CN106399486A - 用于多重pcr检测致腹泻寄生虫的引物组及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了多重PCR检测致腹泻寄生虫基因用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3‑18所示的引物，本发明还提供了多重PCR检测致腹泻寄生虫基因的检测方法和试剂盒。通过上述技术方案，本发明为致腹泻寄生虫基因的快速、准确筛查提供了完备的技术手段，能实现食物中毒事件发生后的致腹泻寄生虫快速筛检与鉴定，为合理恰当处置病情提供可靠的依据。

Description

用于多重PCR检测致腹泻寄生虫的引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及多重PCR检测致腹泻寄生虫的引物组和试剂盒及其检测方法。

背景技术

感染性腹泻是我国传染病中发病率最多、流行面最广、影响严重的一组疾病。目前对寄生虫感染引起腹泻的相关研究相对薄弱。寄生虫引起的腹泻临床上有急性腹泻和慢性腹泻，但绝大多数表现为慢性腹泻，或在急性发作后经常再发。

我国可引起腹泻的寄生虫种类多、分布广、感染高、危害大、各地流行程度不一。目前，在寄生虫病诊断中，病原学检查是寄生虫感染确诊的主要依据。临床诊断仍然主要以方便快捷的粪便病原学检查作为最直接和可靠的确诊依据。

多年来，显微镜检查粪便样本一直被认为是诊断寄生虫的“黄金标准”，其中病原学和免疫学检测方法仍被广泛应用，但是特异性和敏感性不高，不能鉴别虫种和基因型。粪便病原学检测的随机性很大，不能正确反映感染情况。尤其当感染度较低时，粪便检测方法的敏感性较低，不适用于低度流行病区寄生虫感染的检测以及疗效考核，而且，在成虫未产卵以前，即处于潜伏期时，粪便检测法则无法检测到早期感染。

免疫学诊断较病原体检测敏感性高，但由于经药物治疗后病人体内的抗体仍将持续较长时间，所以抗体检测法的疗效考核效果不理想，尤其在疫区反复感染人群中无法区别是现行感染还是既往感染。循环抗原检测相对特异性高，能反映感染虫荷，而且经治疗后，感染的宿主体内循环抗原消失快，可用于确定诊断和(或)疗效考核。但由于成虫外膜具有不断更新的特点，使得血中抗原的量不够稳定，检测结果有时难以反映真实情况，所以循环抗原检测敏感性较低，并受多种因素干扰，尤其对慢性病的检出率较低。

分子生物学技术核酸检测诊断为病原生物的检测提供了快速、高效、灵敏的诊断新方法。聚合酶链反应(PCR)技术以其高敏感性、高特异性等特点，被广泛应用于生命科学的各个领域。现已有应用于多种腹泻寄生虫的核酸检测报道，并显示出较高的敏感性和较强的特异性。在我国，不仅有可以检测单个寄生虫的报道，也有可以同时检测两种或两种以上腹泻寄生虫的试剂盒及检测方法，国外专利中多见使用PCR技术检测单个寄生虫，如日本专利2003-033184(kit and method for cryptosporidium detection)建立了一对引物检测隐孢子虫的试剂盒；美国专利8114976(Cryptosporidium hominis genes and geneproducts for chemotherapeutic，immunoprophylactic and diagnostic applications)建立了多对引物用于检测隐孢子虫的多个基因位点，用于疾病诊断和治疗。现有的分子生物学技术的缺陷在于难以对多种致腹泻寄生虫进行全面筛检，漏检率较高。

因此有必要对现有的致腹泻寄生虫的检测方式进行改进，建立一种快速、特异且敏感地判定致腹泻寄生虫及鉴别致腹泻寄生虫的检测技术。

发明内容

本发明的目的在于解决现有致腹泻寄生虫检测技术中存在的难以全面筛检和漏检率较高的问题，提供一种新的致腹泻寄生虫检测引物和方法。

为达到以上目的本发明提供了一种多重PCR检测腹泻寄生虫用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-18所示的引物；所述腹泻寄生虫包括溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica Schaudinn)、贾第鞭毛虫(Giardia lamblia Stiles)、隐孢子虫(Cryptosporidium Tyzzer)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum Katsurada)、华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)、粪类圆线虫(strongyloidiasis)、人芽囊原虫(Blastocystishominis)和卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)。

本发明的还提供了腹泻寄生虫的检测方法，该方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总DNA；

(2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；

(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有215bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶组织内阿米巴；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有423bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有贾第鞭毛虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有256bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有隐孢子虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有453bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有日本血吸虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有362bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有华支睾吸虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有334bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有粪类圆线虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有149bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有人芽囊原虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有282bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有卫氏并殖吸虫。

本发明还提供了一种多重PCR检测腹泻寄生虫的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组和DNA聚合酶。

另一方面，本发明还提供了如上所述的引物组在制备检测腹泻寄生虫的试剂盒中的用途；其中，所述腹泻寄生虫包括溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、粪类圆线虫、人芽囊原虫和卫氏并殖吸虫。

通过上述技术方案，本发明建立了八种腹泻性寄生虫多重PCR检测方法，能够克服其他技术手段的不足之处，达到以下的检测效果：

(一)多重检测覆盖全面

本发明所建立的检测方法能够在一个PCR反应中同时筛查包括溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、粪类圆线虫、人芽囊原虫和卫氏并殖吸虫的八种常见腹泻性寄生虫，全面涵盖了以腹泻为主要临床症状的寄生虫和食品安全筛查常见的腹泻寄生虫，快速获得检测结果，节省时间、人力和物力成本。

(二)特异性高

本发明所建立的检测方法特异性主要体现在一整套引物的特异性，所有引物都经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性验证，能够很好的区分与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌，包括沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌等，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非目标细菌准确分辨出来。

(三)灵敏度高

本发明所建立的检测方法能够实现八个目标寄生虫核酸的同时筛检，在每一个反应体系中每个目标寄生虫的检测灵敏度可达到0.002ng/ul。本发明灵敏度提高的主要原因是本发明针对所有目标基因的特异性引物对序列设计了特定的LHP序列，LHP序列中的同源通用引物能够在第二阶段PCR中提高多重PCR反应的扩增效率，降低多重PCR反应的非特异性扩增和引物二聚体的产生，而LHP中的6个碱基连接序列能够保证同源通用引物扩增不同毒力基因时具有相同的扩增效率，避免多重PCR扩增过程中不同目标基因产量的失衡，从而在总体上提高多重PCR检测的灵敏度。

(四)成本较低

本发明所建立的多重PCR检测方法在操作性上降低了人力成本和时间成本，原来单重检测需要八次人工和八倍时间，现在使用此方法只需要一次人工和一次反应的时间；该多重检测方法同时节省了重复检测同一个样本的试剂消耗，最大可节省50％以上的试剂成本。

(五)预防假阴性结果

体系中添加的阳性内对照引物和对应的模板，可以有效的提示假阴性检测结果。

本发明为八种常见腹泻性寄生虫的快速检测提供了完备的解决方案，能实现临床腹泻寄生虫源的快速检测，为尽快处置疫情和建立临床治疗节省宝贵的时间。

综上所述，本发明提供一种多重PCR检测八种常见腹泻性寄生虫的引物组，并建立一种基于普通PCR平台的多重PCR检测方法。本发明采用高灵敏度和特异性的引物序列，保证检测结果的质量；该检测方法操作简单，省时省力；检测通量高，试剂耗材成本低；可以直接对粪便样本进行检测，相比较于传统检测方法，将能够提前24-72小时锁定可疑寄生虫；对检测平台和检测人员的要求低，能够在检验检疫第一线广泛推广。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明试剂盒检测八种致腹泻寄生虫实验结果；

B1：贾第鞭毛虫、隐孢子虫、溶组织内阿米巴的检测；

B2:日本血吸虫、华支睾吸虫、人芽囊原虫的检测；

B3：阳性内对照、粪类圆线虫、卫氏并殖吸虫的检测；

B4:空白对照。

图2是本发明试剂盒敏感性实验结果；

B12：Marker；

B1:检测浓度为0.2ng/μl的八种致腹泻寄生虫扩增效果；

B2:检测浓度为0.02ng/μl的八种致腹泻寄生虫扩增效果；

B3:检测浓度为0.002ng/μl的八种致腹泻寄生虫扩增效果；

B4:空白对照。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种多重PCR检测腹泻寄生虫用引物组，其中，该引物组包括SEQ IDNO.1和3-18所示的引物；所述腹泻寄生虫包括溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、粪类圆线虫、人芽囊原虫和卫氏并殖吸虫。

其中，所述引物组还包括SEQ ID NO.19-20所示的引物。SEQ ID NO.19-20所示的引物是以pET28a为模板设计的一对引物，作为阳性内对照引物对。

本发明的PCR引物组检测目标基因包括溶组织内阿米巴18S核糖体RNA基因、贾第鞭毛虫磷酸丙糖异构酶基因、隐孢子虫DNAJ-like蛋白基因、日本血吸虫28S核糖体RNA基因、华支睾吸虫线粒体NAD2基因、粪类圆线虫18S核糖体RNA基因、人芽囊原虫18S核糖体RNA基因和卫氏并殖吸虫线粒体环氧化酶亚单位Ⅰ基因，(如表1所示)。

表1八种腹泻寄生虫多重PCR检测目标基因

目标寄生虫	检测目标基因	检测目标基因代码
			溶组织内阿米巴	18S核糖体RNA	En.18S
贾第鞭毛虫	磷酸丙糖异构酶基因	tim
			隐孢子虫	DNAJ-like蛋白基因	J-like
日本血吸虫	28S核糖体RNA	SJ.28S
			华支睾吸虫	线粒体NAD2基因	NAD
粪类圆线虫	18S核糖体RNA	SS.18S
			人芽囊原虫	18S核糖体RNA	Bh.18S
卫氏并殖吸虫	线粒体环氧化酶亚单位Ⅰ基因	COI

SEQ ID NO.3-18所示的8对引物序列中均含有与之匹配的LHP序列(基于连接序列的同源通用引物based on ligation-sequence homogenous Primer，LHP)。LHP序列与每条特异性引物连接后使用，同源通用引物单独使用，序列详见表2。

表2八种腹泻性寄生虫多重PCR引物汇总表

在本发明的一种实施方式中，涉及多重PCR检测腹泻寄生虫的检测方法，(1)提取待测样本的总DNA；(2)以所述总DNA为模板，并使用本发明所提供的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有215bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶组织内阿米巴；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有423bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有贾第鞭毛虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有256bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有隐孢子虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有453bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有日本血吸虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有362bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有华支睾吸虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有334bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有粪类圆线虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有149bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有人芽囊原虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有282bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有卫氏并殖吸虫。

其中，优选地，SEQ ID NO.3-20所示的引物的最终使用浓度各自为0.1-0.8μM，SEQID NO.1所示的引物的最终使用浓度为0.4-0.8μM。

其中，优选地，多重PCR反应的条件包括如下a-h的步骤：

a：94-96℃，3-6min；

b：94-96℃，15-60s，

c：50-60℃，15-60s，

d：71-73℃，60-120s，进行10-15个b-d的循环；

e：94-96℃，15-60s，

f：55-65℃，15-60s，

g：71-73℃，30-60s，进行30-35个e-g的循环；

h：71-73℃，5-10min。

其中，所述待测样本可以包括但不限于食品、药品、排泄物、呕吐物和体液中的至少一种。本发明的多重PCR检测方法不用于诊断。或者说，检测结果与疾病是否发生没有一一对应的相关性，不属于诊断结果，但是检测结果能够作为中间信息，供临床医生参考。

其中，优选地，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。

在本发明的一种实施方式中，采用QIaxcel全自动毛细管电泳分析仪作为结果分析的平台。基于QIaxcel的全自动操作和设定的智能化结果分析程序，从而实现结果的自动判定分析。

本发明的一个方面还提供了一种多重PCR检测腹泻寄生虫的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组和DNA聚合酶；所述腹泻寄生虫包括溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、粪类圆线虫、人芽囊原虫和卫氏并殖吸虫。

优选的，所述试剂盒还包括PCR反应所需的PCR反应试剂，所述反应试剂可以为PCR反应缓冲液和dNTP。

另一方面，本发明还提供了如上所述的引物组在制备检测腹泻寄生虫的试剂盒中的用途；其中，所述腹泻寄生虫包括溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、粪类圆线虫、人芽囊原虫和卫氏并殖吸虫。

下面结合实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

1、引物合成：进行SEQ ID NO.1和3-20的引物合成。以物质的量为单位，将SEQ IDNO.3-20的引物各取1份，与4份的SEQ ID NO.1的引物混合，构成本实施例的引物组。引物汇总表见表3。

表3多重PCR引物序列汇总表

2、特异性验证：

选择12种无关病原体作为模拟干扰样本：沙门氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为50001)、志贺氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为51054)、副溶血性弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21617)、空肠弯曲菌(购自中国医学菌种保藏中心，186089)金黄色葡萄球菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为26003)、蜡样芽孢杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为63303)、单核细胞增生性李斯特氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为54002)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为52201)、阪崎肠杆菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为21665)、大肠杆菌埃希氏菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为43317)、霍乱弧菌(购自中国医学菌种保藏中心，编号为1109)。

上述模拟干扰样本用于特异性评估，分别进行总核酸的提取，每种样本提取得到的总核酸溶解于TE缓冲液中，浓度为1ng/μL。

使用上述得到的每种样本的总核酸与质粒pET28a(1:1)混合，作为模板，用上述得到的引物组多重PCR扩增。

按照如下操作配制25μL的反应体系，其配置如下：2×PCR Buffer 12.5μL；DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板2μL，超纯水7μL。引物浓度如表4所示。

表4引物浓度表

引物编号	10×引物混合物
		SEQ ID NO.1	8μM
SEQ ID NO.3-20	3μM/每条引物

反应的条件包括如下a-h的步骤：a：95℃5min；b：95℃15s，c：50℃30s，d：72℃90s，b-d循环10个反应；e：95℃15s，f：60℃30s，g：72℃30s，e-g循环35个反应；h：72℃5min。

多重PCR产物置于QIAxcel全自动毛细管电泳分析仪中进行分析，结果显示，12种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照混合作为模板所进行的多重PCR全部扩增到了532bp的阳性内对照条带，但除532bp的阳性内对照条带外，均没有扩增出其它条带。由此证明，本实施例的引物组难以被无关病原体所干扰，具有较高的特异性。

实施例2

1、多重PCR检测试剂盒的组建

该试剂盒由2×反应体系缓冲液、DNA聚合酶、10×引物混合液、阳性对照、超纯水构成，其具体组分如下：2×PCR Buffer(Tris-HCl 40Mm(pH 8.3)，KCl 100mM，tween-200.08％，0.0006ng/μL PET28a，1mM dNTP、8mM MgCl₂)；25×DNA聚合酶(2U/μL)；10×引物混合液(包括IAC在内的长引物对浓度各2μM，同源通用引物SEQ ID NO.1浓度为8μm)；阳性对照(含有8个寄生虫的混合模板，每种均为0.2ng/μL)。

2、基因组的提取

选择溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、粪类圆线虫、人芽囊原虫和卫氏并殖吸虫作为建立检测方法的目标寄生虫，分别按照国标或者行业标准方法对八种寄生虫进行虫体的收集，采用DNA提取试剂盒提取DNA模板。寄生虫采集方法如下：收集粪便标本用特制的粪便盒或油纸，如果使用便盆则必须洗涤干净，不要用消毒剂洗涤，不要使尿或水混入粪便或容器内，以免杀死滋养体。采取粪便务求新鲜。标本收集后，及时处理，以免滋养体死亡变形。室温低於15℃时应注意保温，以便涂制标本观察虫体活动，若当时不能立即进行涂片观察，可将粪便暂放置4℃冰箱中，待进行观察或制片时再加温(37℃)使虫体活动，但放置于冰箱的时间不宜超过4h。

3、反应体系的配制

取200μL的PCR管配置25μL的反应体系，其配置如下：2×PCR Buffer 12.5μL；DNA聚合酶1μL；10×引物混合物2.5μL；模板5μL，超纯水4μL。

4、PCR反应

将PCR管放入Bio-Rad C1000型PCR仪中，开启热盖后，按照如下程序进行PCR反应：a：95℃5min；b：95℃15s，c：50℃30s，d：72℃90s，b-d循环10个反应；e：95℃15s，f：60℃30s，g：72℃30s，e-g循环35个反应；h：72℃5min。

5、全自动毛细管电泳分析PCR产物

将PCR反应管放入全自动毛细管电泳仪Qiaxcel Advanced(凯捷公司)，使用DNAHigh Resolution Kit卡夹，选择15bp-2000bp的Alignment marker，100-2000bp的sizemarker，自动分析目标条带的大小。

6、结果判断

根据溶组织内阿米巴215bp、贾第鞭毛虫423bp、隐孢子虫256bp、日本血吸虫453bp、华支睾吸虫362bp、粪类圆线虫334bp、人芽囊原虫149bp、卫氏并殖吸虫282bp。判定粪便样本中是否含有寄生虫及寄生虫种类。

包括空白对照在内的所有泳道均至少有一个条带扩增，空白对照泳道有阳性内对照(532bp)的扩增，其他检测有目标条带和(或)阳性内对照的扩增，表明所有PCR反应均成立，排除假阴性的结果。否则视实验无效，需要重复。结果如图1所示。

实施例3试剂盒的最低检出限试验

评估用检测样本：选择8种寄生虫，样本1(模板1)为溶组织内阿米巴，样本2(模板2)为贾第鞭毛虫，样本3(模板3)为隐孢子虫，样本4(模板4)为日本血吸虫，样本5(模板5)为华支睾吸虫，样本6(模板6)为粪类圆线虫，样本7(模板7)为人芽囊原虫，样本8(模板8)为卫氏并殖吸虫，样本9(模板9)为上述八种寄生虫的混合模板。将9个模板的菌悬液分别调整至20ng/ul，将9个样本梯度稀释成2ng/ul，0.2ng/ul，0.02ng/ul，0.002ng/ul及0.0002ng/ul的检测样品。

使用本发明试剂盒分别检测不同稀释度的模板。根据实施例2进行操作和结果判断，试剂盒检测8个目标基因的最低检出限试验结果如表5和图2所示：

表5试剂盒检测寄生虫目标基因最低检出限试验结果

模板编号

所含检测目标

0.2ng/ul

0.02ng/ul

0.002ng/ul

0.0002ng/ul

0.00002ng/ul

1

溶组织内阿米巴

是

是

是

是

否

2

贾第鞭毛虫

是

是

是

是

否

3

隐孢子虫

是

是

是

是

否

4

日本血吸虫

是

是

是

是

否

5

华支睾吸虫

是

是

是

是

否

6

粪类圆线虫

是

是

是

是

否

7

人芽囊原虫

是

是

是

是

否

8

卫氏并殖吸虫

是

是

是

是

否

9

八种混合

是

是

是

是

否

从表5看出，试剂盒检测八种寄生虫核酸的最低检出限均为0.0002ng/ul，试剂盒总体的最低检出限为每个反应0.0002ng/ul。

对比例1

制备对比引物21-36，见表6。

表6对比引物序列表

按照实施例1的方法进行检测，区别仅在于，将实施例1的引物组中SEQ ID NO.3-4所示的引物替换为SEQ ID NO.21-22所示的引物获得对比引物组1。

将实施例1的引物组中SEQ ID NO.5-6所示的引物替换为SEQ ID NO.23-24所示的引物获得对比引物组2。

将实施例1的引物组中SEQ ID NO.7-8所示的引物替换为SEQ ID NO.25-26所示的引物获得对比引物组3。

将实施例1的引物组中SEQ ID NO.9-10所示的引物替换为SEQ ID NO.27-28所示的引物获得对比引物组4。

将实施例1的引物组中SEQ ID NO.11-12所示的引物替换为SEQ ID NO.29-30所示的引物获得对比引物组5。

将实施例1的引物组中SEQ ID NO.13-14所示的引物替换为SEQ ID NO.31-32所示的引物获得对比引物组6。

将实施例1的引物组中SEQ ID NO.15-16所示的引物替换为SEQ ID NO.33-34所示的引物获得对比引物组7。

将实施例1的引物组中SEQ ID NO.17-18所示的引物替换为SEQ ID NO.35-36所示的引物获得对比引物组8。

实施例1的引物组中SEQ ID NO.3-18所示的引物替换为SEQ ID NO.21-36所示的引物获得对比引物组9。

其中，用对比引物组1扩增溶组织内阿米巴标准品质粒样品；

用对比引物组2扩增贾第鞭毛虫标准品质粒样品；

用对比引物组3扩增隐孢子虫标准品质粒样品；

用对比引物组4扩增日本血吸虫标准品质粒样品；

用对比引物组5扩增华支睾吸虫标准品质粒样品；

用对比引物组6扩增粪类圆线虫标准品质粒样品；

用对比引物组7扩增人芽囊原虫标准品质粒样品；

用对比引物组8扩增卫氏并殖吸虫标准品质粒样品；

用对比引物组9扩增8种寄生虫标准品质粒与阳性内对照混合物样品。

用对比引物组9扩增12种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照的混合样本。

分别按照与实施例1和2相同的方法进行特异性和敏感性试验，结果显示本对比例的引物21-36的特异性、敏感性均差于实施例1-3的引物。

在对目标标准化质粒的扩增中，对比组2和6没有检出目标，最低检出限低于0.0002ng/ul，较本试剂盒较差；

在对12种无关病原体样本的总核酸与等量的阳性内对照的混合样本的特异性展示中，除了阳性内对照外还有其余的杂带，说明其特异性较差。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (9)

1.一种多重PCR检测腹泻寄生虫用引物组，其中，该引物组包括SEQ ID NO.1和3-18所示的引物；所述腹泻寄生虫包括溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、粪类圆线虫、人芽囊原虫和卫氏并殖吸虫。

2.根据权利要求1所述的引物组，其中，所述引物组还包括SEQ ID NO.19-20所示的引物。

3.腹泻寄生虫的检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总DNA；

(2)以所述总DNA为模板，并使用权利要求1或2所述的引物组，进行多重PCR反应，获得多重PCR扩增后的物料；

(3)对所述多重PCR扩增后的物料进行核酸电泳检测，得到核酸电泳检测的结果；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有215bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有溶组织内阿米巴；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有423bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有贾第鞭毛虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有256bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有隐孢子虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有453bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有日本血吸虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有362bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有华支睾吸虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有334bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有粪类圆线虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有149bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有人芽囊原虫；

如果核酸电泳检测的结果显示所述多重PCR扩增后的物料中含有282bp的扩增产物，则指示所述待测样本中含有卫氏并殖吸虫。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其中，SEQ ID NO.3-20所示的引物的最终使用浓度各自为0.1-0.8μM，SEQ ID NO.1所示的引物的最终使用浓度为0.4-0.8μM。

5.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，多重PCR反应的条件包括如下a-h的步骤：

a：94-96℃，3-6min；

b：94-96℃，15-60s，

c：50-60℃，15-60s，

d：71-73℃，60-120s，进行10-15个b-d的循环；

e：94-96℃，15-60s，

f：55-65℃，15-60s，

g：71-73℃，30-60s，进行30-35个e-g的循环；

h：71-73℃，5-10min。

6.根据权利要求3或4所述的检测方法，其中，所述核酸电泳检测包括核酸凝胶电泳和/或核酸毛细管电泳。

7.一种多重PCR检测腹泻寄生虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组和DNA聚合酶；所述腹泻寄生虫包括溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、粪类圆线虫、人芽囊原虫和卫氏并殖吸虫。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液和dNTP。

9.权利要求1或2所述的引物组在制备检测腹泻寄生虫的试剂盒中的用途；其中，所述腹泻寄生虫包括溶组织内阿米巴、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、日本血吸虫、华支睾吸虫、粪类圆线虫、人芽囊原虫和卫氏并殖吸虫。