CN102690835A - 转基因大豆分子标准样品、其建立方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种转基因大豆GTS 40-3-2的标准样品制备、其建立方法及其在检测转基因大豆中的应用，以转基因大豆GTS 40-3-2为原料，确定其品系特异性目标基因，即转基因大豆GTS 40-3-2品系特异性基因和大豆内源Lectin基因，将两个目标DNA片段构建在载体pMD19-T上，并将阳性质粒用Hind-III酶进行线性化处理，最后按310pg/mL定量分装；通过上述方法获得转基因大豆GTS 40-3-2的标准样品，也可以应用于转基因大豆Real-Time PCR检测试剂盒。这对深入研究转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，开展转基因产品检测标准样品的研制具有现实意义。

Description

转基因大豆分子标准样品、其建立方法及应用

技术领域

本发明属于转基因食品检测技术领域，具体涉及转基因大豆GTS 40-3-2的标准样品制备、其建立方法及其在检测转基因大豆GTS 40-3-2中的应用。

背景技术

转基因大豆40-3-2(Roundup ready)是Monsanto的产品。在7个转基因大豆品系中GTS40-3-2(Roundup Ready)是目前最多用于食品和饲料的。该品系所改变的性状为耐除草剂（草甘膦）。在不同国家被批准食用的时间分别为：美国1994年；加拿大、阿根廷、日本、荷兰、瑞士1996年；乌拉圭1997年；巴西、墨西哥1998年；俄罗斯1999年；韩国、罗马尼亚2000年；南非2001年。可供人类食用或动物饲用。

近年来，转基因作物培育技术取得突破进展，陆续推出了一批新品种，在改善农作物品质、提高产量等方面发挥了巨大作用。然而，人们对转基因食品的安全性问题存在着很多的争论。转基因作物的生态风险、可能带来的环境问题、作为食品对人体健康影响的问题、产品加贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界广泛性的关注。转基因产品的安全性问题已由学术观点分歧，发展到知识产权、环境问题、经济问题甚至政治问题。欧盟和一些国家相继出台了转基因产品管理法规，我国于2002年3月开始实施《农业转基因生物安全管理条例》及其三个配套管理办法。2001年，欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出对非转基因食品只要不是有意污染，允许含有1%的转基因产品（阈值），而不用标识。日本、韩国、澳大利亚等不同国家的限量阈值不同，从1%~5%不等。

转基因食品的检测是这些旨在保护生物和生态安全、维护消费者权益、促进贸易和经济健康发展的法规和政策的基本依据，其标准化将为制订、实施和改进这些法规和政策提供有力保证。国内外转基因食品的检测研究刚刚起步，许多问题都有待解决，标准样品则是该领域尚未解决的重要问题。开展转基因成分检验标准样品的研制在保证测试结果的可比性和溯源性、保障食品安全、解决贸易争端，促进经济发展等方面均具有重要的意义。更为严峻的问题是目前国外仅有转基因大豆粉、转基因玉米粉MON810等少数几个品种的标准物质，价格非常昂贵，手续繁多，周转时间长，不能适时地满足检验检疫工作的需要；日本正在加紧研制转基因产品检测的分子参考标准物质，用于转基因产品的定量检测；2005年，国内研制成功了转基因大豆粉国家二级标准物质，填补了我国在转基因成分检测标准样品方面的空白，但转基因油菜籽、转基因玉米、转基因棉花籽等标准样品以及分子标准样品仍是空白。

发明内容

鉴于国内转基因标准样品紧缺的状况，我们研制了转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品，以及转基因大豆GTS 40-3-2的Real-Time PCR检测试剂盒，包括转基因大豆GTS 40-3-2检测基因和阳性标准对照品，本项标准样品的制备及检测试剂盒的制备完成，对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，对我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

采用PicoGreen DNA荧光定量法进行了合作定值。分别对转基因大豆GTS 40-3-2品系DNA标准样品进行了6次的重复测试。经Grubbs检验和Cochran检验，所有数据均可作为定值依据；经正态性检验，这些数据符合正态分布。

转基因大豆GTS 40-3-2品系简介

转基因大豆GTS 40-3-2所含的外源基因有：耐除草剂基因CP4EPSPS，由CaMV35S启动子和NOS终止子调控。

质粒图谱为：

本发明通过以下技术路线实现：

本发明的一方面在于：转基因大豆GTS 40-3-2标准样品，其按照如下方法制备：

①以转基因大豆GTS 40-3-2的基因组为模板，分别以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5为引物，PCR扩增，得到两个目的片段；

PCR扩增条件：94℃预变性3.0min；94℃变性0.4min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃ 5min；

②将步骤①扩增的两个目的片段通过人工合成连接在一起之后，再连入质粒载体pMD19-T中；并转化至JM109感受态细胞中，获得重组菌株；

③将步骤②获得的重组菌株提取质粒，进行测序鉴定，鉴定结果以碱基序列中包含序列SEQ ID NO：7的质粒所对应的重组菌株为阳性菌株；

④大量提取步骤③所述阳性菌株的质粒，用Hind-III限制性内切酶进行线性化后分装，获得转基因大豆GTS 40-3-2标准样品。

本发明中所述的人工合成的方法是指送到能够合成基因片段的公司，委托合成目的片段。本发明中所述的测序也是委托专业的测序公司完成的，另外，本发明中所述的质粒转化感受态细胞的方法，提取重组菌株的质粒的方法，以及用Hind-III限制性内切酶进行线性化的方法均为常规技术，属于本领域技术人员的共知常识。

本发明的另一方面在于：一种转基因大豆GTS 40-3-2的Real-Time PCR检测试剂盒，包括转基因大豆GTS 40-3-2检测基因和阳性标准对照品：

Ⅰ.转基因大豆GTS 40-3-2检测基因，包括：

GTS 40-3-2品系特异性的引物和探针序列：

正向引物：5’-TAG CAT CTA CAT ATA GCT TC-3’（即SEQ ID NO：1）

反向引物：5’-GAC CAG GCC ATT CGC CTC A-3’（即SEQ ID NO：2）

探针：5’-FAM-ACA AAA CTA TTT GGG ATC GGA GAA GA-TAMRA-3’（即SEQ IDNO：3）

大豆内源Lectin基因的引物和探针序列：

正向引物：5’-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3’（即SEQ ID NO：4）

反向引物：5’-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3’（即SEQ ID NO：5）

探针：5’-FAM-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC-TAMRA-3’（即SEQ ID NO：6）

其中：FAM为6-carboxyfluorescein,TAMRA为6-carboxytetramethylrhodamine；

Ⅱ.所述的阳性标准对照品是上文所述的转基因大豆GTS 40-3-2标准样品。

本发明中，上述检测试剂盒中，采用了开放式的描述形式，其含义是均未限定检测试剂盒中的其他缓冲液等成分，因其可根据现有技术确定，并通过配置或商业途径购买获得，检测试剂盒的使用方法和检测条件，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本发明不再赘述。

试剂盒的使用方法：是以待测样品的基因组为模板，利用转基因大豆GTS 40-3-2检测基因，经过Real-Time PCR反应，结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，先制作标准曲线，最后可以利用公式计算待测样品中转基因成分的含量。或者通过PCR特异性的引物和探针序列，扩增待测样品与阳性标准对照品，并将扩增的结果进行比对，确认样品中是否含有转基因大豆GTS 40-3-2品种，具体制作和检测方法参照实施例。上文所描述的使用方法，是本领域技术人员常用的方式，以此为例，本领域技术人员可以通过结合现有技术的公知常识进行更多拓展。

本发明的创新特征是：

我们研制了转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品，以及转基因大豆GTS 40-3-2的Real-Time PCR检测试剂盒，包括转基因大豆GTS 40-3-2检测基因和阳性标准对照品，本项标准样品的制备及检测试剂盒的制备完成，对全面深入的研究解决转基因成分检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，对我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义及应用价值。

附图说明

图1：转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品制备工艺流程图；

图2：目标DNA电泳结果，其中1.Hind-III线性化后的质粒DNA；2.未线性化的质粒DNA；M.λHind-III DNA Marker。

图3：实时荧光定量PCR分析测定图，定性分析结果表明：所制备获得的DNA为转基因大豆GTS 40-3-2品系的DNA。

图4：DNA标准曲线：横坐标为梯度稀释的λDNA浓度（ng/μL），纵坐标为485nm激发光和535nm发射光的荧光强度。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

转基因大豆GTS 40-3-2品系种子来自于美国Monsanto公司。

DNA提取试剂和PCR反应试剂均购于宝生物工程（大连）有限公司；

DNA提取试剂盒：购于宝生物工程（大连）有限公司（货号D9093）；

TaqMan Universal Master Mix：购于ABI公司；

引物和探针：宝生物工程（大连）有限公司合成；

实时荧光定量PCR仪：ABI 7500型；

核酸蛋白分析仪：日本日立公司。

实施例1转基因大豆标准样品的制备步骤

1.选择目标DNA片段

按照国家标准《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》GB/T 19495.5—2004中，转基因大豆GTS 40-3-2品系定量检测的品系特异性目标基因，确定目标DNA片段是转基因大豆GTS 40-3-2品系特异性基因（大豆基因组DNA与GTS 40-3-2品系特异基因之间的边界序列）和大豆内源Lectin基因。该两个目标DNA片段构建在同一个载体质粒上。

2.转基因大豆GTS 40-3-2品系目标DNA片段克隆质粒的构建

a.基因组DNA的提取

采用TaKaRa公司的DNA提取试剂盒（货号D9093），并按其操作说明提取转基因大豆GTS 40-3-2品系基因组DNA。

b.基因组DNA的质量检查

①直接法：用提取的DNA直接电泳检查，检查结果表明电泳条带清晰明亮，条带单一，无杂带，说明提取的DNA质量很好。

②紫外分光光度计法：用紫外分光光度计来检测提取DNA的OD₂₃₀、OD₂₆₀、OD₂₈₀光吸收值，结果：OD₂₃₀/OD₂₆₀值小于0.7，OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.8与2.0之间，结果表明样品DNA质量很好。

c.目标基因的扩增

①PCR扩增反应体系：10×PCR Buffer 2μL，dNTPs(各2.5mmol/L)2μL，Ex Taq（5U/μL）0.2μL，引物（10pmol/μL）各1μL，步骤a获得的转基因大豆GTS 40-3-2品系基因组DNA作为模板DNA（0.3~6μg/μL）2μL，用无菌水补充至25μL。

②PCR扩增反应条件：94℃预变性3.0min；94℃变性0.4min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃ 5min；4℃保存。

其相应的检测引物和探针信息见表1。

表1 Taqman探针实时PCR检测GTS 40-3-2品系目标DNA片段的引物和探针序列信息

注：FAM:6-carboxyfluorescein,TAMRA:6-carboxytetramethylrhodamine。

d.目标基因的回收

采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒（货号DV805A），并按其操作说明回收目标DNA片段。

e.选取载体、连接

两个片段采用人工合成的方式连接在一起。即人工合成了一整条包含2个片段的DNA序列作为目标基因片段，再选取宝生物工程（大连）有限公司生产的pMD19-T Vector载体。

将pMD19-T Vector载体与插入目标基因片段大小按如下比例连接：

连接体系如下：

连接条件为：4℃，过夜。

f.制备感受态细胞

挑一个JM109感受态细胞的单菌落到10mL不含有抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振摇培养3h，使其浓度达到OD₆₀₀=0.4左右。将培养好的感受态细胞分装在1.5mL经高压灭菌的EP管中，冰浴10min。之后4℃，4100rpm离心10min，弃净培养基。用750mL预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重悬细胞。4℃，4100rpm离心10min，弃净CaCl₂溶液。200μL CaCl₂（预冷）重悬细胞，4℃存放一周内使用，或加入10％灭菌甘油－70℃存放待用。

热转化：

①将步骤e获得的连接产物，全量（20μL）加入至100μL JM109感受态细胞中，放置冰中30min。

②42℃加热45s后，再在冰中放置2-5min。

③加入900μL SOC培养基，转入15mL Tube，37℃振荡培养60min。

④以100μL和200μL两个梯度涂平板，37℃过夜培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。

g.阳性克隆的筛选

用灭菌牙签挑取白色菌落；依次应用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0（货号DV801A）回收质粒DNA。

将回收的质粒DNA进行PCR筛选（方法如步骤c），根据PCR电泳结果，结合测序结果，挑选测序结果中包含片段SEQIDNO：7的相应菌株，进行菌落植菌，在含有氨苄霉素的TB培养基中扩增培养，37℃过夜。

h.质粒回收、测序、线性化处理

将步骤g获得的扩增培养的阳性菌，应用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification KitVer.2.0（货号DV801A）回收质粒DNA。

挑选阳性克隆质粒DNA进行DNA双向测序，确保构建的质粒DNA与预期DNA序列一致。DNA双向测序结果，经过软件比对，证实与预期序列一致后，进行下述实验。

将经过阳性鉴定的质粒进行大量培养及质粒抽提：

质粒抽提步骤，所用试剂：

试剂溶液Ⅰ(50mM葡萄糖,25mMTris.HclPH8.0,10mMEDTA)

溶液II(0.2NNaOH,1%SDS)用前新配制

溶液III(5mMKAc溶液,PH4.8)

TE缓冲液(10mMTris.Hcl,1mMEDTA,PH8.0)

LB液体培养基(胰蛋白胨10g,酵母粉5g,Nacl10g,加蒸馏水溶解,用NaOH调PH至7.5,加水至1000ml,15磅高压灭菌15分钟.)

质粒抽提的步骤：

1、接种细菌于5mlLB液体培养基中,37℃培养过夜.

2、3000rpm/min,离心15min,弃上清.加入100ul溶液Ⅰ悬起细菌沉淀.

3、加入200ul前新配制的溶液II,颠倒EP管5次混合均匀,置冰浴2min.

4、加入150ul溶液III温和地混匀,12000rpm/min,离心5min.

5、吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中,加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次,12000rpm/min,离心2min。吸取上清放入另一新EP管中,加入二倍体积的冷乙醇,12000rpm/min,离心10min.

6、弃乙醇,干燥后用30ulTE缓冲液溶解核酸，备用。

7、将步骤6获得的核酸（目标DNA）用Hind-III限制性内切酶37℃，2~5h进行线性化处理。

反应体系为：

目标DNA：5μL，

1×酶切缓冲液，2μL；

Hind-III限制性内切酶，0.33μL；

蒸馏水，13μL；

线性化处理后，取1μL进行电泳确认。结果见图2，目标DNA电泳结果，其中1.Hind-III线性化后的质粒DNA；2.未线性化的质粒DNA；M.λHind-III DNA Marker。

i.目标DNA样品的分装

大量重复步骤h，获得大量的线性化处理的质粒DNA。

将获得的转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品分装于棕色Eppedorf管中，每管310pg/mL。分装后的样品加贴唯一性标识，放置于-18℃~20℃低温中避光贮存。

实施例2产品定性定量检定

一.实时荧光PCR分析

a.仪器：ABI 7500型实时荧光定量PCR分析仪

b.测定：

取制备的分子标准样品，经实时荧光定量PCR分析测定，结果为含有转基因大豆GTS40-3-2品系特异性基因（大豆基因组DNA与GTS 40-3-2品系特异基因之间的边界序列）和大豆内源Lectin基因。与转基因大豆GTS 40-3-2品系的质粒图谱外源基因基本一致。根据以上实时荧光PCR分析的结果，可得出如下结论：

定性分析结果表明：所制备获得的DNA为转基因大豆GTS 40-3-2品系的DNA。

二.定值方法

采用PicoGreen DNA荧光定量方法测定转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品，进行标准样品定值。

试剂与耗材

(a)Quant-iT^TM PicoGreen dsDNA Reagent and Kits：invitrogen公司

包括：Quant-iT^TM PicoGreen dsDNA Reagent

20×TE

Lambda DNA标准样品

(b)黑色平底96孔板：Greiner公司

主要仪器

多功能酶标仪：TECAN GENios PLUS

PicoGreen DNA荧光定量检测步骤

(a)DNA标准曲线制备

①100ug/mL的λDNA标准样品，用TE稀释成50ng/mL DNA贮存液。

②50ng/mL的λDNA标准样品贮存液按表2进行稀释。

③每个反应孔按表1所示，再加入1mL Quant-iT^TM PicoGreen试剂，混匀，在室温避光孵育2-5min。

④多功能酶标仪检测。

表2DNA标准曲线配制

(b)待测样品检测

①取待测样品1mL，加入反应孔中。

②每个反应孔再加入1mL Quant-iT^TM PicoGreen试剂，混匀，在室温避光孵育2-5min。

③多功能酶标仪检测。

(c)反应参数

多功能酶标仪检测反应参数：激发光485纳米，发射光535纳米。

结果计算

用PicoGreen染料进行荧光定量根据Quant-iTTM PicoGreen dsDNA Reagent and Kits说明进行。用λDNA梯度稀释样品加入同一板中作标准曲线（附图4）。横坐标为梯度稀释的λDNA浓度（ng/μL），纵坐标为485nm激发光和535nm发射光的荧光强度。

反应结束后，确认标准样品和待测样品扣除空白对照后的荧光值。以标准样品的荧光值为纵坐标轴，标准样品的DNA浓度为横坐标，制作标准曲线。根据待测样品中DNA的荧光吸收值，从DNA标准曲线上，得出待测样品中转基因成分DNA的浓度。

实施例3产品均匀性检验

从最终包装0.5mL/管的转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品中，取随机抽取15管样品，每管样品分成2份子样用PicoGreen DNA荧光定量方法测试，分析转基因大豆GTS40-3-2品系DNA的含量。所有试料以随机次序在重复性条件下测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同的测试方法和仪器在较短时间内测试。检测结果使用方差分析方法进行均匀性评价。

转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品的均匀性测定结果见表6，其均匀性评价结果见表7。从表7可知，两个样品组之间不存在显著差异，可以认为样品是均匀的。从表7可见，经F检验，计算F比为1.04，小于查表所得到的F（14,15）=2.42，说明样品是均匀的。样品（不）均匀性标准不确定度为0.22%。

表6转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品均匀性测定结果

表7转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品均匀性评价结果

方差来源	平方和	自由度	均方MS	F比
					组间（瓶间）	32.1	14	2.292857	1.04
组内	33	15	2.2	不确定度
					总和	65.1	29		0.22

实施例4产品稳定性检验

所选取的用于稳定性测试的包装好的样品在-18~-20℃低温条件下历经了长时间保存。随机选取样品进行稳定性试验。第一年每两个月、第二年每三个月进行含量测试，采用PicoGreenDNA荧光定量法定值。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。测试结果见表8。

表8转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品的稳定性检验结果

由于没有一种物理/化学模型能够真实地描述该候选标准样品的降解机理，故采用直线作为经验模型。事实上，对于这种基体中的特性值而言，人们希望截距（在不确定度内）等于测定得到的值，而斜率趋近于零。

斜率可用下式计算： $b_1=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}(X_i-\stackrel{\‾}{X})(Y_i-\stackrel{\‾}{Y})}{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}=-0.01306$

式中： $\stackrel{\‾}{Y}=309.45455$ $\stackrel{\‾}{X}=11.36$

截距由下式计算： $b_0=\stackrel{\‾}{Y}-b_1\stackrel{\‾}{X}=309.45455-(-0.01306\×11.36)=309.6029$

直线上的点的标准偏差可由下式计算： $s^2=\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(Y_i-b_0-b_1{X}_i)}^2}{n-2}=\frac{3.85888}{9}=0.4288$

取其平方根s＝0.6548％，与斜率相关的不确定度用下式计算：

$s\left(b_1\right)=\frac{s}{\sqrt{\underset{i=1}{\overset{n}{\mathrm{\Σ}}}{(X_i-\stackrel{\‾}{X})}^2}}=\frac{0.6548}{\sqrt{695}}=0.0248$

自由度为n-2和p=0.95（95％置信水平）的学生分布t－因子等于1.83。

由于|b₁|＜t_0.95，n-2·s(b₁)

故斜率是不显著的。因而未观测到不稳定性。

实施例5产品标准值及其不确定度

采用PicoGreen DNA荧光定量法进行了合作定值。分别对转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品进行了6次的重复测试，测试数据汇总表见表9。

按照GB/T 15000-94的要求对数据进行统计，计算转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品的标准值及置信区间，结果见表10。

表9转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品定值结果汇总表

表10转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品定值结果统计分析表

由于均匀性和稳定性所导致的不确定度远远小于测定不确定度，可以被忽略。取包含因子为2，转基因大豆GTS 40-3-2品系分子标准样品的定值结果为：（310±4）pg/mL。

产品包装与贮存

（1）产品为0.5mL装，内包装为棕色Eppedorf管，避光，密封，-18℃~-20℃贮存，二年内稳定。

均匀性：经T、F检验，本品均匀。

标准值和不确定度：标准值310pg/mL，不确定度±4%。

（2）分子标准样品拷贝数换算公式：

copies/μL={DNA样品浓度(pg/μL)×6.02×10¹¹}/(碱基数×碱基平均量)

本品换算为拷贝数表示为：

{0.31(pg/μL)×6.02×10¹¹}/(2851×660)=10⁵copies/μL

实施例6

转基因大豆GTS 40-3-2的Real-Time PCR检测试剂盒内，包括转基因大豆GTS 40-3-2检测基因和阳性标准对照品，

其中的转基因大豆GTS 40-3-2检测基因，包括：

GTS 40-3-2品系特异性的引物和探针序列：

正向引物：SEQ ID NO：1

反向引物：SEQ ID NO：2

探针：SEQ ID NO：3

大豆内源Lectin基因的引物和探针序列：

正向引物：SEQ ID NO：4

反向引物：SEQ ID NO：5

探针：SEQ ID NO：6

还包括阳性标准对照品是转基因大豆GTS 40-3-2标准样品，其具体制备方法如上述实施例1。

本发明中，涉及基因工程操作方面的实验步骤、实验试剂配制等方法，如无特殊说明，均为常规技术。PCR、Real-Time PCR反应所用缓冲液等反应试剂、反应体系和反应参数设置，均如上述实施例。

试剂盒的使用方法：是以待测样品的基因组为模板，利用转基因大豆GTS 40-3-2检测基因，经过Real-Time PCR反应，结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，先制作标准曲线，最后可以利用公式计算待测样品中转基因成分的含量。具体制作和检测方法参照实施例。

转基因大豆GTS 40-3-2的Real-Time PCR检测试剂盒的制备完成，对待测样品经过Real-Time PCR反应，结束后确认Real-Time PCR的扩增曲线，制作标准曲线，最后可以利用公式计算待测样品中转基因成分的含量，本项发明包括标准样品的制备及检测试剂盒的制备，对全面深入的研究解决转基因成分、检测标准样品的制备技术和稳定性保证技术，对我国转基因产品检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。

参考文献

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Claims (2)

1.一种转基因大豆GTS 40-3-2标准样品，其特征在于，其按照如下方法制备：

①以转基因大豆GTS 40-3-2的基因组为模板，分别以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5为引物，PCR扩增，得到两个目的片段；

PCR扩增条件：94℃预变性3.0min；94℃变性0.4min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃ 5min；

②将步骤①扩增的两个目的片段通过人工合成连接在一起之后，再连入质粒载体pMD19-T中；并转化至JM109感受态细胞中，获得重组菌株；

③将步骤②获得的重组菌株提取质粒，进行测序鉴定，鉴定结果以碱基序列中包含序列SEQ ID NO：7的质粒所对应的重组菌株为阳性菌株；

④大量提取步骤③所述阳性菌株的质粒，用Hind-III限制性内切酶进行线性化后分装，获得转基因大豆GTS 40-3-2标准样品。

2.一种转基因大豆GTS 40-3-2的Real-Time PCR检测试剂盒，其特征在于，包括转基因大豆GTS 40-3-2检测基因和阳性标准对照品，

Ⅰ.转基因大豆GTS 40-3-2检测基因，包括：

GTS 40-3-2品系特异性的引物和探针序列：

正向引物：SEQ ID NO：1

反向引物：SEQ ID NO：2

探针：SEQ ID NO：3

大豆内源Lectin基因的引物和探针序列：

正向引物：SEQ ID NO：4

反向引物：SEQ ID NO：5

探针：SEQ ID NO：6

Ⅱ.所述的阳性标准对照品是权利要求1所述的转基因大豆GTS 40-3-2标准样品。

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