CN104388578A - 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测nos终止子的方法 - Google Patents

利用交叉引物和双探针恒温扩增检测nos终止子的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104388578A
CN104388578A CN201410775330.8A CN201410775330A CN104388578A CN 104388578 A CN104388578 A CN 104388578A CN 201410775330 A CN201410775330 A CN 201410775330A CN 104388578 A CN104388578 A CN 104388578A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
detection
pipe
test strip
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410775330.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104388578B (zh
Inventor
潘家荣
张晗
冯涛
张雪妍
王冉
罗小涵
梁未
李素芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Jiliang University
Original Assignee
China Jiliang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Jiliang University filed Critical China Jiliang University
Priority to CN201410775330.8A priority Critical patent/CN104388578B/zh
Publication of CN104388578A publication Critical patent/CN104388578A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104388578B publication Critical patent/CN104388578B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了属于转基因产品检测领域的用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组。所述的引物组由SEQ ID No：1～SEQ ID No：5所示的一对外围引物、一个交叉引物和一对检测探针引物组成。本发明还公开了含有该引物组的试剂盒，以及利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法，利用本发明的引物组进行恒温扩增反应后，再用核酸试纸条对检测结果进行判读。本发明引物组特异性强，灵敏度高；其次，检测速度快，检测时间短，检测时间缩短到100min，明显提高了检测效率；此外，本发明方法简单实用，不需要复杂仪器设备，尤其适用在基层现场检测。

Description

利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法
技术领域：
本发明属于转基因产品检测领域。具体涉及用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组，以及含有该引物组的试剂盒，还涉及利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法。
背景技术：
转基因作物(Genetically Modified Organisms，GMO)，是指利用基因工程方法将其他生物的遗传基因转移到作物中而形成的作物。通常转基因技术，可增加作物的产量、改善品质、提高抗旱、抗寒或其它特性。但是，对转基因产品的安全性一直是争议的问题。人们主要有两个忧虑，一是出于健康角度，二是出于生态安全角度。为了保障消费者的知情权和选择权，国内外纷纷出台相应的法律法规要求对转基因食品进行标识。而转基因植物产品快速简便的检测方法的建立是标识转基因产品最直接有效的技术支持。
根癌农杆菌胭脂碱合成酶(Nopaline Synthase，NOS)基因是一种报告基因，在转基因研究过程中可快速报告植株是否被成功转化，NOS基因终止子主要存在于马铃薯、大豆、玉米、甜椒等可能的转基因产品中(刘光明等.食品科学，2005，(5))。已建立的转基因的检测方法有：常规PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR、巢式PCR、LAMP方法等(陈碧华等.食品科学，2008:705-712)，但是这些体外核酸扩增技术大多需要与电泳、荧光、质谱法或直接测序等方法结合来进行检测，这些方法大多操作复杂、价格昂贵，而且都是以大型的仪器设备和熟练的专业技能为前提的检测技术，因此，并不适合于基层单位应用。
交叉引物恒温扩增技术(Crossing Priming Isothermal Amplification，CPA)(专利号为：ZL200810134583.1)是杭州优思达生物技术有限公司结合恒温核酸扩增技术和核酸试纸条快速检测技术而发明的一种操作简单、时间短、成本低的检测技术，可广泛用于病原体检测等领域。该技术还具有特异性强、灵敏度高的特点，特别适合用于现场检测。目前该技术结合胶体金核酸试纸条的检测方法已被用在诸如沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、结核分歧杆菌、恶性疟疾、霍乱弧菌、志贺氏菌、瓜果类斑病菌等病原菌的检测(祁军等.食品研究开发，2013,34(2):67-70；祁军等.中国媒介生物学及控制杂志，2013,24(3):204-207)。
经检索，未发现交叉引物恒温扩增技术在转基因产品检测上应用的报道。
发明内容：
针对目前转基因产品检测领域存在的方法复杂、需要专用设备和专业人员、费时长和成本高等缺点，本发明目的在于提供用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组。
本发明另一目的在于提供利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的试剂盒。
本发明第三目的在于提供利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法。
实现本发明的技术方案如下：
本发明用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组，由一对外围引物、一个交叉扩增引物和一对检测探针引物组成；
其中所述的一对外围引物为：
正向外围引物NOS4s：5’-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’(SEQ IDNo:1)，
反向外围引物NOS5a：5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’(SEQ IDNo:2)；
所述的交叉引物NOS2a1s：
5’-GTTTATGAGATGGGTTTTTTTTGTTTTCTATCGTGTATTA-3’(SEQID No:3)；
所述一对检测探针引物为：
检测探针NOS2a*：5’-GTTTATGAGATGGGTTTTT-3’(SEQ ID No:4)
检测探针NOS3a*：5’-TTAGAGTCCCGCAATTATACA-3’(SEQ IDNo:5)；
其中检测探针NOS2a*的5’端标记修饰生物素；检测探针NOS3a*的5’端标记修饰荧光素FAM。
本发明利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的试剂盒，包括下列6个部分，分别为核酸检测试纸条、SSC缓冲液、恒温扩增反应液、BstDNA聚合酶液、无菌双蒸水和阳性对照。
上述试剂盒中所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检测试纸条，可从杭州优思达生物技术有限公司购买。
上述试剂盒中所述的SSC缓冲液的组成成分及其比例为：0.3mol/L NaCl,0.03mol/L柠檬酸钠·2H2O,用1mol/L HCl调节pH至7.0。
上述试剂盒中所述的恒温扩增反应液(A管)：其组成成分及其比例为：正向外围引物NOS4s 0.24μmol/L，反向外围引物NOS5a 0.24μmol/L，交叉引物NOS2a1s 1.6μmol/L，检测探针引物NOS2a*1.2μmol/L，检测探针引物NOS3a*0.8μmol/L，dNTPs溶液0.4mmol/L，Betiane甜菜碱0.4M，1×Thermolpol buffer。
上述试剂盒中所述的1×Thermol pol buffer的组成成分及其比例为：10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100，pH8.8；
上述试剂盒中所述的Bst DNA聚合酶液(B管)可购买得到。
上述试剂盒中所述的无菌双蒸水(C管),作为阴性对照或补足体系用。
上述试剂盒中所述的阳性对照(D管)为含有NOS基因终止子片段的质粒DNA。
所述的NOS基因终止子片段由SEQ ID No:6所示的核苷酸序列组成。
上述试剂盒中所述的阳性对照的制备方法：以转基因大豆总DNA(或其他带有NOS终止子的转基因作物或质粒)为模板，以外围引物NOS4s和NOS5a为引物进行PCR扩增，得大小为180bp(NOS终止子基因片段)的PCR扩增产物，然后按照常规方法将所得PCR扩增产物克隆、转化；提取质粒DNA，得阳性DNA样品。
本发明利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法，包括以下步骤：
(1)、提取待测样品DNA：利用常规CTAB法(参考基因工程原理和技术，主编邹克琴、叶子弘)或者其他商业上使用的DNA提取试剂盒提取待测样品的总DNA，备用；
(2)、利用上述试剂盒配制反应体系(25μL)：恒温扩增反应液(A管)12.5μL，Bst DNA聚合酶液(B管)1μL，双蒸水(C管)10.5μL，待测样品DNA或阳性对照(D管)1μL；不足部分用双蒸水(C管)补齐；其制备方法为：按照反应体系依次加入双蒸水(C管)、恒温扩增反应液(A管)、Bst DNA聚合酶液(B管)的和待测样品DNA或阳性对照(D管)，移液器吹打混匀(待测样品DNA或阳性对照应在阴性对照和所有样品之后加入)；
(3)、交叉引物恒温扩增程序：将反应管放置恒温水浴锅内，63℃温浴60～90min；
(4)、扩增产物的检测：将扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区，再将核酸试纸条放入SSC缓冲液中，5～10min后通过试纸条的显色进行判读，若结果为阳性，则样本中含有检测的核酸，试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区；若结果是阴性，则只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带。
上述检测方法中所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检测试纸条，可从杭州优思达生物技术有限公司购买。
所述的引物组在鉴定转基因植物产品上的应用
与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点和有益效果：(1)特异性强，本发明只用于检测NOS终止子基因，与其他植物基因无交叉反应；(2)灵敏度高，10个拷贝/μL就可以检测到；(3)检测速度快，与传统的检测方法相比，本发明将检测时间缩短到100min，明显提高了检测效率；(4)本发明方法简单实用，不需要复杂仪器设备，只用恒温水浴锅即可完成扩增，扩增产物通过一次性试纸条进行检测，5～10min即可完成检测结果的判读，尤其适用在基层现场检测。
附图说明
图1.按行业标准SNT1195-2003：大豆转基因成分的定性PCR检测电泳图谱；其中M为100bp DNA Ladder，1为转基因大豆，2为空白对照。
图2.不同组引物CPA反应体系恒温扩增检测电泳图谱；其中1和2为C组引物，3和4为B组引物，5为A组引物。
图3.CPA反应体系恒温扩增后核酸试纸条检测照片；其中1为空白对照，2为转基因大豆。
图4.质粒DNA M13引物PCR检测电泳图谱；其中1为空白质粒；2和3为非目标质粒；4为目标质粒。
图5.不同探针浓度的CPA扩增后核酸试纸条检测照片；其中1为空白对照，2为NOS 2a*NOS 3a*分别为0.8和0.4μmol/L，3为NOS 2a*NOS 3a*分别为0.6和0.4μmol/L，4为NOS 2a*NOS 3a*分别为0.4和0.4μmol/L。
图6.不同模板浓度的CPA扩增后试纸条检测照片；其中1模板浓度为10copies/μL，2.模板浓度为102copies/μL，3.模板浓度为103copies/μL，4.模板浓度为104copies/μL。
图7.特异性核酸试纸条检测照片；其中1为转基因大豆，2为田间杂草1，3为田间杂草2，4为农民售卖大豆。
具体实施方式：
下面具体实施例仅用于对本发明作进一步的说明，但是对本发明的保护范围不构成任何限制。下面实施例中所用的方法，如无特别说明，均为本领域技术人员熟知的方法，所用药品和试剂也为本领域人员熟知的。下述实施例中引物与探针由上海生工生物工程技术有限公司合成、Thermo pol Buffer(热聚合缓冲液)和Bst DNA pol多聚酶购自北京纽英伦生物技术有限公司、dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司、Betiane(甜菜碱)购自阿拉丁试剂有限公司，所用核酸试纸条是购自杭州优思达生物技术有限公司3号核酸试纸条等。
实施例1本发明交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物筛选
选用海关进口检测为转基因阳性的大豆样品，用CTAB法提取基因组DNA为模板。以中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT1195-2003：大豆转基因成分的定性PCR检测方中NOS基因检测的一对正反向引物(即外围引物NOS 4s/5a)进行PCR(图1)。PCR产物送上海生物工程技术有限公司测序验证正确后，参考oligo 7、Primer primer 5、LAMP软件(http://primerexplorer.jp/e/)和CPA反应体系在NOS 180bp区段设计并评价3组引物，序列如下：
A组引物：
NOS3a1：5’-TGTATAATTGCGGGACTCTAA-3’
NOS2a1：5’-TTTGTTTTCTATCGTGTATTA-3’
NOS2a1s1：
5’-GTTTGTTTTCTATCGTGTATTAGTTTATGAGATGGGTTTTT-3’；
B组引物：
NOS3a2：5’-AAAACCCATCTCATAAAACA-3’
NOS2a2：5’-GTATAATTGCGGGACTCTA-3’
NOS2a1s2：
5’-GTATAATTGCGGGACTCTACGTTAAGCATGTAATAAT-3’；
C组引物：
NOS3a：5’-TTAGAGTCCCGCAATTATACA-3’(SEQ ID No:4)
NOS2a：5’-GTTTATGAGATGGGTTTTT-3’(SEQ ID No:5)
NOS2a1s：
5’-GTTTATGAGATGGGTTTTTTTTGTTTTCTATCGTGTATTA-3’(SEQ IDNo:3)
注：此处C组引物NOS2a和NOS3a尚未加标记，其序列分别与SEQ IDNo:4与SEQ ID No:5一致。
按照表1反应体系(25μL)进行恒温扩增，CPA反应程序：63℃恒温扩增90min；扩增结果用琼脂糖电泳检测。
表1 恒温扩增反应体系(以下为终浓度)
组成 空白对照 大豆样品
Thermo pol Buffer(×) 1 1
dNTPs(mmol/L) 0.2 0.2
Betiane(M) 0.2 0.2
Bst DNA pol(U/μL) 0.32 0.32
NOS4s(μmol/L) 0.12 0.12
NOS5a(μmol/L) 0.12 0.12
NOS2a1s(μmol/L) 0.8 0.8
NOS2a(μmol/L) 0.4 0.4
NOS3a(μmol/L) 0.4 0.4
Template(μL) 0 1
扩增产物的检测：扩增结束后取5μL扩增产物与1μL 6×Loading buffer拍打混合并进行琼脂糖凝胶电泳，90V，30min后观察检测结果。结果显示A组(见图2，泳道5)与B组(见图2，泳道3和4)引物均扩增效果不理想。C组引物检测结果显示扩增出连续的片段(见图2，泳道1,2)。
在C组引物NOS2a和NOS3a和上面加标记，再按上表体系进行CPA扩增，扩增结束后取10μL扩增产物滴加到3号核酸试纸条(购自杭州优思达生物技术有限公司)的加样区。将核酸试纸条放入含有200μLSSC缓冲液的微孔板中，5-10min后通过试纸条的显色进行判读。C组引物试纸条结果(见图3)显示转基因大豆样品呈阳性结果、空白对照呈阴性结果。选择C组引物为最后的引物系列。
实施例2本发明试剂盒中阳性对照的制备
(1)、利用CTAB法(参考基因工程原理和技术，主编邹克琴、叶子弘)提取转基因大豆的总DNA作为模板；以大豆转基因成分的定性PCR检测方法(中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNT1195-2003)中NOS基因检测的一对正反向引物(即外围引物NOS 4s/5a)和PCR方法对提取的转基因大豆模板进行扩增。
(2)、参照pEASY-T1载体产品使用说明书(试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司)，将PCR扩增的180bp产物与进行pEASY-T1克隆载体链接，转化到Transl-T1细胞中，IPTG诱导蓝白斑产生，取白色菌落，用NOS 4s/5a菌落PCR验证。
(3)、将阳性重组子摇菌培养，采用试剂盒提取质粒DNA，以质粒DNA为模板，以试剂盒购M13引物，PCR扩增(图4)。其中1为空质粒(阴性结果)；2和3为非目标质粒(假阳性结果)；4为目标质粒(阳性结果)
(4)、PCR验证与预期片段相一致的质粒送上海生物工程技术有限公司测序。测序正确的重组子菌落继续摇菌培养，用pEASY-T1Cloning试剂盒(试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司)提取质粒DNA，得阳性DNA样品。
实施例3本发明CPA-核酸试纸条探针浓度优化
(1)、选用海关进口检测为转基因阳性的大豆样品碾磨成粉末状，取0.1g待检样品CTAB法进行DNA提取；
(2)、以检测探针引物浓度(反应体系见表2)为变量进行交叉引物恒温扩增，CPA反应程序：63℃恒温扩增90min。
表2 25μL体系(以下为终浓度)
组成 1 2 3 4
Thermo pol Buffer× 1× 1× 1× 1×
dNTPs mmol/L 0.2 0.2 0.2 0.2
Betiane mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2
Bst DNA pol U/μL 0.32 0.32 0.32 0.32
NOS4sμmol/L 0.12 0.12 0.12 0.12
NOS5aμmol/L 0.12 0.12 0.12 0.12
NOS2a1sμmol/L 0.8 0.8 0.8 0.8
NOS2a*μmol/L 0.8 0.8 0.6 0.4
NOS3a*μmol/L 0.4 0.4 0.4 0.4
TemplateμL 0 1 1 1
(3)、扩增产物的检测：扩增结束后取10μL扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区。将试纸条放入含有200μLSSC缓冲液的微孔板中。5-10min后即可通过试纸条的显色进行判读。结果(见图5)分别为：空白对照为阴性结果，NOS 2a*NOS 3a*分别为0.8和0.4μmol/L时为阳性结果，NOS 2a*NOS 3a*分别为0.6和0.4μmol/L是为阳性结果，NOS 2a*NOS 3a*分别为0.4和0.4μmol/L时为弱阳性结果；从上述结果可知，检测探针引物浓度NOS 2a*0.4～0.8μmol/L均可进行显色判别，其中0.6μmol/L为最适浓度。
实施例4CPA-核酸试纸条DNA模板浓度优化试验
按照如下方法进行：
(1)、将实施例3中提取到的基因组DNA进行系列稀释，分别稀释至10、102、103、104copies/μL，各取1μL做模板用于CPA反应检测(表3)。
表3 DNA模板浓度优化试验反应体系(25μL)
组成 终浓度
Thermo pol Buffer× 1
dNTPs(mmol/L) 0.2
Betiane(M) 0.2
Bst DNA pol(U/μL) 0.32
NOS4s(μmol/L) 0.12
NOS5a(μmol/L) 0.12
NOS2a1s(μmol/L) 0.8
NOS2a*(μmol/L) 0.6
NOS3a*(μmol/L) 0.4
Template(μL) 1μL
CPA反应程序：63℃恒温扩增90min
(2)、扩增产物的检测：扩增结束后取10μL扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区。将试纸条放入含有200μLSSC缓冲液的微孔板中。5-10min后即可通过试纸条的显色进行判读(见图6)。模板DNA浓度为10copies/μL时为阳性结果(泳道1)，模板DNA浓度为102copies/μL时为阳性结果(泳道2)，模板DNA浓度为103copies/μL时为阳性结果(泳道3)，模板DNA浓度为104copies/μL时为阳性结果(泳道4)。从上述结果可知，当模板DNA浓度稀释至10copies/μL时仍可进行显色判读，说明其检测灵敏度高。
实施例5本发明利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的试剂盒的制备
(1)、核酸检测试纸条：3号核酸检测试纸条2包共20条，可从杭州优思达生物技术有限公司购买。
(2)、SSC缓冲液：0.3mol/L NaCl,0.03mol/L柠檬酸钠·2H2O,用1mol/LHCl调节pH至7.0；
(3)、恒温扩增反应液(A管)：包括一对外围引物、一个交叉扩增引物、一对检测探针引物、Thermol pol buffer、dNTPs溶液；其20次用量扩增反应液(共250μL)的制备方法如表4：
表4 恒温扩增反应液组成成分及其比例
试剂 浓度 加入量(μL)
正向外围引物NOS4s 4μmol/L 15
反向外围引物NOS5a 4μmol/L 15
交叉引物NOS2a1s 10μmol/L 40
检测探针引物NOS2a* 10μmol/L 30
检测探针引物NOS3a* 10μmol/L 20
dNTPs溶液 2.5mmol/L 40
Betiane甜菜碱 5M 2
Thermol pol buffer 10× 50
ddH2O 20
(4)1×Thermol pol buffer：其组成成分及其比例为：10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl、2mM MgSO4、0.1％TritonX-100、pH8.8。
(5)、Bst DNA聚合酶液(B管)：Bst DNA聚合酶液(8U/μL)共25μL；可购买得到。
(6)、无菌双蒸水(C管)，多管(C管)：作为阴性对照和补足体系用；
(7)、阳性对照(D管)：为含有NOS基因终止子片段的质粒DNA；按照实施例2方法制备。
实施例6本发明用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组特异性对比试验
(1)、购买市场上当地农民售卖的大豆(浙江海宁老盐仓农贸市场)、在田间随机摘取杂草1和杂草2，取农民售卖大豆、田间杂草以及实验用转基因大豆各0.1g用CTAB法进行DNA提取。
(2)、利用实施例5的试剂盒对提取的DNA进行交叉引物恒温扩增，25μL反应体系(见表5)：
表5 特异性对比试验反应体系
试剂 空白对照(μL) 待测样品(μL)
A管 12.5 12.5
B管 1 1
C管 11.5 10.5
模板 0 1
CPA反应程序：63℃恒温扩增90min
(3)、扩增产物的检测：扩增结束后取10μL扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区。将核酸试纸条放入含有200μL缓冲液的微孔板中。5-10min后即可通过试纸条的显色进行判读。结果(见图7)实验用转基因大豆样品试纸条检测结果为阳性，市场上农民售卖的大豆、田间杂草1、田间杂草2对照检测结果均为阴性。说明本发明对转基因产品NOS基因具有较好的特异性。
实施例7本发明利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子方法的稳定性试验
(1)、将海关进口检测为转基因阳性的大豆样品碾磨成粉末状，分不同批次分别各取0.1g待检样品CTAB法进行DNA提取；
(2)、利用实施例5制备的试剂盒对不同批次提取的DNA分别进行交叉引物恒温扩增，CPA反应程序：63℃恒温扩增90min
表6 稳定性试验反应体系(25μL)
试剂 空白对照(μL) 阳性对照(μL) 待测转基因大豆样品(μL)
A管 12.5 12.5 12.5
B管 1 1 1
C管 11.5 10.5 10.5
D管 0 1 0
模板 0 0 1
(3)、扩增产物的检测：扩增结束后取10μL扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区。将试纸条放入含有200μLSSC缓冲液的微孔板中。5-10min后即可通过试纸条的显色进行判读。经检测，不同批次提取的转基因大豆的试纸条检测结果如表7：
表7 稳定性试验反应结果
空白对照 阳性对照 转基因大豆样品
第一批次 — + +
第二批次 — + +
第三批次 — + +
第四批次 — + +
第五批次 — + +
注：其中“—”表示阴性结果，“+”表示阳性结果
即空白对照试纸条检测稳定出现阴性结果，阳性对照和转基因大豆样品试纸条检测稳定出现阳性结果。证明本发明对转基因产品NOS基因具有较好的稳定性。
从上述试验结果可以看出，本发明引物组对NOS终止子基因特异性强，与其他植物基因无交叉反应；其次本发明方法灵敏度高，10个拷贝/μL就可以检测到；检测速度快，只用恒温水浴锅即可完成扩增，扩增产物通过一次性试纸条进行检测，5～10min即可完成检测结果的判读，尤其适用在基层现场检测。

Claims (9)

1.用于交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的引物组，其特征在于由一对外围引物、一个交叉引物和一对检测探针引物组成；
其中所述的一对外围引物为：
正向外围引物NOS4s：5’-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3’(SEQ IDNo:1)，
反向外围引物NOS5a：5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3’(SEQ IDNo:2)；
所述的交叉引物NOS2a1s：
5’-GTTTATGAGATGGGTTTTTTTTGTTTTCTATCGTGTATTA-3’(SEQID No:3)；
所述一对检测探针引物为：
检测探针NOS2a*：5’-GTTTATGAGATGGGTTTTT-3’(SEQ ID No:4)
检测探针NOS3a*：5’-TTAGAGTCCCGCAATTATACA-3’(SEQ IDNo:5)；
其中检测探针NOS2a*的5’端标记修饰生物素；检测探针NOS3a*的5’端标记修饰荧光素FAM。
2.利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的试剂盒，其特征在于包括下列6个部分，分别为核酸检测试纸条、SSC缓冲液、恒温扩增反应液(A管)、Bst DNA聚合酶液(B管)、无菌双蒸水(C管)和阳性对照；其中恒温扩增反应液(A管)的组成成分及其比例为：正向外围引物NOS4s0.24μmol/L，反向外围引物NOS5a 0.24μmol/L，交叉引物NOS2a1s 1.6μmol/L，检测探针引物NOS2a*1.2μmol/L，检测探针引物NOS3a*0.8μmol/L，dNTPs溶液0.4mmol/L，Betiane甜菜碱0.4M，1×Thermol pol buffer。
3.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检测试纸条。
4.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的SSC缓冲液的组成成分及其比例为：0.3mol/L NaCl,0.03mol/L柠檬酸钠·2H2O,用1mol/L HCl调节pH至7.0。
5.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的1×Thermol polbuffer的组成成分及其比例为：10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl，2mM MgSO4，0.1％TritonX-100，pH8.8。
6.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性对照(D管)为含有NOS基因终止子片段的质粒DNA。
7.利用交叉引物和双探针恒温扩增检测NOS终止子的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)利用权利要求2所述的试剂盒配制反应体系(25μL)：恒温扩增反应液(A管)12.5μL，Bst DNA聚合酶液(B管)1μL，双蒸水(C管)10.5μL，待测样品DNA或阳性对照(D管)1μL；不足部分用双蒸水(C管)补齐；其制备方法为：按照反应体系向反应管中依次加入双蒸水(C管)、恒温扩增反应液(A管)、Bst DNA聚合酶液(B管)的和待测样品DNA或阳性对照(D管)，移液器吹打混匀；
(3)将反应管放置恒温水浴锅内，63℃温浴60～90min；
(4)将扩增产物滴加到核酸试纸条的加样区，再将核酸试纸条放入SSC缓冲液中，5～10min后通过试纸条的显色进行判读，若结果为阳性，则样本中含有检测的核酸，试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区；若结果是阴性，则只有质控区出现一条红色条带，检测区没有条带。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于所述的核酸检测试纸条是指3号核酸检测试纸条。
9.权利要求1所述的引物组在鉴定转基因植物产品上的应用。
CN201410775330.8A 2014-12-09 2014-12-15 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测nos终止子的方法 Expired - Fee Related CN104388578B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410775330.8A CN104388578B (zh) 2014-12-09 2014-12-15 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测nos终止子的方法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2014107456509 2014-12-09
CN201410745650 2014-12-09
CN201410775330.8A CN104388578B (zh) 2014-12-09 2014-12-15 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测nos终止子的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104388578A true CN104388578A (zh) 2015-03-04
CN104388578B CN104388578B (zh) 2016-08-24

Family

ID=52606534

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410775330.8A Expired - Fee Related CN104388578B (zh) 2014-12-09 2014-12-15 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测nos终止子的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104388578B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834432A (zh) * 2016-10-20 2017-06-13 广东省农业科学院动物卫生研究所 检测副猪嗜血杆菌的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用
CN108624709A (zh) * 2018-06-20 2018-10-09 中国农业大学 一种检测转基因植物中目的基因表达的通用引物及检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101638685A (zh) * 2008-07-29 2010-02-03 杭州优思达生物技术有限公司 交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用
WO2010080691A1 (en) * 2009-01-06 2010-07-15 Qimin You Cross priming amplification of target nucleic acids
CN102758005A (zh) * 2012-04-13 2012-10-31 中国检验检疫科学研究院 瓜类果斑病菌交叉引物恒温扩增检测用引物及方法
CN103614489A (zh) * 2013-08-30 2014-03-05 狄飚 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN103667498A (zh) * 2013-12-27 2014-03-26 集美大学 副溶血性弧菌的检测方法
CN103820554A (zh) * 2014-02-27 2014-05-28 中国检验检疫科学研究院 检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂盒及专用引物

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101638685A (zh) * 2008-07-29 2010-02-03 杭州优思达生物技术有限公司 交叉引物扩增靶核酸序列的方法及用于扩增靶核酸序列的试剂盒及其应用
WO2010080691A1 (en) * 2009-01-06 2010-07-15 Qimin You Cross priming amplification of target nucleic acids
CN102758005A (zh) * 2012-04-13 2012-10-31 中国检验检疫科学研究院 瓜类果斑病菌交叉引物恒温扩增检测用引物及方法
CN103614489A (zh) * 2013-08-30 2014-03-05 狄飚 一种登革热病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
CN103667498A (zh) * 2013-12-27 2014-03-26 集美大学 副溶血性弧菌的检测方法
CN103820554A (zh) * 2014-02-27 2014-05-28 中国检验检疫科学研究院 检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂盒及专用引物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GAOLIAN XU 等: "Cross Priming Amplification: Mechanism and Optimization for Isothermal DNA Amplification", 《SCI REP. 》, vol. 2, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 1 - 7 *
ZHAO YULONG 等: "Rapid and sensitive detection of Enterobacter sakazakii by cross-priming amplification combined with immuno-blotting analysis", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》, vol. 24, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 396 - 400, XP027452763, DOI: doi:10.1016/j.mcp.2010.09.001 *
刘光明 等: "植物性转基因食品的检测与验证方法", 《厦门大学学报(自然科学版)》, vol. 42, no. 3, 31 May 2003 (2003-05-31), pages 374 - 377 *
秦强 等: "CPA-核酸试纸条快速检测霍乱弧菌方法的建立与优化", 《生物技术通报》, no. 7, 31 July 2013 (2013-07-31), pages 167 - 171 *
翟聪聪 等: "一种交叉引物扩增技术检测转基因水稻品系Bt63方法的建立", 《植物检疫》, vol. 28, no. 1, 28 February 2014 (2014-02-28), pages 61 - 66 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834432A (zh) * 2016-10-20 2017-06-13 广东省农业科学院动物卫生研究所 检测副猪嗜血杆菌的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用
CN106834432B (zh) * 2016-10-20 2020-09-29 广东省农业科学院动物卫生研究所 检测副猪嗜血杆菌的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用
CN108624709A (zh) * 2018-06-20 2018-10-09 中国农业大学 一种检测转基因植物中目的基因表达的通用引物及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN104388578B (zh) 2016-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104388573B (zh) 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的方法
CN109251963A (zh) 恒温检测细胞培养液中支原体污染的方法及试剂盒
CN104450946B (zh) 转基因大豆gts40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量pcr检测引物组和方法
CN104774958B (zh) 鉴别驴、马、狐狸动物源性的引物探针组合物、试剂盒和多重实时荧光定量pcr检测方法
CN105316422A (zh) 一种用于对虾急性肝胰腺坏死病病原的快速检测试剂盒及其应用
CN104946795B (zh) 用于现场检测多种血清型口蹄疫病毒的引物、探针及试剂盒
CN102220428A (zh) 一种利用ssr法对两系杂交水稻种子进行纯度检验的方法
CN106995841A (zh) 一种转基因大豆检测用多重pcr试剂盒及检测方法
CN113186313A (zh) 基于RPA-LbCas12a-TTECDS体系的沙门氏菌检测引物组、方法与试剂盒
CN104818339B (zh) 一种油菜茎基溃疡病菌的检测方法
CN104388578A (zh) 利用交叉引物和双探针恒温扩增检测nos终止子的方法
CN103525936B (zh) 应用rpa技术对转基因水稻科丰6号品系特异性鉴定
CN106048014A (zh) 一种用于实时检测nasba产物的高特异探针
CN104372110B (zh) 一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒
CN104419708A (zh) 核酸和检测转基因水稻eb7001s及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途
CN105063187A (zh) 一种快速检测灰葡萄孢菌对sdhi类杀菌剂抗性的方法及引物组合物
CN105624300A (zh) 一种检测致病性犬钩端螺旋体的荧光pcr引物、探针及试剂盒
CN104561313B (zh) 一种适合芝麻外源基因拷贝数检测的内标基因及其构建方法与应用
CN102690835A (zh) 转基因大豆分子标准样品、其建立方法及应用
CN106434956A (zh) 一种赤潮异弯藻的检测方法
CN107699639B (zh) 一种鉴别牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌的引物及方法
CN112280906A (zh) 一种用于南芥菜花叶病毒及菜豆荚斑驳病毒检测的dpo-pcr引物对及其应用
CN106544413A (zh) 一种能同时检测猪肉和鸭肉源性成分的恒温扩增引物组及其试剂盒
CN104894280A (zh) 检测转基因玉米nos终止子的引物、试剂盒和方法
KR101444005B1 (ko) 귀리에서 Ｈａｌｏ ｂｌｉｇｈｔ 병을 일으키는 슈도모나스 코로나파시엔스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 슈도모나스 코로나파시엔스 검출 방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160824

Termination date: 20191215

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee