CN103014174B - 猪支原体肺炎pcr诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒,它包括0.1moL/LPBS，裂解液，DL2000，PCR酶，超纯水，引物，阳性对照及阴性对照；其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物的序列为5’-TAGACCAGGATGGACAAGATGAT-3’，下游引物的序列为5’-AACCACAGGACTAAGACGCAACA-3’。本发明根据GenBank中的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌猪肺炎支原体ompA基因序列，设计了一对引物，通过对PCR反应条件进行优化，研制了检测猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒。经过上述的实验结果表明本发明的试剂盒具有快捷、灵敏、准确、重复性好、保质期长等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒。
背景技术
猪支原体肺炎（Mycoplasma hyopneumoniae of swine，MPS）又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp） 引起猪的一种高发病率、低死亡率的慢性呼吸道传染病（Straw B E等，1999）。该病在世界上广泛流行和存在，其典型症状是病猪咳嗽、呼吸困难和气喘，主要病变特征是融合性支气管肺炎，在肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈“肉样”或“虾肉样”实变。本病仅发生于猪，不同品种、年龄和性别的猪均能感染，其中以哺乳猪和幼猪最易感，发病率和死亡率较高。支原体感染后会出现免疫抑制，且容易继发感染其他传染病，因而对养猪业造成较为严重的经济损失（杨建德等，2002）。Mhp的检测通常是基于病原的分离或免疫荧光实验。近几年，对于Mhp的分离，血清学鉴定和血清抗体监测已发展了许多方法，这些方法尽管在理论上可以广泛应用，但仅有少数条件好的实验室才能做到，因此，一些非特异性方法仍然是有用的。
发明内容
本发明的目的是：提供一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，它能快速的检测出猪肺炎支原体，并且具有特异、灵敏、准确的特点，为猪支原体肺炎的防制提供科学依据。
本发明是这样实现的：猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒, 它包括浓度为0.1moL/L的PBS40uL，裂解液250uL，DL2000100uL，PCR酶250uL，超纯水170uL，引物40uL，阳性对照20uL及阴性对照20uL；其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物及下游引物各20 uL，上游引物的序列为5’- TAGACCAGGATGGACAAGATGAT -3’，下游引物的序列为5’- AACCACAGGACTAAGACGCAACA -3’。
阴性对照为超纯水，共计20 uL。
阳性对照为重组pMD18-T-ompA质粒，共计20uL。
缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液, 共计40uL。
PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2以及0.05U的Poymerase/Ul,共计250uL。
裂解液由Tris-HcL50mM、EDTA2mM、NaCl100mM以及占裂解液总体积5%的SDS组成的混合溶液，250uL。
为了验证本发明的效果进行了如下实验：
1 材料与方法
1.1 菌株猪肺炎支原体标准株P216购自中国兽医微生物保藏管理中心，猪肺炎支原体活疫苗168株购自南京天邦生物科技有限公司；猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、大肠杆菌、鸡肠炎沙门氏菌由贵州省畜禽疫病研究实验室保存。
主要试剂Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相应10×Taq Buffer、dNTP等购自宝生物（大连）工程有限公司；苯酚、氯仿、无水乙醇、支原体培养基为国产试剂。
引物设计根据猪肺炎支原体ompA基因序列设计1对特异性引物，由宝生物（大连）工程有限公司合成，上游引物:5’-TAGACCAGGATGGACAAGATGAT-3’，下游引物：5’-AACCACAGGACTAAGACGCAACA-3’。
试剂盒组成
(1)0.1moL/L PBS ；(2）裂解液；(3) DL2000；(4) PCR酶；(5) 超纯水；(6) 引物；(7) 阳性对照；(8)阴性对照
1.5 猪肺炎支原体核酸的抽提
(1) 取待检样品肺、淋巴结、扁桃体等组织样品共约50 mg，加入500 μL PBS缓冲液，待检样品研磨后－20℃反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于核酸的提取，用酚氯仿法提取猪肺炎支原体 DNA。
(2) 猪肺炎支原体标准株、猪肺炎支原体活疫苗168株、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、鸡肠炎沙门氏菌纯菌液，鼻拭子样品均用煮沸法提取DNA。
反应条件的优化
对PCR反应条件，包括退火温度（50℃、55℃、60℃），引物浓度（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L），Taq DNA polymerase浓度（0.5 U、1 U、2 U）进行优化，以确定最佳反应条件，同时以超纯水作为空白对照。PCR反应在25 μL反应体系中进行，10×Taq Buffer 5μL，dNTP mixture 4μL；Taq DNA polymerase 1μL，用超纯水补足至25 μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，退火温度（50℃、55℃、60℃）1 min，72℃ 1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min。取7μL PCR扩增产物于10 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
敏感性试验
将提取的猪肺炎支原体标准株核酸用蛋白质核酸仪测定浓度后，进行10倍比稀释后分别进行PCR反应，以确定建立的PCR诊断试剂盒的敏感性。
特异性试验
以猪肺炎支原体标准株、猪支原体肺炎活疫苗168株、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、鸡肠炎沙门氏菌进行PCR反应，以确定建立的PCR诊断试剂盒的特异性。
重复性试验
应用建立PCR方法，重复检测猪肺炎支原体 DNA样品3次以检验结果的可靠性。
试剂盒的保存期检测
将试剂盒保存在4℃、－20℃分别于3月、6月、1年，对阳性样品进行检测，以确定试剂盒的保存时间。
试剂盒对临床样品的检测
对2010～2012年贵州省贵阳市、黔南州、铜仁地区、瓮安县几个规模化养猪场和养猪专业户采集的58份病料进行检测。DNA核酸的抽提参照1.5，同时进行细菌学和生化检验。
结果
2.1 PCR产物的鉴定
猪肺炎支原体的PCR扩增片段经胶回收，送大连宝生物工程有限公司测序，结果表明，扩增片段分别为猪肺炎支原体的特异性条带。
反应条件的优化
PCR反应在25 μL反应体系中最佳反应条件为，退火温度55℃，Taq DNA polymerase1 U，引物浓度10 μmol/L用引物均有效扩增出了其目的片段，片段大小为500 bp，无非特异性片段产生，如图1所示。
敏感性试验
PCR反应中，猪肺炎支原体 DNA的最低检测量为0.25 ng/L，如图2所示。
特异性试验
以猪肺炎支原体标准株、猪肺炎支原体活疫苗168株、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、鸡肠炎沙门氏菌进行PCR反应，以确定建立的PCR诊断试剂盒的特异性，结果猪肺炎支原体标准株、猪肺炎支原体活疫苗168株为阳性，大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、鸡肠炎沙门氏菌为阴性（见图3）。
重复性试验
应用建立的PCR方法，重复检测猪肺炎支原体 DNA样品3次，结果均一致。
试剂盒的保存期检测
将试剂盒保存在4℃、－20℃分别于1月、3月、6月、1年，对阳性样品进行检测，4℃保存1年条带较淡，－20℃保存1月、3月、6月、1年条带亮度无影响。
试剂盒对临床样品的检测
对2010年～2012年贵州省贵阳市、黔南州、铜仁地区、瓮安县几个规模化养猪场和养猪专业户采集的58份病料进行检测，同时进行细菌学和生化检验。共检测出25分阳性样品，且与细菌学和生化检验结果一致。
讨论
目前用于猪肺炎支原体的诊断方法很多，但市场上主要是以猪肺炎支原体抗体检测ELISA诊断试剂盒为主，PCR诊断试剂盒的敏感性、特异性、重复性、准确性未见报道。猪肺炎支原体对营养要求高，因而猪肺炎支原体的分离培养比较困难（程晓盈等，2006）。传统的诊断方法需结合临床症状和病理组织学病变、细菌的分离鉴定进行综合性诊断，才能得到准确可靠的诊断结果，耗时较长（贾荣莉等，2002）。于敏等（2003）根据国外发表Mhp 16SrRNA 基因设计了一对特异性引物, 扩增出一个大小为653bp的特异性片段对于PCR 的敏感性实验显示这对引物能够检测到1ng的DNA。刘茂军等（2009）根据猪肺炎支原体的P36基因设计1对引物，建立猪肺炎支原体PCR检测方法，并对该方法进行了特异性和敏感性试验，敏感性达到了0.426ng。同时研究者根据Mhp保守区域，设计1对特异引物和TaqMan探针，建立了可以对Mhp培养物定量的荧光定量PCR检测方法，灵敏度可达13 copy/L（王建波等，2009）。但该方法诊断的成本较高，目前县级的兽医实验室主要配备的是常规PCR仪，因此该方法不适合在县一级的兽防站推广应用。本发明根据GenBank中的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌猪肺炎支原体ompA基因序列，设计了一对引物，通过对PCR反应条件进行优化，研制了检测猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒。经过上述的实验结果表明本发明的试剂盒具有快捷、灵敏、准确、重复性好、保质期长等优点, 虽然诊断猪支原体肺炎不是研究者最终目的，通过诊断结果制定出合理的防治措施以达到净化猪支原体肺炎才是最终目的，但是利用本发明可用实现猪支原体肺炎的早期临床快速诊断，对猪支原体肺炎的预防和治疗具有重要的意义。
附图说明
附图1为本发明的Mhp PCR；
M：DL 2000；1：Mhp PCR产物（500 bp）；2：阴性对照；
附图2 本发明的敏感性试验结果；
M：DL 2000；1-7：10－1～10－7稀释的Mhp DNA PCR结果；
附图3为本发明的特异性试验结果；
M：DL 2000； 1：猪支原体肺炎标准株；2：猪支原体肺炎活疫苗168株；3：大肠杆菌； 4：猪胸膜肺炎放线杆菌； 5：副猪嗜杆菌； 6：鸡毒支原体；7：鸡肠炎沙门氏菌。
具体实施方式
本发明的实施例：猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒, 它包括浓度为0.1moL/L的PBS40uL，裂解液250uL，DL2000100uL，PCR酶250uL，超纯水170uL，引物40uL，阳性对照20uL及阴性对照20uL；其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物及下游引物各20 uL，上游引物的序列为5’- TAGACCAGGATGGACAAGATGAT -3’，下游引物的序列为5’- AACCACAGGACTAAGACGCAACA -3’ ；阴性对照为超纯水；阳性对照为重组pMD18-T-ompA质粒；缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液, 共计40uL；PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2以及0.05U的Poymerase/Ul；裂解液由Tris-HcL50mM、EDTA2mM、NaCl100mM以及占裂解液总体积5%的SDS组成的混合溶液。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 贵州省畜牧兽医研究所
<120> 一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒
<160> 2
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据GenBank中登录的猪肺炎支原体ompA基因序列，应用DNAStar软件设计, 以用于PCR扩增。
<400> 1
TAGAC CAGGA TGGAC AAGAT GAT 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据GenBank中登录的猪肺炎支原体ompA基因序列，应用DNAStar软件设计, 以用于PCR扩增。
<400> 2
AACCA CAGGA CTAAG ACGCA ACA 23
Claims (6)
1.一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒,其特征在于：它包括浓度为0.1moL/L的PBS40uL，裂解液250uL，DL2000100uL，PCR酶250uL，超纯水170uL，引物40uL，阳性对照20uL及阴性对照20uL；其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物及下游引物各20 uL，上游引物的序列为5’- TAGACCAGGATGGACAAGATGAT -3’，下游引物的序列为5’- AACCACAGGACTAAGACGCAACA -3’。
2.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于：阴性对照为超纯水，共计20 uL。
3.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于：阳性对照为重组pMD18-T-ompA质粒，共计20uL。
4.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于：缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液, 共计40uL。
5.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于：PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2以及0.05U的Poymerase/Ul,共计250uL。
6.根据权利要求1所述的猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，其特征在于：裂解液由Tris-HcL50mM、EDTA2mM、NaCl100mM以及占裂解液总体积5%的SDS组成的混合溶液，250uL。
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