CN104651535A - 一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用 - Google Patents

一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用 Download PDF

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李军
潘艳
彭昊
杨威
胡帅
陈泽祥
钟舒红
谢宇舟
禤雄标
马春霞
柳锋
陶立
许力干
谢永平
韦志锋
秦若甫
兰美益
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Abstract

本发明公开了一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪瘟病毒RNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF。特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测证实，本发明提供的RT-LAMP检测方法特异性检测出猪瘟病毒，可实时监测反应并且定量检测出猪瘟病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪瘟病毒带来便利。

Description

一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
技术领域
 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定量检测猪瘟病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用。
背景技术
猪瘟(Swine fever，Hog cholera) 又名猪霍乱(HogCholera，HC)，我国俗称烂肠瘟。欧洲为了区别于非洲猪瘟称其为古典猪瘟(Classical swine fever，CSF)。其病原是猪瘟病毒(Hog cholera virus，HCV 或Classical swine fever virus，CSFV)，该病是猪的一种接触性烈性传染病，临床以稽留高烧，皮肤和粘膜出现大量出血点为特征。猪瘟被世界动物卫生组织(OIE)列入A类疫病名录，为须申报的动物传染病，我国也将其列为一类动物传染病。该病于1833 年首先发现于美国的俄亥俄州，全世界大多数养猪国家都存在， 给养猪业带来了巨大的经济损失。尽管世界各养猪大国对猪瘟病毒给予了足够的重视，但是由于参差不齐的疫苗质量，不合理的免疫程序以及野猪群中携带的猪瘟病毒等因素， 致使猪瘟目前仍是威胁各国养猪业的一个极重要的传染病，常常突然爆发，造成巨大的经济损失。每年用于预防接种、治疗、扑杀的费用数以亿计，我国也是一个受猪瘟危害较为严重的国家。据统计，近几年来，因各种疾病死亡的牲猪占饲养总数（1998 年达8亿头）的8％～10％，其中约1/3 由猪瘟致死，每年的经济损失在10 亿元左右。因其影响畜产品的贸易所造成的间接损失更是不可估量。因此长期以来，猪瘟一直是兽医疫病研究的重点和热点之一。
猪瘟是危害我国猪生产的重要疫病，对猪瘟密切监测和快速诊断，有利于该病的防治。目前，猪瘟病毒的检测技术主要有常规方法和分子生物学方法。常规方法是病毒的分离鉴定，其结果准确可靠，但常规鉴定方法存在操作复杂，需要复杂的仪器设备，所需时间长的缺点，不利于猪瘟的快速诊断。分子生物学的方法是通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测猪瘟病毒的特异性基因，虽然RT-PCR方法较常规方法快速准确，但需要设计特异性强的引物和昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种为基层快速、准确并且实时检测猪瘟病毒的方法，提供一种快速、可视化并且可实时定量检测猪瘟病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案为：
一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪瘟病毒RNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）；
其中引物的序列分别为：
F3   CATGCCCAAGACACACCTTA
B3  CGTGGCATCGTATACCGG
FIP  CCTCTGCAGCACCCTATCAGGGGTCGCTAGGGTGAAATCAC
BIP  TGCTGTACATGGCACATGGAGTTCCTCCACTCCCATTGGTT
LF CGTACTCCCATCACGTGGT；
所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
以上所述的猪瘟病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪瘟病毒RNA。
以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
以上所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 35-50mM、KCL 15-35mM、MgSO4 15-20mM、(NH4)2SO4 15-25mM、Tween20 0.4-0.8℅、Betaine 1.5-3.0M 和dNTPs 2.5-4 mM，其配制方法在pH为8.7条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测猪瘟病毒以及疑似猪瘟病变组织是否感染猪瘟病毒，具体检测步骤包括：
（1）RT-LAMP引物的设计与合成
（2）猪瘟病毒RNA模板的提取
（3）RT-LAMP反应体系建立
（4）RT-LAMP检测方法。
以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25μl计，
2×反应缓冲液                      12.5 μL
EM                               1 μL
FIP                               40 pmol
BIP                               40 pmol
LF                                25 pmol
F3                                5 pmol
B3                              5 pmol
猪瘟病毒RNA                    5 μL
超纯水                           补足25 μL。
以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
以上所述的RT-LAMP检测方法采用Loopamp LA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应温度为63℃、反应在15-25分钟间出现扩增。
本发明的实质性特点和显著的进步是：
1）特异性强
本发明的RT-LAMP检测方法特异性检测出猪瘟病毒，而所检测的阴性对照病毒、阴性对照细菌和水对照均无阳性结果出来，与RT-PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器，普通RT-PCR法需先进行反转录（RT），然后再以RT产物为模板进行PCR反应，使用了两个反应程序，而RT-LAMP方法可在一个反应管内同时完成两个反应程序，一个小时即可完成扩增。
2）灵敏度高
提取的猪瘟病毒RNA原始浓度为0.8 ng/μL，北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产销售猪瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒的检测限约为0.8×10-2 ng/μL，而使用本发明检测方法，检测限约为0.8×10-3 ng/μL，敏感性是瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒提供的RT-PCR方法的10倍。
3）迅速获得结果
普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组DNA/RNA提取到获取试验结果，需要5-6小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在20分钟左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便-依据反应管浊度值的变化情况即可判读结果，扩增反应结束即可获得试验结果，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线显像分析或者反应结束后加入荧光染料来判读结果，从病毒基因组DNA/RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
4）不造成污染
目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反应前加入的钙黄绿素商用染料（非syber-green），检测过程不需要开盖，能有效避免实验环境的污染。此外，本发明的RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
5）可实时定量
本发明利用Tubidimeter real-time LA-320C 浊度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果，不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪瘟病毒（CSFV）拷贝数，达到定量检测产物的目的。
附图说明
图1是本发明RT-LAMP方法特异性检测结果；其中1：猪瘟病毒兔化弱毒株；2：猪瘟病毒石门株； 3：猪瘟病毒野毒梧州株；4：猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒；5：口蹄疫病毒；6：伪狂犬病毒；7：传染性胃肠炎病毒；8：流行性腹泻病毒；9：细小病毒；10：圆环病毒2型；11：大肠杆菌O157:H7；12：2型链球菌；13：副猪嗜血杆菌；14：沙门氏菌；15：隐秘杆菌；16：水对照。3株猪瘟病毒反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管、5 株对照细菌反应管和水对照反应管均无扩增。
图2是使用本发明RT-LAMP方法进行的猪瘟病毒敏感性检测结果，图3是使用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产销售的猪瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒（货号：CSF20140814P）进行的猪瘟病毒敏感性检测结果，其中1：0.8ng/μL； 2：0.8×10-1 ng/μL；3：0.8×10-2 ng/μL；4：0.8×10-3 ng/μL；5：0.8×10-4 ng/μL；6：0.8×10-5 ng/μL；7：0.8×10-6 ng/μL；8：0.8×10-7 ng/μL；猪瘟病毒原始RNA的起始浓度为0.8ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和RT-PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为0.8×10-3ng/μL，而猪瘟病毒通用型RT-PCR检测试剂盒检测限约为0.8×10-2ng/μL。
图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪瘟病毒基因组RNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
图5是本发明定量检测猪瘟病毒的标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪瘟病毒拷贝数。
具体实施方式
1、材料的准备
猪瘟病毒（CSFV）包括（猪瘟兔化弱毒株、猪瘟病毒野毒石门株、猪瘟病毒野毒梧州株），对照毒株包括猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、细小病毒、猪圆环病毒2型，对照细菌包括大肠杆菌、2型链球菌、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌、隐秘杆菌，为市售疫苗毒株，或为广西兽医研究所分离鉴定和保存。LAMP法RNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号SLP246，病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。
2 、RT-LAMP引物的设计与合成
根据GenBank 中的猪瘟病毒编码N蛋白的基因序列，利用RT-LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4 软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B3 为外引物，FIP、BIP 为内引物，LF为环引物，其中 F3、B3为猪瘟病毒RT-PCR检测引物，其中
F3  CATGCCCAAGACACACCTTA
B3 CGTGGCATCGTATACCGG
FIP        CCTCTGCAGCACCCTATCAGGGGTCGCTAGGGTGAAATCAC
BIP TGCTGTACATGGCACATGGAGTTCCTCCACTCCCATTGGTT
LF CGTACTCCCATCACGTGGT
3、病毒DNA/RNA提取或细菌基因组DNA提取
使用康为世纪生物科技有限公司生产的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，提取猪瘟病毒RNA以及对照病毒毒株的病毒基因组DNA/RNA，或者疑似猪瘟病变组织的RNA，使用细菌基因组提取试剂盒（北京康为试剂，货号CW0552）提取对照菌株的基因组DNA。
4、RT-LAMP反应体系建立
按照试剂盒说明书，按25μl体系配置：
2×反应缓冲液                             12.5 μL
EM                                        1 μL
FIP                                         40 pmol
BIP                                         40 pmol
LF                                          25 pmol
F3                                          5 pmol
B3                                          5 pmol
猪瘟病毒RNA                                5 μL
超纯水                                     补足25 μL。
RT-LAMP反应在以实时浊度仪( LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控的形式监测本方法的检出情况，浊度仪实时监控扩增情况，可绘制标准曲线，通过获得未知样品达到0.1浊度值对应的时间值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数，反应温度以63℃做为反应温度。
5、RT-LAMP检测方法
1）特异性检测
使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒分别提取猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病毒、传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒、细小病毒、圆环病毒2型的基因组DNA/RNA。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取大肠杆菌、链球菌2型、副猪嗜血杆菌、沙门氏菌和隐秘杆菌的基因组DNA，作为RT-LAMP反应的模板，同时进行各毒株和菌株的RT-LAMP扩增，同时以水作为空白对照，检验RT-LAMP方法的特异性。
2）敏感性检测
用北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产销售的猪瘟诊断试剂盒提取猪瘟病毒的RNA，测定其浓度，用RNA-Free Water连续10倍倍比稀释成8个稀释度，以各RNA稀释度作为模板，同时进行RT-LAMP扩增和RT-PCR扩增，其中检测RT-PCR扩增所需的试剂及运行条件由该检测试剂盒提供，对比本发明的RT-LAMP方法和该检测试剂盒提供的RT-PCR方法对检测猪瘟病毒的敏感性。
3）荧光可视化检测
根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应60分钟后，在紫外灯下观察，不采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，避免开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染实验室。
实施例1 RT-LAMP检测方法的特异性结果
对3株猪瘟病毒、7株对照病毒毒株、5 株对照细菌和水对照进行RT-LAMP扩增，结果如图1所示，猪瘟病毒反应管在20 分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照毒株反应管、5 株对照细菌反应管和水对照反应管曲线均无扩增情况出现，为阴性结果。
实施例2 RT-LAMP检测方法的敏感性结果
猪瘟病毒原始RNA的起始浓度为0.8ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行RT-LAMP和RT-PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为0.8×10-3ng/μL，而RT-PCR 法（北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）检测限为0.8×10-2ng/μL。
实施例3 RT-LAMP检测方法的荧光可视化检测结果
根据浊度仪监控优化的条件，反应前加入荧光染料，63℃反应60分钟后，在紫外灯下观察，图4为观察结果，左管为以猪瘟病毒为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照，为阴性结果。试验结果表明，本发明建立的RT-LAMP方法可以方便基层使用，只需使用试剂盒配合本方法设计的RT-LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来保持63℃ 60分钟，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。
实施例4 RT-LAMP检测猪瘟病毒定量标准曲线的绘制
以猪瘟病毒RNA为模板，以本RT-LAMP方法设计的外引物F3和B3为RT-PCR扩增引物，将RT-PCR扩增得到的目的基因片段连接于载体pMD18-T，转化大肠杆菌感受细胞DH5a，氨苄西林抗性筛选获得单克隆菌，提取重组的质粒DNA，经测序确认后，测定重组质粒的起始浓度，用RNA-Free Water进行连续10倍倍比稀释，各稀释度溶液作为标准样品，进行RT-LAMP扩增。
设置对照：浓度为2.05×101 ng/μL、2.05×100 ng/μL、2.05×10-1 ng/μL、2.05×10-2 ng/μL、2.05×10-3ng/μL、2.05×10-4 ng/μL和2.05×10-5 ng/μL的重组质粒标准样品各一个，因为标准样品浓度的负对数值与其扩增浊度值为0.1的时间值成线性关系，所以可以将浊度仪捕捉到的值与时间（如表1）做成标准曲线，获得标准曲线方程，y=0.4391x-8.2696，如图5所示。从标准曲线方程来看相关系数R2为0.9975，呈良好的线性关系。以时间为X值，可求出Y值即浓度的负次方数，则浓度为10-y，再乘以基数2.05，即为2.05 x10-y ng/μL。依据拷贝数换算公式copies/μL=（6.02 x 1023 x (ng/ul x 10-9)） / (DNA length x 660)，DNA length为载体序列大小加上目的基因序列大小，为2693+220=2913 bp，将其换算成拷贝数（copies/μL）：6.02 x 1023 x（2.05 x10-y x 10-9）/ (2913 x 660)，简化为：6.41 x 108 x10-y。如某试验样品达到浊度值为0.1的时间为30分钟时，带入所建立的标准曲线方程，求出Y等于4.9，则浓度为10-4.9，再乘以基数2.05，即为该样品的浓度2.05×10-4.9ng/μL，拷贝数为6.41 x 108 x10-4.9，即为6.41 x 103.1 copies/μL，从而达到定量的效果。
表1
时间（min） 16.8 19 20.8 23.1 25.7 27.8 30.5
标准值（-LOG） -1 0 1 2 3 4 5

Claims (8)

1.一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪瘟病毒RNA模板，所述的RT-LAMP引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）；
其中引物的序列分别为：
F3  CATGCCCAAGACACACCTTA
B3  CGTGGCATCGTATACCGG
FIP  CCTCTGCAGCACCCTATCAGGGGTCGCTAGGGTGAAATCAC
BIP  TGCTGTACATGGCACATGGAGTTCCTCCACTCCCATTGGTT
LF CGTACTCCCATCACGTGGT；
所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgSO4、(NH4)2SO4、Tween20、Betaine和dNTPs。
2.根据权利要求1所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的猪瘟病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪瘟病毒RNA。
3.根据权利要求1所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
4.根据权利要求1所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液包括Tris-HCL 35-50mM、KCL 15-35mM、MgSO4 15-20mM、(NH4)2SO4 15-25mM、Tween20 0.4-0.8℅、Betaine 1.5-3.0M 和dNTPs 2.5-4 mM。
5.一种猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，用于检测猪瘟病毒以及疑似猪瘟病变组织是否感染猪瘟病毒，具体检测步骤包括：
（1）RT-LAMP引物的设计与合成
（2）猪瘟病毒RNA模板的提取
（3）RT-LAMP反应体系建立
（4）RT-LAMP检测方法。
6.根据权利要求5所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP反应体系建立以25μl计，
2×反应缓冲液                      12.5 μL
EM                               1 μL
FIP                               40 pmol
BIP                               40 pmol
LF                                25 pmol
F3                                5 pmol
B3                              5 pmol
猪瘟病毒RNA                     5 μL
超纯水                           补足25 μL。
7.根据权利要求5所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
8.根据权利要求5所述的猪瘟病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，其特征在于，所述的RT-LAMP检测方法采用实时浊度仪进行密闭全程监控。
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