CN104561275A

CN104561275A - 一种副溶血性弧菌的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN104561275A
Application number: CN201410795501.3A
Authority: CN
Inventors: 徐昌平; 卢亦愚; 黄世旺; 冯燕; 陈寅; 高见
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明公开了一种副溶血性弧菌的恒温扩增检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包含DNA提取试剂、恒温PCR扩增反应液、阳性对照和阴性对照；本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；核酸扩增反应全部恒定同一温度，恒温扩增仅需35分钟，核酸试纸条检测结果需1-2分钟，全程从接受样品到获得结果整个检测过程仅需1小时左右，且整个反应过程只需一个恒温仪器，特别适合海产品等食物中毒等现场快速检测与排除使用。

Description

一种副溶血性弧菌的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种针对副溶血性弧菌核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对副溶血性弧菌的定性检测。

(二)背景技术

副溶血性弧菌是广泛分布于沿海地区的海洋性细菌，近年来根据国家食源性疾病监测网报告，副溶血性弧菌是引起食源性疾病的主要病原。自1998年后由副溶血性弧菌引起的中毒起数呈显著上升趋势，已居各种微生物食源性疾病之首，严重影响我国人民的食品安全与旅游业发展。如何预防与快速处置由副溶血性弧菌引起的食物中毒，快速检测技术的开发倍受各级政府和卫生部门的关注。传统的细菌培养法主要靠形态学判别、生化反应和血清学凝集等实验方法，存在着受培养条件、试剂等因素影响大、阳性率低、检测时间长等缺点。近年来荧光定量PCR技术的使用，使副溶血性弧菌的检测时间可缩短至2小时左右，但由于需要昂贵的荧光定量PCR仪，使得难以在基层广泛使用。恒温扩增技术是继PCR技术后近年发展起来的一种新的体外核酸扩增技术，本发明技术研制了恒温扩增副溶血弧菌核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。研究表明该副溶血性弧菌恒温扩增-核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点，所以非常适用在基层检验机构使用，同时在突发公共卫生事件的现场检测与临床上的床边诊断上也具有很好的应用前景。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测副溶血性弧菌核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组成：

(1)DNA提取试剂(优选Takara公司的Bacterial Genomic DNAExtraction Kit(货号DV810A)；

(2)恒温PCR扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermol buffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；其中：

所述的外围引物分别为：

所述正向外围引物为：5′-TCATCTAAACAATGTTATAGCCA-3′；

反向外围引物为：5′-GGTTTGGTTTTCTTGCGT-3′；

所述两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5′-Biotin-CTCTTCTTGTAATGGTTATTG-3′；

反向3’端FitC标记探针5′-Fitc-CCAACCTTATCACCAGAAATGG-3′；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：

5′-CGGGAGTAATGCAGTTAATAGTGTGTTTTTCAATGTGCTTGGGT-3′；

扩增反向引物：

5′-CTTCTGCAGTTGCCGAAGAGCTGATCACTTCAGACGCT-3′；

(3)阳性对照：含有副溶血性弧菌TLH基因片段的DNA质粒；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

进一步，本发明所述的1×Thermol buffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

进一步，本发明所述阳性对照为含有长200bp的副溶血性弧菌不耐热溶血素基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.1)：

TCATCTAAACAATGTTATAGCCAAGTATTTTTTCAATGTGCTTGGGTCAATAACCATTACAAGAAGAGTGAATGATGAAAAAAACAATCACACTATTAACTGCATTACTCCCGCTTGCTTCTGCAGTTGCCGAAGAGCCAACCTTATCACCAGAAATGGTTTCAGCGTCTGAAGTGATCAGCACGCAAGAAAACCAAACC。

进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的副溶血性弧菌不耐热溶血素基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒(Promega)对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒(Promega)构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A₂₈₀定量并稀释至1个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。

进一步，本发明所述恒温PCR扩增反应液组成为：两条外围引物各自10pmol，两条探针各自20pmol，两条交叉引物各自40pmol，1×Thermolbuffer，MgSO₄为6mmol，dNTPs溶液各0.4mmol，Bst DNA聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μl。

本发明还提供一种所述副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒的应用，所述应用为：

a)用试剂盒中DNA提取试剂从待检测的标本中提取DNA；

b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在60℃下扩增反应35分钟；标准阳性模板(即阳性对照)加入阳性对照PCR管中，标准阴性模板(即阴性对照)加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有副溶血性弧菌TLH基因片段的质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；

c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测(也可以采用其它核酸试纸条进行检测)，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有副溶血性弧菌核酸。本发明所述核酸试纸条防污染检测装置中试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫(即图1中玻纤)、有色颗粒结合物垫(即图1中乳胶)、纤维膜和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗FitC抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗FitC抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。

在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。本试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠Bst DNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的副溶血性弧菌核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg²⁺浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立了副溶血性弧菌核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10个拷贝，可以满足快速检测副溶血性弧菌核酸的要求。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)本发明所述副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高；

(2)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1小时左右；

(3)整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；整个反应过程不需要复杂的仪器。

(四)附图说明

图1为核酸检测试纸条原理示意图。

图2为本发明试剂盒用于检测副溶血性弧菌的灵敏度，图中1-5分别表示10⁰拷贝/微升、10¹拷贝/微升、10²拷贝/微升、10³拷贝/微升、10⁴拷贝/微升。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1本发明试剂盒的组成与配制

a)DNA提取试剂(优选Takara公司的Bacterial Genomic DNAExtraction Kit(货号DV810A)；

b)副溶血性弧菌核酸恒温PCR扩增反应液：两条外围引物(10pmol)，两条探针(20pmol)和两条交叉引物(40pmol)，1×Thermol buffer，MgSO₄(6mmol)，dNTPs溶液(各0.4mmol)，Bst DNA聚合酶(8U)和无菌双蒸水组成，总反应液体积为25μl；

正向外围引物为：5′-TCATCTAAACAATGTTATAGCCA-3′；

反向外围引物为：5′-GGTTTGGTTTTCTTGCGT-3′；

正向5’端Biotin标记探针5′-Biotin-CTCTTCTTGTAATGGTTATTG-3′；

反向3’端FitC标记探针5′-Fitc-CCAACCTTATCACCAGAAATGG-3′；

扩增正向引物：

5′-CGGGAGTAATGCAGTTAATAGTGTGTTTTTCAATGTGCTTGGGT-3′；

扩增反向引物：

5′-CTTCTGCAGTTGCCGAAGAGCTGATCACTTCAGACGCT-3′；

所述的1×Thermol buffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的TritonX-100，pH 8.8。

所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。

c)阳性对照：阳性对照为含有长200bp的副溶血性弧菌不耐热溶血素基因序列，序列如下：

TCATCTAAACAATGTTATAGCCAAGTATTTTTTCAATGTGCTTGGGTCAATAACCATTACAAGAAGAGTGAATGATGAAAAAAACAATCACACTATTAACTGCATTACTCCCGCTTGCTTCTGCAGTTGCCGAAGAGCCAACCTTATCACCAGAAATGGTTTCAGCGTCTGAAGTGATCAGCACGCAAGAAAACCAAACC

阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的副溶血性弧菌TLH基因基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒测A₂₈₀定量并稀释至1个拷贝/μl，-20℃保存。

d)阴性对照：无菌双蒸水。

实施例2用本发明试剂盒检测副溶血性弧菌核酸的具体方法

a)用副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒中DNA提取液从待检测的标本中提取DNA。

b)取标本DNA作为模板，加入到装有副溶血性弧菌恒温PCR扩增反应液的PCR管中，其中标本DNA 5μl，反应液20μl，60℃扩增反应35分钟；阳性和阴性对照PCR管中分别加入阳性模板和阴性模板。

c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置(杭州优思达生物技术公司3号装置)中进行检测，2分钟以后判读结果。当样本中含有副溶血性弧菌核酸时，试纸条的检测线上呈阳性。

反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性好，且对样本的检测仅仅需要1个小时左右就能完成，大大缩短检测时间。

实施例3用本发明试剂盒检测副溶血性弧菌的特异性

按照实施例2的方法检测鼠伤寒沙门菌CMCC 50013、福氏志贺菌2bATCC 12022、副溶血性弧菌ATCC 17802、大肠埃希氏菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌ATCC 27853、类志贺邻单胞菌ATCC 14029、单增李斯特菌CMCC 54003以及副溶血性弧菌检测试剂盒阳性对照品，结果显示用本发明试剂盒检测副溶血性弧菌核酸具有很强的特异性，除了副溶血性弧菌ATCC 17802和试剂盒阳性对照品，其他菌株检测均为阴性。

实施例4用本发明试剂盒检测副溶血性弧菌核酸的灵敏度

对含有副溶血性弧菌TLH基因片段的质粒DNA进行定量，分别稀释至浓度为10⁴拷贝/微升、10³拷贝/微升、10²拷贝/微升、10¹拷贝/微升、10⁰拷贝/微升，采用实施例2中所述方法来确定本发明试剂盒用于检测副溶血性弧菌核酸的灵敏度。结果如图2所示，图中1-5分别表示10⁰拷贝/微升、10¹拷贝/微升、10²拷贝/微升、10³拷贝/微升、10⁴拷贝/微升，可以发现该试剂盒可在每个反应体系中检出10个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测副溶血性弧菌的要求。

Claims

1.一种副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组成：

(1)DNA提取试剂；

(2)恒温PCR扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引物、1×Thermol Buffer，MgSO₄，dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；

所述正向外围引物为：5′-TCATCTAAACAATGTTATAGCCA-3′；

反向外围引物为：5′-GGTTTGGTTTTCTTGCGT-3′；

所述两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针5′-Biotin-CTCTTCTTGTAATGGTTATTG-3′；

反向3’端FitC标记探针5′-Fitc-CCAACCTTATCACCAGAAATGG-3′；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：

5′-CGGGAGTAATGCAGTTAATAGTGTGTTTTTCAATGTGCTTGGGT-3′；

扩增反向引物：

5′-CTTCTGCAGTTGCCGAAGAGCTGATCACTTCAGACGCT-3′；

(3)阳性对照：含有副溶血性弧菌的不耐热溶血素基因(TLH)的DNA质粒；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

2.如权利要求1所述副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述1×Thermol Buffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

3.如权利要求1所述副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照为含有长200bp的副溶血性弧菌不耐热溶血素基因序列的片段，所述片段的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1所述副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性对照按如下步骤制备：

以包含扩增区域的副溶血性弧菌TLH基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质粒定量并稀释至1个拷贝/μl，获得阳性对照，-20℃保存。

5.如权利要求1所述副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述恒温PCR扩增反应液组成为：两条外围引物各自10pmol，两条探针各自20pmol，两条交叉引物各自40pmol，1×Thermol buffer，MgSO₄为6mmol，dNTPs溶液各0.4mmol，Bst DNA聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μl。

6.一种权利要求1所述副溶血性弧菌恒温扩增检测试剂盒的应用，其特征在于所述应用为：

a)用试剂盒中DNA提取试剂从待检测的标本中提取DNA；

b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板，加入到装有恒温PCR扩增反应液的PCR管中，在60℃下扩增反应35分钟；标准阳性模板加入阳性对照PCR管中，标准阴性模板加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性对照模板为含有副溶血性弧菌不耐热溶血素基因片段的质粒，所述标准阴性对照模板为无菌双蒸水；

c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有副溶血性弧菌不耐热溶血素基因DNA核酸。