CN105385789A - 一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用 Download PDF

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陈忠伟
张宁
何颖
秦毅斌
卢冰霞
郭旋
赵武
刘磊
李斌
段群棚
周英宁
梁家幸
杨思仪
蒋冬福
苏乾莲
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Guangxi State Farms Yongxin Animal Husbandry Group Co Ltd
Guangxi Veterinary Research Institute
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Abstract

本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒的可视化逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪传染性胃肠炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB，其应用包括使用该试剂盒检测猪传染性胃肠炎病变组织和带毒粪便。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的逆转录环介导等温扩增试剂盒可实时监测反应并且定量检测出猪传染性胃肠炎病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪传染性胃肠炎病毒带来便利。

Description

一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪传染性胃肠炎病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎(Porcinetransmissiblegastroenteritis,TGE)是一种由α-冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（transmissivlegastroenteritisvirusofswine,TGEV）引发的猪的一种高度接触传染性疾病。该病毒可在易感动物小肠绒毛上皮细胞上复制，导致细胞变性、绒毛缩短等并引起营养吸收障碍和腹泻。不同年龄和品种猪均易感。新生仔猪感染TGEV后20h内呈现胃肠炎症状，在1-4d死亡，1周龄仔猪感染后死亡率可达100％。
猪传染性胃肠炎（TGE）是一种世界范围内流行的疾病，美国的Doyle和Hutchings1946年首次道了TGE，之后日本、英国、加拿大、朝鲜等许多国家相继报道了本病，呈现世界性分布。我国从20世纪50年代末期就有该病的报道，近年来全国各地区地区时有发生与流行，并且经常伴随着与猪轮状病毒病和猪流行性腹湾病的混合感染，目前无有效的治疗药物，因此给我国养猪业造成了极大地经济损失。由于TGE的发病日龄小，感染率、死亡率高，世界动物卫生组织（OIE）已将其列为B类疾病中必检的传染病。因此，很有必要对猪传染性胃肠炎的快速诊断方法进行研究来有效而快速地防控TGE。
对猪传染性胃肠炎病毒的快速准确诊断是临床上防治猪传染性胃肠炎的关键。目前已建立了病毒分离、免疫电子显微镜技术（IEM）、血清学试验、核酸探针和聚合酶链反应（PCR）等方法。传统的病毒分离鉴定方法尽管可以作为确诊该病的最终诊断依据，但其操作时间长，过程复杂，不适于快速检测要求。IEM、核酸探针和PCR等技术具备敏感性高及特异性强等优点，但对试验条件要求比较高，需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，且操作相对复杂，检测成本高，只有专业检测实验室才能配备，基层单位难以开展容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。
发明内容
本发明的目的是为了解决基层检测猪传染性胃肠炎病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题，提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒，为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪传染性胃肠炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；
其中：
F3TCAACAGATTGGTTATTGGAAT
B3ATTAGCACCACGACTACC
FIPAGTAGAAGAACCACCTTTCAGGAAGGACAAACTCGCTATCGCA
BIPGTACTGGACCTCATGCAGATGCTTGTTCATGGCACCATCC
LFCTCTTTACGTTGGCCCTTCAC
LBGATGGAGTTGTCTGGGTTGC
所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
以上所述的猪传染性胃肠炎病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪传染性胃肠炎病毒的RNA，自猪病变组织样品或粪便中提取的猪传染性胃肠炎病毒的RNA。
以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL15-35mM、MgSO415-20mM、(NH4)2SO415-25mM、Tween200.4-0.8%、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM，其配制方法在pH为8.6条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于兽医临床上检测疑似猪传染性胃肠炎病变组织或猪粪便排泄物中是否含有猪传染性胃肠炎病毒，具体检测步骤包括：
（1）RT-LAMP引物的设计与合成
（2）猪传染性胃肠炎病毒RNA模板的提取
（3）RT-LAMP反应体系建立
（4）RT-LAMP检测方法。
以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25μl计，
2×反应缓冲液12.5μL
EM1μL
FIP40pmol
BIP40pmol
LF20pmol
LB20pmol
F35pmol
B35pmol
猪传染性胃肠炎病毒RNA5μL
超纯水补足25μL。
以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
以上所述的RT-LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在10-30分钟间出现扩增。
本发明的实质性特点和进步是：
1）特异性强
本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。
2）灵敏度高
普通PCR检测方法的灵敏度为1.65×10-5ng/μL，而使用本发明的RT-LAMP检测方法，检测限约为1.65×10-7ng/μL，是普通PCR的100倍。
3）迅速获得结果
普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组RNA提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在10分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从基因组RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
4）不造成污染
目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖。此外，本发明的RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
5）可实时定量
本发明利用Tubidimeterreal-timeLA-320浊度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪传染性胃肠炎病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
附图说明
图1是本发明的RT-LAMP方法特异性检测结果，其中1：猪传染性胃肠炎病毒；2：猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒；3：口蹄疫病毒；4：猪瘟病毒；5：圆环病毒2型；6：猪细小病毒；7：伪狂犬病毒；8：流行性腹泻病毒；9：空白对照（水）。结果显示猪传染性胃肠炎病毒反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增。
图2和图3是分别使用本发明RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法进行的猪传染性胃肠炎病毒敏感性检测的结果。其中1：1.65×101ng/μL；2：1.65×100ng/μL；3：1.65×10-1ng/μL；4：1.65×10-2ng/μL；5：1.65×10-3ng/μL；6：1.65×10-4ng/μL；7：1.65×10-5ng/μL；8：1.65×10-6ng/μL；9：1.65×10-7ng/μL；10：水。猪传染性胃肠炎病毒基因组RNA的起始浓度为1.65×101ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为1.65×10-7ng/μL，而普通PCR方法检测限约为1.65×10-5ng/μL。
图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪传染性胃肠炎病毒基因组RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
图5是本发明猪传染性胃肠炎病毒定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪传染性胃肠炎病毒拷贝数。
具体实施方式
1、材料的准备
猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、圆环病毒2型、猪细小病毒、伪狂犬病毒和猪流行性腹泻病毒，均为市售疫苗。RT-LAMPRNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。
2、RT-LAMP引物的设计与合成
根据GenBank中的猪传染性胃肠炎病毒N基因序列，利用RT-LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，LF和LB为环引物，其中
F3TCAACAGATTGGTTATTGGAAT
B3ATTAGCACCACGACTACC
FIPAGTAGAAGAACCACCTTTCAGGAAGGACAAACTCGCTATCGCA
BIPGTACTGGACCTCATGCAGATGCTTGTTCATGGCACCATCC
LFCTCTTTACGTTGGCCCTTCAC
LBGATGGAGTTGTCTGGGTTGC
3、病毒基因组RNA提取
使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548）提取猪传染性胃肠炎病毒或疑似猪传染性胃肠炎病毒感染的病变组织和粪便的DNA/RNA，以及对照病毒的基因组DNA/RNA。
4、RT-LAMP反应体系建立
按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：
2×反应缓冲液12.5μL
EM1μL
FIP40pmol
BIP40pmol
LF20pmol
LB20pmol
F35pmol
B35pmol
猪传染性胃肠炎病毒RNA5μL
超纯水补足25μL。
RT-LAMP反应在以实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达到0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以63℃做为反应温度。
5、RT-LAMP检测方法
1）特异性检测
使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取猪传染性胃肠炎病毒以及对照毒株-猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、圆环病毒2型、细小病毒、伪狂犬病毒和流行性腹泻病毒的基因组DNA/RNA，作为RT-LAMP反应的模板，同时以水作为空白对照，检验RT-LAMP方法的特异性。
2）敏感性检测
提取的猪传染性胃肠炎病毒基因组RNA，测定其浓度，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释成9个稀释度，以各RNA稀释度作为模板，进行RT-LAMP扩增和PCR扩增，对比本发明的RT-LAMP方法和普通PCR方法对检测猪传染性胃肠炎的敏感性。
3）荧光可视化检测
根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应30分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。
实施例1RT-LAMP检测方法的特异性结果
对1株猪传染性胃肠炎病毒、7株对照病毒和水对照进行RT-LAMP扩增，结果如图1所示，猪传染性胃肠炎病毒反应管在10分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增情况出现，为阴性结果。
实施例2RT-LAMP检测方法的敏感性结果
猪传染性胃肠炎病毒基因组RNA的起始浓度为1.65×10ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和普通PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为1.65×10-7ng/μL，而普通PCR法检测限为1.65×10-5ng/μL。
实施例3RT-LAMP检测方法的荧光可视化检测结果
根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为以猪传染性胃肠炎病毒RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，建立的RT-LAMP方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的RT-LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
实施例4猪传染性胃肠炎病毒定量标准曲线的绘制
以猪传染性胃肠炎病毒RNA为模板，以本RT-LAMP方法设计的外引物F3和B3为PCR扩增引物，将PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒RNA，经测序确认后，作为标准样品，测定重组质粒pMD18-T-N的起始浓度，用RNA-FreeWater进行连续10倍倍比稀释9个稀释度，取各稀释度5μL作为模板进行RT-LAMP扩增，
设置对照：浓度为1.68×101ng/μL、1.68×100ng/μL、1.68×10-1ng/μL、1.68×10-2ng/μL、1.68×10-3ng/μL、1.68×10-4ng/μL、1.68×10-5ng/μL、1.68×10-6ng/μL、1.68×10-7ng/μL的标准重组质粒pMD18-T-N样品各一个，因为浓度的负对数值与浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=0.4384x-5.1347，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0.9937，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10-y，再乘以基数1.68，即为1.68×10-yng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL=（6.02×1023×(ng/ul×10-9)）/(RNAlength×660)，RNAlength为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+187=2880bp，将其换算成拷贝数（copies/μL）：6.02×1023×（1.68×10-y×10-9）/(2880×660)，简化为：5.32×108×10-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为20分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于3.63，则浓度为10-3.63，再乘以基数1.68，即为该试验样品的浓度1.68×10-3.63ng/μL，拷贝数为5.32×108×10-3.63，即为5.32×104.37copies/μL，从而达到定量的效果。
表1样品浓度负对数值与TGEV-LAMP浊度值时间线性关系表
时间（分钟） 10 12 14 16 18 20 23 26 28
浓度负对数 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
<110>广西壮族自治区兽医研究所广西农垦永新畜牧集团金光有限公司
<120>一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
<160>6
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
TCAACAGATTGGTTATTGGAAT
<210>2
<211>8
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ATTAGCACCACGACTACC
<210>3
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
AGTAGAAGAACCACCTTTCAGGAAGGACAAACTCGCTATCGCA
<210>4
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
GTACTGGACCTCATGCAGATGCTTGTTCATGGCACCATCC
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
CTCTTTACGTTGGCCCTTCAC
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
GATGGAGTTGTCTGGGTTGC

Claims (8)

1.一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪传染性胃肠炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；
其中：
F3TCAACAGATTGGTTATTGGAAT
B3ATTAGCACCACGACTACC
FIPAGTAGAAGAACCACCTTTCAGGAAGGACAAACTCGCTATCGCA
BIPGTACTGGACCTCATGCAGATGCTTGTTCATGGCACCATCC
LFCTCTTTACGTTGGCCCTTCAC
LBGATGGAGTTGTCTGGGTTGC
所述的2×反应缓冲液是Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
2.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的猪传染性胃肠炎病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取，自猪病变组织样品或粪便中提取的猪传染性胃肠炎病毒的RNA。
3.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
4.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL35-55mM、KCL15-35mM、MgSO415-20mM、(NH4)2SO415-25mM、Tween200.4-0.8%、Betaine1.5-3.0M和dNTPs2.5-4mM。
5.一种猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，用于兽医临床上检测疑似猪传染性胃肠炎病变组织或猪粪便排泄物等是否含有猪传染性胃肠炎病毒，具体检测步骤包括：
（1）RT-LAMP引物的设计与合成
（2）猪传染性胃肠炎病毒RNA模板的提取
（3）RT-LAMP反应体系的建立
（4）RT-LAMP检测方法。
6.根据权利要求5所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP反应体系建立以25μl计，
2×反应缓冲液12.5μL
EM1μL
FIP40pmol
BIP40pmol
LF20pmol
LB20pmol
F35pmol
B35pmol
猪传染性胃肠炎病毒RNA5μL
超纯水补足25μL。
7.根据权利要求5所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
8.根据权利要求5所述的猪传染性胃肠炎病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
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