CN105624300A

CN105624300A - 一种检测致病性犬钩端螺旋体的荧光pcr引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN105624300A
Application number: CN201610077201.0A
Authority: CN
Inventors: 曹永国; 丁壮; 龚悦; 金雪敏; 张文龙; 吴殿君
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2016-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2016-06-01

Abstract

本发明涉及检测引物与试剂盒，具体公开了检测致病性犬钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒。所述引物如下：上游引物：5’-CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3’；下游引物：5’-GATCCTTGTATTCCACCGATG-3’；所述探针为：5ˊ-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3ˊ。本发明选择LigB基因作为检测对象，实现检测致病性钩端螺旋体的目的。本发明提供了省时省力，特异性和敏感性优异，检测致病性犬钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒。本发明提供的引物和试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早期诊断在该实验中，建立并组装的犬钩体病荧光定量PCR试剂盒检测灵敏度为10°copies/μL，钩体浓度检测灵敏度为1×10¹钩体/mL，可满足检测需要。

Description

一种检测致病性犬钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明涉及检测引物与试剂盒，具体地说，涉及检测致病性犬钩端螺旋体的荧光PCR引物、探针及试剂盒。

背景技术

钩端螺旋体病(Leptospirosis)是一种在全世界范围传播的人畜共患疾病，简称钩体病，该病尤其广泛存在于发展中国家和热带地区。犬对该病易感，感染后临床表现多样，不易进行诊断。钩体病的病原体会持续存在于宿主机体内，会进一步扩散污染环境，感染其他人和动物，危害严重。因而，犬患该病后，在危害其本身的健康的同时，还会威胁到其主人的安全。因此，需要在早期对该病作出诊断，尽早控制该病。目前，诊断犬钩体病的方法有直接镜检、分离培养、血清学检测、动物接种等实验室检测方法，与这些方法相比，PCR方法更省时省力，特异性和敏感性优异，并且可用于钩体病的早期诊断。

公开号为CN103205502A的中国专利申请公开了一种检测狗钩端螺旋体核酸的荧光定量PCR的引物、探针及试剂盒，所述引物针对致病性狗钩端螺旋体的LigA基因序列设计。然而，在众多钩体的血清型中，其中黄疸出血56601型没有LigA基因，而黄疸出血56601型会引起钩端螺旋体病。因此上述技术方案无法对致病性狗钩端螺旋体进行全面检测。

公开号为CN101935696A的中国专利申请公开了一种检测犬猫钩端螺旋体的荧光定量PCR方法及其引物和检测试剂盒，其采用16srRNA基因序列为设计引物。然而，致病性和非致病性钩体均含有16srRNA基因，上述技术方案通过检测16srRNA基因来检测犬猫钩端螺旋体，不能准确鉴别检测致病性和非致病性钩体。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种省时省力，特异性和敏感性优异，检测犬钩端螺旋体LigB基因的PCR引物及试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早期诊断。

本发明原理在于选择了犬钩端螺旋体LigB基因作为检测对象，并针对犬钩端螺旋体LigB基因特殊设计了引物，使引物具有优异的特异性和敏感性。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种检测致病性犬钩端螺旋体的PCR引物，所述引物如下：

上游引物：5’-CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3’；

下游引物：5’-GATCCTTGTATTCCACCGATG-3’；

所述探针为：

5'-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3'。

本发明还提供了所述引物与探针在制备检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒方面的应用。

由于所述引物的扩增片段能够证明犬钩端螺旋体LigB基因的存在，从而证明致病性犬钩端螺旋体的存在，因此，所述引物可用来制备检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒。

在所述引物的存在下，加入配合使用的所述探针，能都在荧光PCR仪上进行荧光定量PCR的检测。

基于上述原因，本发明还提供了含有所述引物与探针的试剂或试剂盒。

具体为一种检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒，所述试剂盒包括前述引物和探针、阳性对照、阴性对照、Taq酶、dNTP、10×Buffer、ddH₂O。

进一步地，所述阳性对照的构建方法为：

1)以黄疸出血56601的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，与pMD18-T进行连接；

2)向Trans1-T1克隆感受态中加入步骤1)获得的连接产物，筛选阳性克隆，提取质粒。

黄疸出血56601购自中国药品生物制品检定所钩端螺旋体实验室，保藏编号为56601。

为了更好的实现对致病性犬钩端螺旋体的检测，本发明优化了所述试剂盒的工作程序(尤其是退火温度)，使所述引物能够最大程度地增加反应成功率和反应效果。

优化得到的工作程序为：

94℃3min；94℃20s，58℃50s，读板，35个循环。

应用本试剂盒进行荧光定量PCR以后，把得到的CT值带入标准曲线方程，就可以得出钩体的浓度。对钩体的检测定性就够了，但能定量更好，本试剂盒不但能定性，还能定量。为了更好的实现对致病性犬钩端螺旋体的荧光定量检测，本发明还优化了所述试剂盒的工作体系(尤其是引物浓度和探针浓度)，最大程度地提高灵敏度，降低检出限。

优化得到的PCR工作体系为20μL：PremixExTaq10μL，上下游引物各0.8μL，Probe0.6μL，模板1μL，ddH₂O补足。

本发明的有益效果在于：

本发明选择LigB基因作为检测对象，实现检测致病性钩端螺旋体的目的。本发明提供了省时省力，特异性和敏感性优异，检测犬钩端螺旋体LigB基因的PCR引物、探针及试剂盒。本发明提供的引物、探针和试剂盒，可用于犬钩端螺旋体病的早期诊断在该实验中，建立并组装的犬钩体病荧光定量PCR试剂盒检测灵敏度为10⁰copies/μL，钩体浓度检测灵敏度为1×10¹钩体/mL，可满足检测需要。

附图说明

图1是本发明实施例2中退火温度的电泳检测结果图；其中，M：2000bpMarker，泳道1～5：退火温度依次为56℃，57℃，58℃，59℃，60℃。

图2是本发明实施例2中摸索引物浓度的结果图：其中，上下游引物反应终浓度梯度为0.1～0.8μM，间隔为0.1μM。

图3是本发明实施例2中摸索探针浓度的结果图：探针反应终浓度梯度为0.1～0.5μM，间隔为0.1μM。

图4是本发明实施例3中DNA标准品扩增曲线图：其中每一条曲线对应一定浓度的DNA模板。从左至右，曲线代表的DNA模板浓度依次为1，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6ng/μL,相应的检测到的扩增起始循环数依次增大。

图5是本发明实施例3中DNA标准品标准曲线图，X轴从左到右依次为DNA模板浓度1，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6ng/μL，Y轴为CT值。

图6是本发明实施例4中荧光定量PCR重复性试验结果，是3个不同浓度钩体DNA标准品的3个重复。

图7是本发明实施例5中特异性试验曲线图，其中从左到右为标准菌株黄疸出血56601，犬56603，波摩那56608，流感伤寒56609，七日热56610，塔拉索夫56635，非致病性钩体566505和空白对照。

图8是本发明实施例8中质粒标准品的荧光定量PCR结果图，从左至右，每一条曲线代表的标准阳性质粒浓度依次为10⁰～10⁸。

图9是本发明实施例8中质粒标准品标准曲线图，其中X轴为CT值，Y轴位lg(浓度copies/uL)，分别为10⁵～10⁰copies/uL。

图10是本发明实施例8中最低检测钩体菌液浓度标准曲线图，其中，X轴位lg(菌液浓度)，从左到右依次为10¹～10⁷钩体/ml，Y轴位CT值。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、菌株和临床样本

钩端螺旋体标准菌株黄疸出血56601，犬56603，波摩那56608，流感伤寒56609，七日热56610，塔拉索夫56635，非致病性钩体566505，由课题所在实验室传代培养保存。

2、主要仪器和试剂

凝胶电泳图像分析系统(北京六一仪器厂，中国)；梯度PCR仪(BiometraUNO，德国)；CO₂恒温培养箱(SANYO，日本)，细菌基因组DNA提取试剂盒以及胶回收试剂盒购自天根公司，质粒小量提取试剂盒购自OMEGA公司，；Taq酶、pMD-18t载体、Trans1-T1克隆感受态购自大连宝生物有限公司；胰蛋白胨购自英国Oxoid公司，氨苄青霉素购自NEB公司，氯化钠、琼脂糖等常规试剂购自国产公司。

实施例1引物设计与合成

根据GenBank中已发表的LigB基因序列，应用PrimerPremier5.0软件设计得到引物，经筛选得到本发明所述的引物。

筛选得到的引物通过NCBI中的BLAST进行特异性鉴定，如表1所示。引物均由大连宝生物公司合成。

表1通用引物序列

实施例2荧光定量PCR反应条件和反应体系的优化

1、根据细菌组DNA提取试剂盒产品说明，从生长良好的黄疸出血56601菌液提取DNA作为模板，首先对PCR反应的退火温度进行摸索，反应体系为20μL体系：PremixExTaq10μL，上下游引物各0.8μL，Probe0.6μL，模板1μL，ddH₂O补足。

在梯度PCR仪上进行，设置温度梯度为：56.0℃，57.0℃，58.0℃，59.0℃，60.0℃。以摸索出的最佳退火温度，进行引物浓度的优化。结果如图1所示，由图1可知，当退火温度为58.0℃时，条带最亮，检测效果最好。

2、保持Taq酶，dNTP，探针，10×Buffer，模板的加样量及终浓度不变，对上下游引物进行梯度稀释加样，用去离子水进行补足，使上下游引物反应终浓度梯度为0.1～0.8μM，间隔为0.1μM。选取得到平均最低CT值时的引物浓度。结果如图2所示，由图2可知，引物浓度为0.4μM时，平均CT值最低。

3、以摸索出的最佳退火温度和摸索出的最佳引物浓度，进行探针浓度的优化，保持Taq酶，dNTP，10×Buffer，上下游引物，模板的加样量不变，对探针进行梯度稀释加样，使探针反应终浓度梯度为0.1～0.5μM，间隔为0.1μM。选取得到平均最低CT值时的引物浓度。结果如图3所示，由图3可知，探针浓度为0.3μM时，平均CT值最低。

实施例3灵敏度试验

将实施例2提取的DNA模板经过定量作为标准品，稀释成1ng/μL，而后进行10倍梯度稀释，分别稀释成1ng/μL～1×10^-6ng/μL。利用实施例2优化得到的PCR体系和工作程序进行荧光定量PCR，绘制标准曲线，见图4、图5。由图4、图5可知，y＝-3.0832×log(DNA含量/μL)+31.468，r²为0.997，线性关系良好，对基因含量的检测灵敏度的可达到1×10^-6/μL。

实施例4重复性试验

选取3个不同浓度的标准品作为模版，分别进行荧光定量PCR反应，每个浓度的标准品进行三个重复，计算变异系数，对该方法的重复性进行检验。结果如图6所示。由图6可知，变异系数为0.23～0.93％，重复性良好，该检测方法稳定。

实施例5特异性试验

分别以标准菌株的DNA、非致病性钩体566505的DNA和空白对照为模板，利用实施例1所述引物和探针进行荧光PCR反应，检验该方法的特异性。

其中，标准菌株为最易对犬致病的钩体菌株，包括：黄疸出血56601，犬56603，波摩那56608，流感伤寒56609，七日热56610，塔拉索夫56635。

检验结果如图7所示。由图7可知，仅致病性钩体出现扩增，非致病性钩体和空白对照均未出现扩增。有良好的特异性。

实施例6构建标准阳性质粒(阳性对照)

以提取自波摩那56608的DNA作为模板，利用实施例1所述引物进行PCR扩增，进行5管10μL反应，94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，29个循环；72℃5min。将PCR反应液加入配好2％的琼脂糖凝胶中，以120V电压进行25分钟电泳，而后在紫外灯下观测后，快速对电泳纯化后的目的片段进行切取。回收目的基因片段所得的目的基因与pMD18-T进行，连接的反应体系如下：pMD18-Tvector0.5μL、PCR产物4.5μL、SolutionI5μL。在4℃冰箱中进行过夜连接反应。

从－80℃冰箱取出Trans1-T1克隆感受态，进行冰浴溶解。而后无菌操作迅速加入10μL连接产物，用移液枪进行缓慢轻微吹打混匀。而后进行30min冰浴，静置。在此期间，准备好42℃水浴，冰浴结束后42℃水浴热激30秒，而后快速冰浴2分钟，整个过程中不可摇动离心管。加入500μL经过预热的LB培养基(不含抗性)，而后置于37℃，200rpm摇床培养1h。然后进行6000rpm离心2min，弃掉上清，留200μL吹打混匀，吸取100μL菌液涂于Amp抗性LB固体培养基平板上，37℃温箱放置30min后，倒置继续进行培养过夜12h。

无菌操作，挑取转化平板上菌落接入含Amp抗性LB液体培养基的试管中，做好标记，置于37℃，200rpm摇床中进行培养，最迟12个小时，取生长浑浊菌液试管进行PCR鉴定，可扩增出符合目的片段大小者，可初步视对应试管内的菌液为阳性克隆。并对阳性菌液进行重新扩大培养，为下一步提取质粒做准备。

选取实验中PCR鉴定为阳性者的菌液，送往生工公司进行测序。测序结果为：CTTGGGATTCTTCTAATACCGATATTCTCTCAATTTCCAATGCAAGTGATAGCCACGGATTAGCTTCCACACTCAACCAAGGGAATGTTAAAGTCACTGCTTCCATCGGTGGAATACAAGGATC。并用甘油保存该管菌液重新扩大培养的菌液放置于-80℃冰箱备用。每管保存1mL，其中甘油与菌液比例为3：7。

按质粒提取试剂盒产品说明提取质粒。

实施例7试剂盒的组装

荧光定量PCR检测试剂盒中，包括阳性对照和阴性对照制品各一管，上游和下游引物各一管，探针一管，PremixExTaq一管，ddH2O一管。其中阳性对照制品是实验中所构建的质粒标准品(如实施例6所得)，阴性对照为无菌ddH₂O，上下游引物浓度为10μM，探针浓度为10μM。保存条件为-20℃。

实施例8试剂盒参数检测

1、灵敏度检测：

(1)梯度稀释定量过的所构建的质粒标准品，用荧光定量PCR试剂盒进行检测(图8)，标准阳性质粒，10⁰～10⁸，最低检测浓度为10⁰copies/μL，并构建相应标准曲线(图9)，在10⁵～10⁰copies/μL的稀释度范围内，关系式为y＝-0.339x+11.24，r²＝0.998。线性关系良好。。

(2)选取生长良好的56601钩体菌液进行计数，稀释成10⁸菌体/mL，提取菌体基因组DNA，而后用培养基对菌液进行10倍梯度稀释，荧光定量PCR检测并构建标准曲线图，见图10，线性公式y＝-3.2243x+31.124，X轴为lg(菌液浓度)，Y轴为CT值，浓度r²＝0.9943，相关性较好。最低检测钩体菌液浓度为1×10¹钩体/mL。钩体浓度检测灵敏度为1×10¹钩体/mL，可满足检测需要。

2、特异性检测：对标准菌株黄疸出血56601，犬56603，波摩那56608，流感伤寒56609，七日热56610，塔拉索夫56635，非致病性钩体566505和空白对照进行检测。仅致病性钩体呈阳性，非钩体和空白对照均为阴性。

3、重复性检测：选取3个不同浓度的标准品，进行荧光定量PCR反应，每个浓度的标准品进行三个重复，计算变异系数，验证方法的重复性，重复性良好。

4、确定保存期：将试剂盒置于-20℃下保存，间隔两周进行检测，确定其保存期。经过六个月后，检测结果依然良好，确定保存条件为-20℃，保存期最短为六个月。

5、试剂盒检出率检测：临床采集犬血液和尿液样品，以钩体检测的金标准方法显微凝集试验(MAT)方法，和建立的荧光定量PCR方法进行检测，对比检出率。荧光定量PCR方法检测出的阳性样本与MAT方法检出阳性样本数一致，检出率良好。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种检测致病性犬钩端螺旋体的PCR引物与探针，其特征在于，所述引物如下：

上游引物：5’-CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3’；

下游引物：5’-GATCCTTGTATTCCACCGATG-3’；

所述探针为：

5'-FAM-AGCCACGGRTTAGCTTCCACACTCA-BHQ1-3'。

2.权利要求1所述的引物与探针在制备检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒方面的应用。

3.含有权利要求1所述引物与探针的试剂或试剂盒。

4.一种检测致病性犬钩端螺旋体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求1所述的PCR引物与探针、阳性对照、阴性对照、Taq酶、dNTP、10×Buffer、ddH₂O。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照的构建方法为：

1)以56608菌株的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收，与pMD18-T进行连接；

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作程序为：94℃3min；94℃20s，58℃50s，读板，35个循环。

7.根据权利要求4～6任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的工作体系为20μL：PremixExTaq10μL，上下游引物各0.8μL，Probe0.6μL，模板1μL，ddH₂O补足。