧缺的状况，根据实际工作的需要和国内现状开展了食品中致病菌核酸标准样品的研制。本项标准样品的制备完成，对全面深入的研究解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。加之人们对食品安全方面的关注和重视，以及开展食品中致病菌分子生物学检测工作的日益扩展和重要性，标准样品又是实验室质量控制工作的重要环节，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。

本发明所采用的技术方案是：单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644的菌株培养、鉴定、核酸标准样品的制备、核酸标准样品的干燥、均匀性和稳定性检查、定性检定、核酸标准样品定值等项工作。取制备的核酸标准样品，经采用实时PCR方法和PCR方法定性分析，确认所制备的核酸标准样品为单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）ATCC：7644核酸样品。采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法及紫外分光光度法，随机抽取样品进行测试，数据进行T检验和F检验确认样品均匀性。经Grubbs检验和Cochran检验，所有数据均可作为定值依据；经正态性检验，这些数据符合正态分布。制备的核酸样品经过了四年的稳定性测定，在避光、密封，-20℃以下温度贮存，四年内稳定。

本发明的一方面在于：一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）标准样品，其特征在于：制备方法的具体步骤如下：

（一）基因组核酸的提取

①单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644经菌株活化、增菌培养；

②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4℃离心15min；

③吸弃上清，取沉淀1~3mL，加pH8.0的TE溶液10mL悬浮，加0.5mL浓度为100g/L SDS和50μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h；

④加2mL浓度为5mol/L NaCl，混匀，加1.5mL CTAB-NaCl混合溶液，混匀，65℃温浴20min；其中，CTAB-NaCl混合溶液为100g/L CTAB和0.7mol/L NaCl；

⑤取上清，加与上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；

⑥取上清，加与上清等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，氯仿-异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；

⑦取上清，加上清0.6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心10min；

⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLpH8.0的TE溶液溶解，获得单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644基因组核酸溶液；

⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，分装核酸样品并进行冷冻干燥；

其中，上文所述pH8.0的TE缓冲液组成：10mM Tris-HCl，1mM EDTA（乙二胺四乙酸）

配制500ml的pH8.0的TE缓冲液的方法：量取5ml 1M Tris-HCl PH=8.0和1ml 0.5MEDTA PH=8.0的溶液于500ml烧杯中，向烧杯中加入约400ml蒸馏水均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存。

（二）冷冻干燥

①样品预冻：先把步骤I所得的核酸样品溶液在-80℃低温冷冻2h；

②冷冻过程：置干燥室制冷，温度降至-35℃时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40℃时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0.5Torr时，结束冷冻过程；

③样品干燥：干燥室温度设置为15℃，当真空度降至0.1Torr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644基因组核酸标准样品，置于-20℃中避光贮存。

本发明的另一方面在于：公开一种用于非疾病诊断目的的单核细胞增生李斯特氏菌的Real-Time PCR检测试剂盒，其包括单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）检测基因和阳性标准对照品，

I.单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644的检测基因，包括：

II.所述的阳性标准对照品是按照上述（一）~（二）所述的方法制备的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的标准样品。

检测试剂盒的使用方法：是以待测样品的基因组为模板，利用单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644检测基因，经过Real-Time PCR反应，结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，先制作标准曲线，最后可以利用公式计算待测样品中转基因成分的含量，具体制作和检测方法参照下述具体实施例，上文所描述的使用方法，是本领域技术人员常用的方式，以此为例，本领域技术人员可以通过结合现有技术的公知常识进行更多拓展。

本发明中，上述检测试剂盒中，采用了开放式的描述形式，其含义是均未限定检测试剂盒中的其他缓冲液等成分，因其可根据现有技术确定，并通过配置或商业途径购买获得，检测试剂盒的使用方法和检测条件，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。

本发明的创新特征是：

本发明解决了国内食品中致病菌核酸标准样品紧缺的状况，对解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义，并对开展食品中致病菌分子生物学检测工作，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1.单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品制备工艺流程；

图2.PicoGreen染料进行荧光定量的荧光标准曲线。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

DNA提取、PCR反应试剂等基因工程实验中所用试剂均购于宝生物工程（大连）有限公司；

DNA提取试剂盒：购于宝生物工程（大连）有限公司（货号D9093）；

TaqMan Universal Master Mix：购于ABI公司；

引物和探针：宝生物工程（大连）有限公司合成；

实时荧光定量PCR仪：ABI 7500型。

实施例1

菌株来源：制备单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品所用标准菌株购自于美国标准菌种收藏所（American Type Culture Collection），单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）标准菌株号ATCC：7644。图1为单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品制备工艺流程图。

本文中，涉及基因工程操作方面的实验步骤、实验试剂配制等方法，如无特殊说明，均参考文献《分子克隆实验指南》。

细菌基因组核酸的提取方法：

按照GB/T4789.30-2008^[1]进行菌株活化、增菌培养。提取增菌肉汤的DNA，制备核酸标准样品。

（1）取细菌增菌培养液100mL，加到500mL无菌离心管中，4000g，4℃离心15min；

（2）吸弃上清，取沉淀1mL，加TE溶液（pH8.0）10mL，悬浮，加0.5mL 100g/L十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）和50μL蛋白酶K（20mg/mL），混匀，37℃温浴1h；

（3）加2mL NaCl（5mol/L），混匀，加1.5mL CTAB-NaCl混合溶液（100g/L CTAB和0.7mol/L NaCl），混匀，65℃温浴20min；

（4）取上清，加等体积酚-氯仿-异戊醇混合液，（混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1），混匀，6000g离心10min；

（5）取上清，加等体积氯仿-异戊醇混合液（混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1），混匀，6000g离心10min；

（6）取上清，加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，13000g离心10min；

（7）取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL TE溶液（pH8.0）溶解，此即为细菌基因组核酸溶液。

其中，上文所述pH8.0的TE缓冲液组成：10mM Tris-HCl，1mM EDTA（乙二胺四乙酸）

配制500ml的pH8.0的TE缓冲液的方法：量取5ml 1M Tris-HCl PH=8.0和1ml 0.5MEDTA PH=8.0的溶液于500ml烧杯中，向烧杯中加入约400ml蒸馏水均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存。

细菌基因组DNA的质量检查^[2]

(1)直接法——DNA完整性确认：用提取的DNA直接电泳检查，1%琼脂糖凝胶电泳，检查结果表明电泳条带清晰明亮，条带单一，无杂带，无RNA，说明提取的DNA质量很好，核酸具有完整性和高分子量。

(2)紫外分光光度计法：用紫外分光光度计来检测提取DNA的OD₂₃₀、OD₂₆₀、OD₂₈₀光吸收值。

取5μL DNA溶液加ddH₂O梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值。

当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。

测试结果表明：OD₂₃₀/OD₂₆₀值小于0.7，OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.9，结果表明所提取的核酸标准样品DNA质量很好。

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品的分装及干燥

分装：根据所提取的核酸样品初定值浓度，计算每管分装体积，分装样品；每管单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸样品含量约为5μg，将获得的核酸标准样品分装于内置微量管的样品套管中，分装400管。

冷冻干燥程序：

（1）样品预冻：先把核酸样品溶液在-80℃低温冷冻2h。

（2）冷冻过程：关好冰冻干燥机的干燥室门，开始干燥室制冷；干燥室温度降至-35℃时，开始冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40℃时，将预冻的标准样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空，真空表显示值开始下降；待真空度降至0.5Torr时，结束冷冻过程。

（3）样品干燥：对干燥室加热，提高样品干燥速度；干燥室的温度设置为15℃。当真空度降至0.1Torr或更低时，表示样品已干燥好。

（4）关闭真空泵，使干燥室与外界大气相通，待内外气压平衡后，打开干燥室门，取出样品，迅速旋紧瓶盖。

核酸样品按以上冷冻干燥程序制成冻干粉，即单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）核酸标准样品；分装后的样品加贴唯一性标识，放置于-20℃中避光贮存。

实施例2

一定性检定

1PCR分析

a.仪器：PE2400，美国PE公司

b.测定：取制备的核酸标准样品，经PCR分析测定：

反应条件：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min；

扩增产物长度为210bp，扩增出单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）特异性基因片段，测序后结果证实为单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。

2实时荧光PCR分析

a.仪器：ABI 7500型实时荧光定量PCR分析仪

b.测定：取制备的核酸标准样品，应用单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）特异性引物和探针，经实时荧光定量PCR分析测定：

其中：FAM为6-carboxyfluorescein,TAMRA为6-carboxytetramethylrhodamine；

PCR所用试剂购于宝生物，使用宝生物Premix Ex Taq试剂盒，货号DRR039S。

FAM（羧基荧光素）吸收波长492nm，发射波长518nm。

反应条件：37℃，5min；95℃预变性3min；95℃变性5s;60℃退火延伸40s，同时收集FAM荧光，进行40个循环。4℃保存反应产物。

经ABI 7500型实时荧光定量PCR分析仪检测，结果证实为单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）：阴性对照检测结果显示，FAM通道无荧光信号检出，说明反应结果正常，反应体系无污染；阳性对照检测结果显示，FAM通道有荧光信号检出，反应结果正常

根据以上PCR和实时荧光PCR分析的结果，可得出如下结论：

定性分析结果表明：所制备获得的DNA核酸标准样品为单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品。

二定值方法

采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法^[3～5]测定单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）核酸标准样品，进行标准样品定值。

1.试剂、耗材、主要仪器

Quant-iT^TM PicoGreen dsDNA Reagent and Kits：invitrogen公司，包括：Quant-iT^TMPicoGreen dsDNA Reagent、20×TE、λDNA标准样品；

黑色平底96孔板：Greiner公司。

多功能酶标仪：TECAN GENios PLUS

2.DNA标准曲线绘制

(a)DNA标准样品稀释、检测

①100ug/mL的λDNA标准样品，用TE稀释成2ug/mL DNA贮存液。

②2ug/mL的λDNA标准样品贮存液按表1进行稀释。

③每个反应孔按表1所示，再加入1mL Quant-iTTM PicoGreen试剂，混匀，在室温避光孵育2-5min。

④多功能酶标仪检测。

表1DNA标准曲线配制

(b)待测样品检测

①用50μL的TE溶解待测样品；取溶解后的待测样品溶液5μL，用TE稀释至1mL加入反应孔中。②每个反应孔再加入1mL Quant-iT^TM PicoGreen试剂，混匀，在室温避光孵育2-5min。③多功能酶标仪检测。

多功能酶标仪检测反应参数：激发光485纳米，发射光535纳米。

结果计算：反应结束后，确认标准样品和待测样品扣除空白对照后的荧光值。以标准样品的荧光值为X坐标轴，标准样品的DNA浓度为横坐标，制作标准曲线。根据待测样品中核酸DNA的荧光吸收值，从DNA标准曲线上，得出待测样品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品DNA的浓度。

见附图2，PicoGreen染料进行荧光定量的荧光标准曲线，用PicoGreen染料进行荧光定量根据Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagent and Kits说明进行。用λDNA梯度稀释样品加入同一板中作标准曲线。横坐标为梯度稀释的λDNA浓度（ng/μL），纵坐标为485nm激发光和535nm发射光的荧光强度。标准曲线显示了PicoGreen方法的线性范围。在DNA浓度为0~1000ng/mL的浓度范围内，存在DNA浓度与荧光信号的线性关系。Series1为485nm激发光波长，Linear为535nm发射光波长。

三均匀性检验

从最终包装5μg/管的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品中，取随机抽取15管样品，每管样品分成2份子样用PicoGreen DNA分子荧光定量方法测试，分析单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品DNA的含量。所有试料以随机次序在重复性条件下测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同的测试方法和仪器在较短时间内测试。检测结果使用方差分析方法进行均匀性评价。

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品的均匀性测定结果见表2，其均匀性评价结果见表3。从表3可知，两个样品组之间不存在显著差异，可以认为样品是均匀的。从表3可见，经F检验，计算F比为1.29，小于查表所得到的F（14,15）=2.42，说明样品是均匀的。样品（不）均匀性标准不确定度为0.016%。

表2单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品均匀性测定结果

样品号	子样1测试结果(μg)	子样2测试结果(μg)
			1	4.98	5.03
2	5.05	5.00
			3	4.96	5.02
4	5.01	5.06
			5	4.94	4.99
6	5.06	5.00
			7	5.02	4.95
8	4.92	4.99
			9	5.06	4.99
10	5.09	5.03
			11	5.07	5.00
12	4.97	5.02
			13	5.00	4.94
14	5.04	5.07
			15	5.01	5.08

表3单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品均匀性评价结果

四稳定性预实验

从2005年12月-2009年12月进行标准样品稳定性预实验研究，所选取的用于稳定性预实验的包装好的样品在-18~-20℃低温条件下历经了四年时间保存。随机选取样品进行稳定性试验，第一年每两个月、第二年每三个月进行含量测试，采用PicoGreen DNA分子荧光定量法定值。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。测试结果见表4。

表4单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品的稳定性预实验结果

由于没有一种物理/化学模型能够真实地描述该候选标准样品的降解机理，故采用直线作为经验模型。事实上，对于这种基体中的特性值而言，人们希望截距（在不确定度内）等于测定得到的值，而斜率趋近于零。

斜率可用下式计算： $b_1=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}(X_i-\stackrel{\‾}{X})(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}=0.00026$

式中：

$\stackrel{\‾}{Y}=5.007$ $\stackrel{\‾}{X}=22.1$

截距由下式计算： $b_0=\stackrel{\‾}{Y}-b_1\stackrel{\‾}{X}=5.0008$

直线上的点的标准偏差可由下式计算： $s^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(Y_i-b_0-b_1{X}_i)}^2}{n-2}=0.00199$

取其平方根s=0.04464%，与斜率相关的不确定度用下式计算：

$s\left(b_1\right)=\frac{s}{\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}}=0.00068$

自由度为n-2和p=0.95（95%置信水平）的学生分布t-因子等于2.11。

由于|b₁|＜t_0.95，n-2·s(b₁)

故斜率是不显著的。因而稳定性预实验中未观测到不稳定性。

五稳定性检验

所选取的用于稳定性测试的包装好的样品在-18~-20℃低温条件下历经了长时间保存。随机选取样品进行稳定性试验。第一年每两个月、第二年每三个月进行含量测试，采用PicoGreenDNA分子荧光定量法定值。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。测试结果见表5，稳定性方差分析表见表6，不稳定标准差为0.0185。

表5单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品的稳定性检验结果

表6稳定性方差分析表

六标准值及其不确定度

采用PicoGreen DNA分子荧光定量法进行了合作定值。分别对单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品进行了6次的重复测试，测试数据汇总表见表7。计算单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品的标准值及置信区间，结果见表8。

表7单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品定值结果汇总表

表8单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品定值结果统计分析表

正态性检验中，偏态系数A小于95%临界值，峰态系数B落于95%置信区间内。正态性检验结果表明，定值数据符合正态分布。

异常值检验结果表明，定值数据中不存在异常值。

从均匀性检验、稳定性检验、定值分析汇总可以看出，均匀性检验的不确定度较大，这是由于PicoGreen DNA分子荧光定量检测方法目前尚无国家标准方法及国际标准方法，目前采用的PicoGreen DNA分子荧光定量检测方法是行业认可的方法，可能尚存在不成熟因素。考虑到本研制的核酸标准样品仅作为定性或半定量使用，因此将均匀性检验、稳定性检验的不确定度引入定值合成不确定度中，选用k=2，可满足使用。

将均匀性和稳定性所导致的不确定度与测定不确定度合成，得到结果的合成标准不确定度，取包含因子为2，得到结果的扩展不确定度，单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）核酸标准样品的定值结果为：（5.01±0.05）μg。

实施例3

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品的制备，可广泛应用于多种食品的检测试剂盒内，作为阳性标准对照品，其具体制备方法如上述实施例1。

本发明中所述的单核细胞增生李斯特氏菌的Real-Time PCR检测试剂盒，其包括单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）检测基因和阳性标准对照品，

其中I.单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644的检测基因，包括：

II.所述的阳性标准对照品是按照实施例1-2所述的方法制备的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的标准样品。

利用单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）核酸标准样品作为试剂盒中的阳性对照，其使用方法如下：

提取待测样品的核酸基因组，以待测样品的基因组为模板，利用单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）检测基因，经过PCR或Real-Time PCR等反应，将获得的直接电泳结果或者荧光强度等信息，判断待测样品中是否含有单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）。或者Real-Time PCR反应结束后先制作标准曲线，再利用公式计算待测样品中转基因成分的含量。具体制作和检测方法参照实施例1和2。

本项发明核酸标准样品的制备，对全面深入的研究解决转基因成分、检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，对我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

本发明中，涉及基因工程操作方面的实验步骤、实验试剂配制等方法，如无特殊说明，均为常规技术。PCR、Real-Time PCR反应所用缓冲液等反应试剂、反应体系和反应参数设置，均如上述实施例。

参考文献

1.GB/T4789.30-2008食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验。

2.Singer VL,Jones LJ,Yue ST,Haugland RP.Characterization of PicoGreen reagent anddevelopment of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.AnalBiochem.1997 Jul 1;249(2):228-38.

3.Blotta I,Prestinaci F,Mirante S,Cantafora A.Quantitative assay of total dsDNA with PicoGreenreagent and real-time fluorescent detection.Ann Ist Super Sanita.2005;41(1):119-23.

4.Tolun G，Myers RS.A real-time DNase assay(ReDA)based on PicoGreen fluorescence.NucleicAcids Res.2003 Sep 15;31(18):e111.

5.R.E.布坎南，N.E吉本期.《伯杰氏细菌鉴定手册》[M]第八版.北京:科学出版社，1984。

Claims (2)

1.一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）标准样品，其特征在于：制备方法的具体步骤如下：

Ⅰ.基因组核酸的提取

①单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644，经菌株活化、增菌培养；

②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4℃离心15min；

③吸弃上清，取沉淀1~3mL，加pH8.0的TE溶液10mL悬浮，加0.5mL浓度为100g/L SDS和50μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃温浴1h；

④加2mL浓度为5mol/LNaCl，混匀，加1.5mLCTAB-NaCl混合溶液，混匀，65℃温浴20min；其中，CTAB-NaCl混合溶液为100g/L CTAB和0.7mol/L NaCl；

⑤取上清，加与上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；

⑥取上清，加与上清等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心10min；其中，氯仿-异戊醇混合液中氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；

⑦取上清，加上清0.6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心10min；

⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mL pH8.0的TE溶液溶解，获得单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644基因组核酸溶液；

⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.7～1.9之间时，分装核酸样品并进行冷冻干燥；

Ⅱ.冷冻干燥

①样品预冻：先把步骤Ⅰ所得的核酸样品在-80℃低温冷冻2h；

②冷冻过程：置干燥室制冷，温度降至-35℃时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40℃时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0.5Torr时，结束冷冻过程；

③样品干燥：干燥室温度设置为15℃，当真空度降至0.1Torr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC：7644基因组核酸标准样品，置于-20℃中避光贮存。

2.一种用于非疾病诊断目的的单核细胞增生李斯特氏菌的Real-Time PCR检测试剂盒，其特征在于，包括单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）检测基因和阳性标准对照品，

Ⅰ.单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的检测基因，包括：

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的prfA基因PCR引物：

正向引物    SEQ ID NO：1

反向引物    SEQ ID NO：2

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）特异性实时PCR引物和探针：

正向引物    SEQ ID NO：3

反向引物    SEQ ID NO：4

探针        SEQ ID NO：5

Ⅱ.所述的阳性标准对照品是权利要求1所述的单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）ATCC：7644的标准样品。

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