CN105950719A - 支原体检测和去除方法 - Google Patents

支原体检测和去除方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105950719A
CN105950719A CN201610277895.2A CN201610277895A CN105950719A CN 105950719 A CN105950719 A CN 105950719A CN 201610277895 A CN201610277895 A CN 201610277895A CN 105950719 A CN105950719 A CN 105950719A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycoplasma
pcr reaction
reaction tube
tube
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610277895.2A
Other languages
English (en)
Inventor
周静
杨妍
刘迪慧
温韬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yuan Pei Biotech Inc Shanghai
Original Assignee
Yuan Pei Biotech Inc Shanghai
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yuan Pei Biotech Inc Shanghai filed Critical Yuan Pei Biotech Inc Shanghai
Priority to CN201610277895.2A priority Critical patent/CN105950719A/zh
Publication of CN105950719A publication Critical patent/CN105950719A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502746—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means for controlling flow resistance, e.g. flow controllers, baffles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域。支原体检测和去除方法，包括如下步骤：步骤一，取至少2个反应管，分别为阳性对照管、测试管，阳性对照管内加入阳性支原体DNA，测试管内加入测试培养液；步骤二，将反应管放至PCR反应仪内进行检测，如果测试结果为培养液中存有支原体，跳至步骤三；步骤三，使用支原体清除试剂对支原体进行去除。本发明通过设有2反应管，便于进行数据的比对，通过PCR反应仪进行测定，相较传统的培养法测试时间缩短了，提高了测试效率。

Description

支原体检测和去除方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及支原体的检测。
背景技术
哺乳动物细胞的培养，支原体(Mycoplasma)污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数，导致实验结果的不准确、甚至完全错误。从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
培养法是相对可靠的支原体检测技术，但是该方法非常耗时的，需要数周，不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外，通过固体培养法无法检测污染细胞的一种最常见的支原体，即猪鼻支原体(M.Hyorhinis)。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50％。
发明内容
本发明的目的在于提供支原体检测和去除方法，以解决上述技术问题。
本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：
支原体检测和去除方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，取至少2个反应管，分别为阳性对照管、测试管，阳性对照管内加入阳性支原体DNA，测试管内加入测试培养液；
步骤二，将反应管放至PCR反应仪内进行检测，如果测试结果为培养液中存有支原体，跳至步骤三；
步骤三，使用支原体清除试剂对支原体进行去除。
本发明通过设有2反应管，便于进行数据的比对，通过PCR反应仪进行测定，相较传统的培养法测试时间缩短了，提高了测试效率。
步骤一之前，反应管内放置有冻干粉剂，将冻干粉剂溶解；
所述冻干粉剂包括DNA聚合酶、支原体的特异性引物和去离子水；
步骤二中，通过反应管的变色情况判断测试培养液是否存有支原体。
所述冻干粉剂是PCR反应液。
所述冻干粉剂包括缓冲液，所述缓冲液包括200mM且pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁DTT、50mM溴酚蓝。
mM的单位即为mmol/L。
所述冻干粉剂包括磷酸缓冲盐溶液。当作缓冲液的同时，还可以用作裂解液。磷酸缓冲盐溶液pH为7.4。
测试管的颜色变化与阳性对照管的颜色变化一致，说明测试培养液内含有支原体；
测试管的颜色变化与阳性对照管的颜色变化不一致，说明测试培养液内含有支原体。
阳性对照管的颜色应呈蓝绿色。
所述PCR反应仪的反应时间为60分钟，反应温度为61℃。
DNA聚合酶包括Bst DNA聚合酶或者显色酶蛋白。
DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶时，缓冲液为200mM、pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁DTT、50mM溴酚蓝。
DNA聚合酶是显色酶蛋白时，缓冲液为200mM、pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mM的氯化钾、100mM的硫酸铵、20mM的硫酸镁DTT。
DNA聚合酶对温度非常敏感，只允许仪器显示温度与实际温度的温差不超过0.5℃。如果温差超过2℃，将导致酶活性大幅降低，进而扩增速度也大幅降低，阳性对照管可能无法呈现蓝绿色。
步骤三中，反应管内放入矿物油1～3ml后，将反应管放至PCR反应仪内进行检测。通过矿物油来代替PCR反应仪中热盖。
所述反应管设有一用于输入裂解液的第一进口，所述裂解液是用于破坏细菌的细胞膜使得细菌的DNA释放到溶液中的裂解液；
所述裂解液为浓度为0.1moL/L的PBS裂解液。
所述第一进口设有一水流传感器，所述水流传感器连接一微型处理器系统，所述微型处理器系统连接一电磁阀，所述电磁阀也位于所述第一进口，且所述水流传感器位于所述电磁阀的进口。
便于实现裂解液加入量的自动控制。
所述冻干粉剂还包括浓度为0.1moL/L的PBS裂解液。
所述冻干粉剂是将原材料充分搅拌均匀后冰冻成块状体，将块状体在0℃以下的环境下研磨成粉末。
便于存储于运输。
所述冻干粉剂还包括PH试剂。或者所述反应管上设有用于输入PH试剂的第三进口。
支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素0.5％～1％、瑞他帕林1％～1.5％、克拉霉素1.5％～2％、氢吡四环素1％～1.5％、氧氟沙星0.2％～0.5％、环丙沙星0.5％～0.8％、NaCl1％～1.5％，余量为去离子水。
支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素1％～1.5％、克拉霉素1.5％～2％、氢吡四环素1％～1.5％、肉桂醛氧氟沙星酰腙0.3％～0.5％、NaCl1％～1.5％，余量为去离子水。
支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素1％～1.5％、克拉霉素1.5％～2％、氢吡四环素1％～1.5％、肉桂醛氧氟沙星酰腙0.3％～0.5％、NaCl1％～1.5％，银杏叶粉0.1％～0.3％，余量为去离子水。
经试验，上述配方的支原体清除效果优异，且无毒性。
支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素1％、克拉霉素1.5％、氢吡四环素1.3％、肉桂醛氧氟沙星酰腙0.5％、NaCl1.5％，余量为去离子水。经试验，上述配方的支原体清除效果最佳。且无毒性。
所述PCR反应仪上设有一用于放置反应管的放置位，所述放置位的底部设有一重量传感器，所述重量传感器连接所述微型处理器系统。
当感应到有反应管放置到PCR反应仪上后，自动进行裂解液的进入。
所述反应管上设有用于输入支原体清除试剂的第二进口，所述第二进口设有一水流传感器，所述水流传感器连接一微型处理器系统，所述微型处理器系统连接一电磁阀，所述电磁阀也位于所述第二进口，且所述水流传感器位于所述电磁阀的进口。
便于实现裂支原体清除试剂加入量的自动控制。便于在加入支原体清除试剂的同时，计算支原体清除试剂的使用量。
所述PCR反应仪包括一温控模块、一电源驱动模块和一显示与接口模块，还包括一PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，
微流控芯片包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，所述上层基板和所述下层基板键合在一起，所述下层基板上设有一PCR反应通道，所述PCR反应通道的一端与所述反应管的出料口导通；
所述反应管的出料口位于所述反应管的下端部；
所述温控模块包括一用于改变PCR反应通道温度的半导体温控片、一用于测量PCR反应通道温度的温度传感器；
所述半导体温控片贴合在微流控芯片的双面，微流控芯片单面的数量设有至少两个，半导体温控片的排列方向平行于PCR反应通道的导流方向。
所述反应管的出料口设有一止回阀，防止溶液逆流。
所述出料口上设有一T型运动件，所述T型运动件与一弹簧的一端固定连接，所述弹簧的另一端与所述反应管的下端面固定连接，所述弹簧的弹性方向平行于所述T型运动件的运动方向；
所述T型运动件包括用于控制出料口水流通断的挡板，所述挡板为所述T型运动件的上端部；
所述放置位是一与所述出料口相匹配的插口，所述插口上设有导流槽，所述导流槽的正中央设有一突起，所述突起的中心线与所述弹簧的中心轴线处于同一直线上，所述导流槽的下端面设有与所述PCR反应通道导通的通孔。
本发明通过优化反应管的结构，从而实现将反应管放置于放置位上时，出料口与放置位上的导流槽的导通，反应管内的液体经出料口流至插口。当反应管放置与插口上时，插口上的突起带动T型运动件运动，T型运动件通过挡板控制出料口的水流导通至插口导流槽内的通孔。实现通过所述T型运动件控制所述第一出水口与所述插口上导流槽的导通情况。插口上的突起带动T型运动件运动的同时，弹簧伸长，当反应管移出时，弹簧收缩，实现回复。
或者，所述出料口上设有一T型运动件，所述T型运动件包括用于控制出料口水流通断的挡板，所述挡板为所述T型运动件的上端部；
所述挡板与一弹簧的一端固定连接，所述弹簧的另一端与所述反应管的下端面固定连接，所述弹簧的弹性方向平行于所述T型运动件的运动方向；
所述放置位是一与所述出料口相匹配的插口，所述插口上设有导流槽，所述导流槽的正中央设有第一磁铁，所述第一磁铁的中心线与所述插口的中心轴线处于同一直线上，所述T型运动件的下端面设有与所述磁铁磁性方向相同的第二磁铁；
所述导流槽的下端面设有与所述PCR反应通道导通的通孔。
本发明通过优化反应管的结构，从而实现将反应管放置于放置位上时，出料口与放置位上的导流槽的导通，反应管内的液体经出料口流至插口。当反应管放置与插口上时，插口上的第一磁铁驱动T型运动件运动，从而驱使弹簧运动，实现反应管移出时通过弹簧弹性实现出料口的闭合，防止漏液。T型运动件通过挡板控制出料口的水流导通至插口导流槽内的通孔。实现通过所述T型运动件控制所述第一出水口与所述插口上导流槽的导通情况。
所述PCR反应仪包括荧光检测模块，所述下层基板上设有CE分离通道；
所述荧光检测模块包括一激发光源，激发光源产生较窄光谱带宽的激发光，并照射CE分离通道上，激发含有荧光分子的DNA片段发出荧光；
所述PCR反应通道与所述CE分离通道存在至少一个交叉点，所述PCR反应通道和所述CE分离通道的端口处均设有一凹槽；
所述上层基板上与所述凹槽相对的地方开有用于填充试剂和安置电极的孔；
所述电源驱动模块包括一PCR驱动电源和一CE驱动电源，所述PCR驱动电源与两个分别放置在PCR反应通道的起始端和末端的电极相连接，所述CE驱动电源与两个分别放置在CE分离通道的起始端和末端的电极相连接。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示进一步阐述本发明。
参见图1，支原体检测和去除方法，包括如下步骤：步骤一，取至少2个反应管，分别为阳性对照管、测试管，阳性对照管内加入阳性支原体DNA，测试管内加入测试培养液；步骤二，将反应管放至PCR反应仪内进行检测，如果测试结果为培养液中存有支原体，跳至步骤三；步骤三，使用支原体清除试剂对支原体进行去除。本发明通过设有2反应管，便于进行数据的比对，通过PCR反应仪进行测定，相较传统的培养法测试时间缩短了，提高了测试效率。
步骤一之前，反应管内放置有冻干粉剂，将冻干粉剂溶解；冻干粉剂包括DNA聚合酶、支原体的特异性引物和去离子水；步骤二中，通过反应管的变色情况判断测试培养液是否存有支原体。测试管的颜色变化与阳性对照管的颜色变化一致，说明测试培养液内含有支原体；测试管的颜色变化与阳性对照管的颜色变化不一致，说明测试培养液内含有支原体。阳性对照管的颜色应呈蓝绿色。冻干粉剂包括20nMDNA聚合酶、200nM支原体的特异性引物，余量为去离子水。上游引物及下游引物的量相等。
支原体的特异性引物包括上游引物及下游引物，上游引物及下游引物各20uL，上游引物的序列为5’-TAGACCAGGATGGACAAGATGAT-3’，下游引物的序列为5’-AACCACAGGACTAAGACGCAACA-3’。支原体的特异性引物包括包括两条内引物(FIP和BIP)和两条外引物(F3和B3)，其核酸序列如下：
F3：5’-TCTTACCACTGTTAACGGCC-3’；
B3：5’-CCGCTTTGGTCAACACATCA-3’；
FIP：5’-ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3’；
BIP：5’-AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3’。
DNA聚合酶包括Bst DNA聚合酶或者显色酶蛋白。
PCR反应仪的反应时间为60分钟，反应温度为61℃。DNA聚合酶对温度非常敏感，只允许仪器显示温度与实际温度的温差不超过0.5℃。如果温差超过2℃，将导致酶活性大幅降低，进而扩增速度也大幅降低，阳性对照管可能无法呈现蓝绿色。
步骤三中，反应管内放入矿物油1～3ml后，将反应管放至PCR反应仪内进行检测。通过矿物油来代替PCR反应仪中热盖。DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶。
反应管设有一用于输入裂解液的第一进口，裂解液是用于破坏细菌的细胞膜使得细菌的DNA释放到溶液中的裂解液；裂解液为浓度为0.1moL/L的PBS裂解液；第一进口设有一水流传感器，水流传感器连接一微型处理器系统，微型处理器系统连接一电磁阀，电磁阀也位于第一进口，且水流传感器位于电磁阀的进口。便于实现裂解液加入量的自动控制。
冻干粉剂还包括浓度为0.1moL/L的PBS裂解液。冻干粉剂是将原材料充分搅拌均匀后冰冻成块状体，将块状体在0℃以下的环境下研磨成粉末。便于存储于运输。
支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素0.5％～1％、瑞他帕林1％～1.5％、克拉霉素1.5％～2％、氢吡四环素1％～1.5％、氧氟沙星0.2％～0.5％、环丙沙星0.5％～0.8％、NaCl1％～1.5％，余量为去离子水。支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素1％～1.5％、克拉霉素1.5％～2％、氢吡四环素1％～1.5％、肉桂醛氧氟沙星酰腙0.3％～0.5％、NaCl1％～1.5％，余量为去离子水。支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素1％、克拉霉素1.5％、氢吡四环素1.3％、肉桂醛氧氟沙星酰腙0.5％、NaCl1.5％，余量为去离子水。经试验，上述配方的支原体清除效果最佳。
PCR反应仪上设有一用于放置反应管的放置位，放置位的底部设有一重量传感器，重量传感器连接微型处理器系统。当感应到有反应管放置到PCR反应仪上后，自动进行裂解液的进入。
反应管上设有用于输入支原体清除试剂的第二进口，第二进口设有一水流传感器，水流传感器连接一微型处理器系统，微型处理器系统连接一电磁阀，电磁阀也位于第二进口，且水流传感器位于电磁阀的进口。便于实现裂支原体清除试剂加入量的自动控制。便于在加入支原体清除试剂的同时，计算支原体清除试剂的使用量。
PCR反应仪包括一温控模块、一电源驱动模块和一显示与接口模块，还包括一PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，微流控芯片包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，上层基板和下层基板键合在一起，下层基板上设有一PCR反应通道，PCR反应通道的一端与反应管的出料口导通；反应管的出料口位于反应管的下端部；温控模块包括一用于改变PCR反应通道温度的半导体温控片、一用于测量PCR反应通道温度的温度传感器；半导体温控片贴合在微流控芯片的双面，微流控芯片单面的数量设有至少两个，半导体温控片的排列方向平行于PCR反应通道的导流方向。
反应管的出料口设有一止回阀，防止溶液逆流。
出料口上设有一T型运动件，T型运动件与一弹簧的一端固定连接，弹簧的另一端与反应管的下端面固定连接，弹簧的弹性方向平行于T型运动件的运动方向；T型运动件包括用于控制出料口水流通断的挡板，挡板为T型运动件的上端部；放置位是一与出料口相匹配的插口，插口上设有导流槽，导流槽的正中央设有一突起，突起的中心线与弹簧的中心轴线处于同一直线上，导流槽的下端面设有与PCR反应通道导通的通孔。本发明通过优化反应管的结构，从而实现将反应管放置于放置位上时，出料口与放置位上的导流槽的导通，反应管内的液体经出料口流至插口。当反应管放置与插口上时，插口上的突起带动T型运动件运动，T型运动件通过挡板控制出料口的水流导通至插口导流槽内的通孔。实现通过T型运动件控制第一出水口与插口上导流槽的导通情况。插口上的突起带动T型运动件运动的同时，弹簧伸长，当反应管移出时，弹簧收缩，实现回复。
或者，出料口上设有一T型运动件，T型运动件包括用于控制出料口水流通断的挡板，挡板为T型运动件的上端部；挡板与一弹簧的一端固定连接，弹簧的另一端与反应管的下端面固定连接，弹簧的弹性方向平行于T型运动件的运动方向；放置位是一与出料口相匹配的插口，插口上设有导流槽，导流槽的正中央设有第一磁铁，第一磁铁的中心线与插口的中心轴线处于同一直线上，T型运动件的下端面设有与磁铁磁性方向相同的第二磁铁；导流槽的下端面设有与PCR反应通道导通的通孔。本发明通过优化反应管的结构，从而实现将反应管放置于放置位上时，出料口与放置位上的导流槽的导通，反应管内的液体经出料口流至插口。当反应管放置与插口上时，插口上的第一磁铁驱动T型运动件运动，从而驱使弹簧运动，实现反应管移出时通过弹簧弹性实现出料口的闭合，防止漏液。T型运动件通过挡板控制出料口的水流导通至插口导流槽内的通孔。实现通过T型运动件控制第一出水口与插口上导流槽的导通情况。
PCR反应仪包括荧光检测模块，下层基板上设有CE分离通道；荧光检测模块包括一激发光源，激发光源产生较窄光谱带宽的激发光，并照射CE分离通道上，激发含有荧光分子的DNA片段发出荧光；PCR反应通道与CE分离通道存在至少一个交叉点，PCR反应通道和CE分离通道的端口处均设有一凹槽；上层基板上与凹槽相对的地方开有用于填充试剂和安置电极的孔；电源驱动模块包括一PCR驱动电源和一CE驱动电源，PCR驱动电源与两个分别放置在PCR反应通道的起始端和末端的电极相连接，CE驱动电源与两个分别放置在CE分离通道的起始端和末端的电极相连接。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.支原体检测和去除方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，取至少2个反应管，分别为阳性对照管、测试管，阳性对照管内加入阳性支原体DNA，测试管内加入测试培养液；
步骤二，将反应管放至PCR反应仪内进行检测，如果测试结果为培养液中存有支原体，跳至步骤三；
步骤三，使用支原体清除试剂对支原体进行去除。
2.根据权利要求1所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：步骤一之前，反应管内放置有冻干粉剂，将冻干粉剂溶解；
所述冻干粉剂包括DNA聚合酶、支原体的特异性引物和去离子水；
步骤二中，通过反应管的变色情况判断测试培养液是否存有支原体。
3.根据权利要求2所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：测试管的颜色变化与阳性对照管的颜色变化一致，说明测试培养液内含有支原体；
测试管的颜色变化与阳性对照管的颜色变化不一致，说明测试培养液内含有支原体。
4.根据权利要求1所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：DNA聚合酶包括Bst DNA聚合酶或者显色酶蛋白；
所述PCR反应仪的反应时间为60分钟，反应温度为61℃；
步骤三中，反应管内放入矿物油1～3ml后，将反应管放至PCR反应仪内进行检测。
5.根据权利要求2所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：所述冻干粉剂还包括浓度为0.1moL/L的PBS裂解液；
所述冻干粉剂是将原材料充分搅拌均匀后冰冻成块状体，将块状体在0℃以下的环境下研磨成粉末。
6.根据权利要求1所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：所述反应管上设有用于输入支原体清除试剂的第二进口，所述第二进口设有一水流传感器，所述水流传感器连接一微型处理器系统，所述微型处理器系统连接一电磁阀，所述电磁阀也位于所述第二进口，且所述水流传感器位于所述电磁阀的进口。
7.根据权利要求1所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：所述PCR反应仪包括一温控模块、一电源驱动模块和一显示与接口模块，还包括一PCR和毛细管电泳集成的微流控芯片，
微流控芯片包括一位于上方的上层基板、一位于下方的下层基板，所述上层基板和所述下层基板键合在一起，所述下层基板上设有一PCR反应通道，所述PCR反应通道的一端与所述反应管的出料口导通；
所述反应管的出料口位于所述反应管的下端部；
所述温控模块包括一用于改变PCR反应通道温度的半导体温控片、一用于测量PCR反应通道温度的温度传感器；
所述半导体温控片贴合在微流控芯片的双面，微流控芯片单面的数量设有至少两个，半导体温控片的排列方向平行于PCR反应通道的导流方向。
8.根据权利要求7所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：所述出料口上设有一T型运动件，所述T型运动件包括用于控制出料口水流通断的挡板，所述挡板为所述T型运动件的上端部；
所述挡板与一弹簧的一端固定连接，所述弹簧的另一端与所述反应管的下端面固定连接，所述弹簧的弹性方向平行于所述T型运动件的运动方向；
所述放置位是一与所述出料口相匹配的插口，所述插口上设有导流槽，所述导流槽的正中央设有第一磁铁，所述第一磁铁的中心线与所述插口的中心轴线处于同一直线上，所述T型运动件的下端面设有与所述磁铁磁性方向相同的第二磁铁；
所述导流槽的下端面设有与所述PCR反应通道导通的通孔。
9.根据权利要求1所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素1％～1.5％、克拉霉素1.5％～2％、氢吡四环素1％～1.5％、肉桂醛氧氟沙星酰腙0.3％～0.5％、NaCl1％～1.5％，余量为去离子水。
10.根据权利要求1所述的支原体检测和去除方法，其特征在于：支原体清除试剂的配方如下：泰妙菌素0.5％～1％、瑞他帕林1％～1.5％、克拉霉素1.5％～2％、氢吡四环素1％～1.5％、氧氟沙星0.2％～0.5％、环丙沙星0.5％～0.8％、NaCl1％～1.5％，余量为去离子水。
CN201610277895.2A 2016-04-28 2016-04-28 支原体检测和去除方法 Pending CN105950719A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610277895.2A CN105950719A (zh) 2016-04-28 2016-04-28 支原体检测和去除方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610277895.2A CN105950719A (zh) 2016-04-28 2016-04-28 支原体检测和去除方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105950719A true CN105950719A (zh) 2016-09-21

Family

ID=56916317

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610277895.2A Pending CN105950719A (zh) 2016-04-28 2016-04-28 支原体检测和去除方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105950719A (zh)

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1611929A1 (ru) * 1989-01-18 1990-12-07 Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии Им.Я.Р.Коваленко Способ деконтаминации от микоплазм тимидинкиназодефектных перевиваемых клеточных линий СПЭВ-ТК @
CN101851603A (zh) * 2010-04-15 2010-10-06 上海吉盛制药技术有限公司 支原体清除试剂及其应用
CN102409019A (zh) * 2011-06-23 2012-04-11 胡晓鹏 一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂及其使用方法
CN102618655A (zh) * 2012-04-16 2012-08-01 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种检测肺炎支原体的lamp试剂盒
CN103014174A (zh) * 2013-01-22 2013-04-03 贵州省畜牧兽医研究所 猪支原体肺炎pcr诊断试剂盒
CN104593255A (zh) * 2015-02-06 2015-05-06 大连医科大学附属第二医院 一种即时检测egfr突变的微流控芯片
CN104651519A (zh) * 2015-03-04 2015-05-27 广西壮族自治区兽医研究所 一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN104721965A (zh) * 2013-12-19 2015-06-24 上海三盛金属制品有限公司 可配套使用地暖技术的远红外汗蒸房
CN104745446A (zh) * 2013-12-31 2015-07-01 窦晓鸣 一种pcr和毛细管电泳集成的微流控芯片及采用该芯片的病原菌快速检测装置
CN204636611U (zh) * 2015-04-16 2015-09-16 成都金丰元科技有限公司 动物自动喂药系统
CN204995199U (zh) * 2015-07-29 2016-01-27 上海聚蓝水处理科技有限公司 一种设有加热底座的过滤水壶

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1611929A1 (ru) * 1989-01-18 1990-12-07 Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии Им.Я.Р.Коваленко Способ деконтаминации от микоплазм тимидинкиназодефектных перевиваемых клеточных линий СПЭВ-ТК @
CN101851603A (zh) * 2010-04-15 2010-10-06 上海吉盛制药技术有限公司 支原体清除试剂及其应用
CN102409019A (zh) * 2011-06-23 2012-04-11 胡晓鹏 一种用于清除细胞培养中支原体污染的试剂及其使用方法
CN102618655A (zh) * 2012-04-16 2012-08-01 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种检测肺炎支原体的lamp试剂盒
CN103014174A (zh) * 2013-01-22 2013-04-03 贵州省畜牧兽医研究所 猪支原体肺炎pcr诊断试剂盒
CN104721965A (zh) * 2013-12-19 2015-06-24 上海三盛金属制品有限公司 可配套使用地暖技术的远红外汗蒸房
CN104745446A (zh) * 2013-12-31 2015-07-01 窦晓鸣 一种pcr和毛细管电泳集成的微流控芯片及采用该芯片的病原菌快速检测装置
CN104593255A (zh) * 2015-02-06 2015-05-06 大连医科大学附属第二医院 一种即时检测egfr突变的微流控芯片
CN104651519A (zh) * 2015-03-04 2015-05-27 广西壮族自治区兽医研究所 一种牛支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN204636611U (zh) * 2015-04-16 2015-09-16 成都金丰元科技有限公司 动物自动喂药系统
CN204995199U (zh) * 2015-07-29 2016-01-27 上海聚蓝水处理科技有限公司 一种设有加热底座的过滤水壶

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
胡玉录等: "《抗感染药物的合理应用》", 31 January 2009 *
邵秀玲等主编: "《植物病原生物现代检测技术及应用》", 31 October 2015 *
雷元元等: "一步法恒温支原体检测试剂盒在牛支原体检测中的应用", 《黑龙江畜牧兽医》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6996717B2 (ja) 核酸増幅装置、核酸増幅方法及び核酸増幅用チップ
Bian et al. A microfluidic droplet digital PCR for simultaneous detection of pathogenic Escherichia coli O157 and Listeria monocytogenes
CN101472940B (zh) 基于小滴的生物化学
CN107805597A (zh) 基于微流控芯片的基因检测系统及检测方法
US20230332253A1 (en) Compositions and methods for detection of coronavirus
CN109414695A (zh) 集成流体装置及相关方法
CN103103118A (zh) 一种核酸扩增与检测反应管
CN107964504B (zh) 一种封闭式样本一体化检测装置及检测方法
CN105331710A (zh) 一种沙门氏菌的核酸恒温扩增检测试剂盒及检测方法
US20240139728A1 (en) Devices, assays and methods for detection of nucleic acids
US9233368B2 (en) Moisture-activated self-heating analysis device
CN104561275A (zh) 一种副溶血性弧菌的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
Zhang et al. Recent advances in microchip-based methods for the detection of pathogenic bacteria
US10323266B2 (en) Antimicrobial susceptibility testing device, antimicrobial susceptibility testing kit, and antimicrobial susceptibility testing method
CN105950719A (zh) 支原体检测和去除方法
CN110055354B (zh) 核酸组合物、检测单元、微流控芯片及检测装置
US20190309346A1 (en) Combined Extraction and PCR Systems
CN109988869B (zh) 核酸组合物、检测单元、微流控芯片及检测装置
Jin et al. Rapid detection of antibiotic resistance genes in lactic acid bacteria using PMMA-based microreactor arrays
JP5178149B2 (ja) 標的核酸のリアルタイムｐｃｒ方法及びその装置
CN111108217A (zh) 用于测试样品的传感器装置和方法
CN111187814B (zh) 一种用于核酸扩增比色反应的缓冲液及其应用
CN117580645A (zh) 分析物检测盒及其使用方法
CN116042773A (zh) 一种快速菌种鉴定及药敏检测方法
CN117210318A (zh) 肠杆菌检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160921