CN105400902A - 一种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测小反刍兽疫病毒（PPRV）的可视化逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水和反应模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB，该检测试剂盒主要用于检测疑似PPRV感染的病变组织是否存在PPRV。特异性检测和敏感性检测证实，本发明提供的RT-LAMP试剂盒可实时监测反应并且定量检测出小反刍兽疫病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测小反刍兽疫病毒带来便利。

Description

一种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测小反刍兽疫病毒（PPRV）的逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用。

背景技术

小反刍兽疫(pestedespetitsruminants,PPR)，是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病，主要感染山羊、绵羊等小反刍兽，特别是山羊高度易感，野生动物偶然发生，感染率和死亡率高达100%和90%。OIE曾将该病例为发病必须报告的A类动物传染病，我国将其列为Ⅰ类动物疫病，一旦发现必须采取紧急严厉的措施进行控制和扑灭。在我国周边的老挝、孟加拉国、印度、尼泊尔、俄罗斯、巴基斯坦和缅甸等国家大规模暴发疫情，对我国养羊业构成了严重威胁。2007年7月，我国西藏日土县发生PPR疫情，虽然及时采取有效措施扑灭了这次疫情，但这些年我国的一些省份都有小反刍兽疫阳性病例的报道，这提醒我们要对该疾病持续监测，防止疫情再次出现。因此，建立特异、敏感的PPR诊断技术非常重要。

目前，小反刍兽疫病毒的检测技术主要病毒分离鉴定、抗体血清学检测、病毒核酸检测。病毒分离鉴定方法，其结果准确可靠，但该方法操作复杂，需要复杂的仪器设备和安全级别高的实验室环境，对操作人员的技术水平要求高，此外所需时间长，以及受影响的因素多等缺点，不利小反刍兽疫病毒的快速诊断。抗体血清学检测技术主要是采用OIE推荐的病毒中和试验(VNT)和竞争ELISA(c-ELISA)。由于小反刍兽疫病毒和同属的牛瘟病毒，在血清检测中具有共同的抗原，中和试验也有一定程度的交叉反应，因此二者极易混淆；竞争ELISA也费时且要求活病毒存在。病毒核酸检测方法主要普通的RT-PCR方法和荧光RT-PCR方法，后者的检测敏感性比前者高，虽然这两种方法较病毒分离鉴定和血清学检测方法快速准确，RT-PCR需要昂贵的PCR仪，且在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，尽管荧光RT-PCR在结果判定上可直接在仪器上读取结果，但是荧光PCR仪比普通PCR仪更昂贵，且试剂费更高，不利于基层检测以及现场批量检测。

发明内容

本发明的目的是为了解决基层快速、批量、准确检测小反刍兽疫（PPRV），提供一种方便基层简便、快捷准确地检测PPRV的试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案为：一种检测小反刍兽疫病毒的转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水、阳性对照和阴性对照，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；

其中引物的序列分别为：

F3GACCAGAGAAGGGGTCAAAG

B3CTGCAGCCTGAAGAGTGC

FIPTCTCTCCTCTGGGCCTTCCTGCTGCGATCCCAAACGGAG

BIPGCCAACTGCTCCTGGACATCATTGAGCCTCACGAGGGTT

LFGTGTTTGCTTTCTGTCCCTTTCTTC

LBAGAGGATGAGATCTTGCGAGAGT；

以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

以上所述的反应模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取小反刍兽疫病毒的RNA，或者疑似小反刍兽疫病毒感染的组织的RNA。

以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL40-50mM、KCL20-30mM、MgSO₄16-20mM、(NH₄)₂SO₄20-25mM、Tween200.2-0.5%、Betaine1.6-3.2M和dNTPs2.8-4mM，其配制方法在pH为8.8条件下，将上述溶剂混合均匀获得。

一种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，主要用于检测兽医临床上疑似PPRV感染的病变组织是否存在PPRV，具体检测步骤包括：

（1）模板RNA模板的提取

（2）RT-LAMP检测。

所述的逆转录环介导等温扩增试剂盒反应体系建立以25μL计，

2×反应缓冲液12.5μL

酶混合物EM1μL

FIP40pmol

BIP40pmol

LF20pmol

LB20pmol

F35pmol

B35pmol

模板5μL

超纯水补足25μL。

以上所述的逆转录环介导等温扩增试剂盒检测过程采用实时浊度仪LA-320C进行密闭全程监控，反应程序为63℃反应60分钟，80℃灭活5分钟。

本发明的实质性特点和显著的进步是：

1）特异性强

本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测出小反刍兽疫（PPRV），所检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出来，与RT-PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器，对操作人员的技术水平要求较低。

2）灵敏度高

普通的RT-PCR检测方法的灵敏度为9.8×10^-3ng/μL，而使用本发明的RT-LAMP检测方法，检测限约为9.8×10^-4ng/μL，是普通RT-PCR的10倍。

3）耗时少

普通RT-PCR法需先进行反转录（RT），然后再以RT产物为模板进行PCR反应，使用了两个反应程序，扩增结束后得通过凝胶电泳的方法进行结果判定，整个过程在24小时左右才能得出结果；而本发明的RT-LAMP方法可在一个反应管内同时完成两个反应程序，在20-30分钟间出现扩增，一个小时内即可完成扩增，从病毒RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成，特别是在于批量检测，优势更明显。

4）结果判读简便

本发明的RT-LAMP方法在扩增结束即可判读结果，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像或者开盖加入荧光染料进行来判读结果。

5）不造成污染

目前虽然已经建立有RT-LAMP显色法用于检测小反刍兽疫病毒，但显色法只能是反应结束后开盖加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，或者通过跑电泳的方法进行结果判定，开盖检测容易造成气溶胶产物污染实验室。而本发明的RT-LAMP荧光目视检测方法，荧光染料是在反应前加入，避免开盖造成污染。此外，本发明的RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。

5）可实时定量

本发明利用LA-320C浊度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的小反刍兽疫病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。

附图说明

图1是本发明RT-LAMP检测方法特异性检测结果；其中：1：小反刍兽疫病毒；2：口蹄疫病毒；3：蓝舌病病毒；4：犬瘟热病毒；5：牛病毒性腹泻病毒；6：牛冠状病毒；7：细小病毒；8：传染性胃肠炎病毒；9：水对照。特异性检测结果显示，只有小反刍兽疫病毒反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增。

图2和图3是本发明RT-LAMP检测及普通RT-PCR检测的敏感性检测结果；其中1：9.8×10⁰ng/μL；2：9.8×10^-1ng/μL；3：9.8×10^-2ng/μL；4：9.8×10^-3ng/μL；5：9.8×10^-4ng/μL；6：9.8×10^-5ng/μL；7：9.8×10^-6ng/μL；8：9.8×10^-7ng/μL；9：9.8×10^-8ng/μL；10：water。PPRV原始RNA的起始浓度为9.8×10⁰ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和RT-PCR扩增，结果显示RT-LAMP法检测限约为9.8×10^-4ng/μL，而RT-PCR法检测限为9.8×10^-3ng/μL。

图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为PPRVRNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。

图5是本发明定量检测PPRV的标准曲线；利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的小反刍兽疫病毒拷贝数。

具体实施方式

实施例1RT-LAMP检测

1、材料的准备

小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、犬瘟热病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、细小病毒、传染性胃肠炎病毒，为市售疫苗或为广西兽医研究所保存。酶混合物EM、荧光目视试剂购自北京蓝谱生物科技有限公司，病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

2、RT-LAMP引物的设计与合成

根据GenBank中的小反刍兽疫病毒N基因序列，利引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，LF和LB为环引物，其中F3、B3为小反刍兽疫病毒RT-PCR检测引物，扩增的目的片段大小约为230bp，其中

F3GACCAGAGAAGGGGTCAAAG

B3CTGCAGCCTGAAGAGTGC

FIPTCTCTCCTCTGGGCCTTCCTGCTGCGATCCCAAACGGAG

BIPGCCAACTGCTCCTGGACATCATTGAGCCTCACGAGGGTT

LFGTGTTTGCTTTCTGTCCCTTTCTTC

LBAGAGGATGAGATCTTGCGAGAGT；

3、病毒DNA/RNA提取

使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取试验毒株的DNA/RNA，以及疑似小反刍兽疫病毒感染引起病变组织的DNA/RNA。

4、RT-LAMP反应体系建立

按25μL体系配置：

2×反应缓冲液12.5μL

酶混合物EM1μL

FIP40pmol

BIP40pmol

LF20pmol

LB20pmol

F35pmol

B35pmol

模板5μL

超纯水补足25μL。

RT-LAMP反应在实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)密闭进行，反应程序为63℃恒温反应60分钟，80℃灭活5分钟。在整个反应过程，浊度仪实时监控扩增情况。

由于样品浓度的负对数与样品扩增浊度值达到0.1所需的时间呈线性关系，因此可绘制标准曲线，通过获得未知样品达到0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

5、RT-LAMP检测方法

1）特异性检测

以提取的试验毒株的基因组DNA/RNA进行RT-LAMP扩增，同时以水作为空白对照，检验RT-LAMP方法的特异性。

2）敏感性检测

以提取的小反刍兽疫病毒的RNA为原始反应模板，测定其浓度，为9.8×10⁰ng/μL，用RNA-FreeWater连续10倍倍比稀释成8个稀释度，以各RNA稀释度作为模板，进行RT-LAMP扩增和普通RT-PCR扩增，对比两种检测方法的敏感性。

3）荧光可视化检测

根据浊度仪监控优化的条件，反应前加入荧光染料，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应60分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳造成扩增产物气溶胶污染。

实施例2RT-LAMP检测方法的特异性结果

对1株小反刍兽疫病毒、7株对照病毒毒株和水对照进行RT-LAMP扩增，结果如图1所示，小反刍兽疫病毒反应管在28分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照毒株反应管和水对照反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。

实施例3RT-LAMP检测方法的敏感性结果

小反刍兽疫病毒原始RNA的起始浓度为9.8×10⁰ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，同时进行RT-LAMP和RT-PCR扩增，结果如图2和图3所示，结果显示RT-LAMP法检测限约为9.8×10^-4ng/μL，而RT-PCR法检测限为9.8×10^-3ng/μL。

实施例4RT-LAMP检测方法的荧光可视化检测结果

根据浊度仪监控优化的条件，反应管加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为以小反刍兽疫病毒RNA为模板的反应情况，为阳性结果，第3和右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果，表明本发明建立的RT-LAMP方法可以方便基层使用，提取RNA作为反应模板，使用试剂盒的组分，按建立的反应体系配液，用廉价的水浴锅来保持63℃60分钟，即可快速获取结果，且无需开盖，避免了污染。

实施例5定量小反刍兽疫病毒RT-LAMP方法标准曲线的绘制

设置对照：浓度为9.8×10⁰ng/μL、9.8×10^-1ng/μL、9.8×10^-2ng/μL、9.8×10^-3ng/μL和9.8×10^-4ng/μL的小反刍兽疫病毒RNA样品各一个，因为样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=0.3188x-9.5142，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R²为0.9978，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于0.0498，则浓度为10^-0.0498，再乘以基数9.8，即为该试验样品的浓度9.8×10^-0.0498ng/μL，从而达到定量的效果。

表1

时间（min）	29.9	33.2	35.8	39.1	42.6
						标准值（-LOG）	0	1	2	3	4

<110>广西壮族自治区兽医研究所

<120>一种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

GACCAGAGAAGGGGTCAAAG

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

CTGCAGCCTGAAGAGTGC

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TCTCTCCTCTGGGCCTTCCTGCTGCGATCCCAAACGGAG

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

GCCAACTGCTCCTGGACATCATTGAGCCTCACGAGGGTT

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

GTGTTTGCTTTCTGTCCCTTTCTTC

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

AGAGGATGAGATCTTGCGAGAGT

Claims (6)

1.一种检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、酶混合物EM、荧光目视检测试剂、超纯水和反应模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQIDNO：1）与B3（SEQIDNO：2）、内引物FIP（SEQIDNO：3）与BIP（SEQIDNO：4）和环引物LF（SEQIDNO：5）与LB（SEQIDNO：6）；

其中引物的序列分别为：

F3GACCAGAGAAGGGGTCAAAG

B3CTGCAGCCTGAAGAGTGC

FIPTCTCTCCTCTGGGCCTTCCTGCTGCGATCCCAAACGGAG

BIPGCCAACTGCTCCTGGACATCATTGAGCCTCACGAGGGTT

LFGTGTTTGCTTTCTGTCCCTTTCTTC

LBAGAGGATGAGATCTTGCGAGAGT；

所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、Betaine和dNTPs。

2.根据权利要求1所述的检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的反应模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取小反刍兽疫病毒的RNA，或者疑似小反刍兽疫病毒感染的组织的RNA。

3.根据权利要求1所述的检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。

4.根据权利要求1所述的检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL40-50mM、KCL20-30mM、MgSO₄16-20mM、(NH₄)₂SO₄20-25mM、Tween200.2-0.5%、Betaine1.6-3.2M和dNTPs2.8-4mM。

5.根据权利要求1所述的检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的逆转录环介导等温扩增试剂盒反应体系建立以25μL计，

2×反应缓冲液12.5μL

酶混合物EM1μL

FIP40pmol

BIP40pmol

LF20pmol

LB20pmol

F35pmol

B35pmol

反应模板5μL

超纯水补足25μL。

6.根据权利要求1所述的检测小反刍兽疫病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的逆转录环介导等温扩增试剂盒检测过程采用实时浊度仪LA-320C进行密闭全程监控，反应程序为63℃反应60分钟，80℃灭活5分钟。