CN102605055A

CN102605055A - 副溶血性弧菌多重定量pcr检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102605055A
Application number: CN2012100420615A
Authority: CN
Inventors: 叶菊莲; 金大智; 罗芸; 张政; 王复甦
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2012-02-23
Filing date: 2012-02-23
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2032-02-23
Also published as: CN102605055B

Abstract

本发明提供了一种副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，所述特异性引物和探针由副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)、不耐热溶血素基因(tlh)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和耐热相关溶血素基因(trh)的特异性引物和探针组成。本发明针对副溶血弧菌毒素基因提供了一种快速、敏感、特异的多重荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法，为及时控制副溶血性弧菌食物中毒及其早期诊断提供了基础。

Description

副溶血性弧菌多重定量PCR检测试剂盒及检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR检测试剂盒及其检测方法。

(二)背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是一种革兰阴性嗜盐性弧菌，是弧菌属内比较重要的致病菌之一，主要存在于近海岸的鱼贝类等海产品、海水及其沉积物中，是沿海地区夏、秋季食物中毒和急性腹泻的主要病原菌，可引起急性胃肠道症状。目前副溶血性弧菌的发病率已居各种微生物食源性疾病之首，并明显高于位居第二的沙门菌食物中毒，尤其在沿海地区的发病率更是居高不下。据报道，副溶血性弧菌菌体携带多种毒素基因，这些基因表达的毒素蛋白是造成食物中毒的主要原因。传统的副溶血性弧菌的鉴定方法主要包括分离培养、生化试验、血清分型等，因其操作复杂、周期长，已不能满足目前实际工作(传染病现场诊断、流行趋势分析等)的需要，而且对于毒素的诊断多使用经典细胞学手段，无法实现标准化判定。因此建立一种快速、敏感、特异的检测和鉴定相关毒素的方法对预防和控制副溶血性弧菌食物中毒及其早期诊断具有十分重要的意义。副溶血弧菌的tdh(耐热直接溶血毒素)、tlh(不耐热溶血毒素)、toxR(毒素表达调控蛋白基因)和trh(耐热直接相关溶血毒素)是目前报道该菌携带的主要毒素基因，与海产品食物中毒具有密切关系，准确和快速的明确病原是有效预防传染病大面积发生和传播的前提和基础。实时荧光定量PCR是近几年发展起来的新型检测技术，具有快速、准确、可定量等优势，其中TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、复合探针、染料及分子信标等方法目前已成功应用到病原菌分子诊断领域。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种副溶血性弧菌四种相关毒素基因的多重荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，能够对副溶血性弧菌四种相关毒素基因进行准确、有效地甄别。

本发明采用的技术方案收是：

一种副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，所述特异性引物和探针由副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)、不耐热溶血素基因(tlh)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和耐热相关溶血素基因(trh)的特异性引物和探针组成：

tdh上游引物：5′-TCTGCTTTTGAGCTTCCATCTGT-3′；

tdh下游引物：5′-TGACCGGAGCTTGGGTATTAA-3′；

tdh荧光探针：

5′-FAM-CCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATT-BHQ1-3′；

tlh上游引物：5′-CCAGAAGAGCACGGTTTC-3′；

tlh下游引物：5′-GGTGTACATGTAATCGACAGACGAT-3′；

tlh荧光探针：

5′-VIC-CGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCT-BHQ1-3′；

toxR上游引物：5′-TTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAG-3′；

toxR下游引物：5′-TGCTCAATAGAAGGCAACCAGTT-3′；

toxR荧光探针：

5′-ROX-TGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATC-BHQ2-3′；

trh上游引物：5′-TGCTATTGGCTTCGATATTTTCAGTA-3′；

trh下游引物：5′-CGAACCTGGAGAAGGAAAAGGT-3′；

trh荧光探针：

5′-CY5-CTAAATCATTCGCGATTGACCTGCCATC-BHQ2-3′；

其中FAM、VIC、ROX和CY5为不同波长的荧光报告基团，BHQl和BHQ2为荧光淬灭基团。

本发明的关键在于扩增引物的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择。PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制，例如将Tris-HCl、KCl、MgCl₂等按比例混合进行配制，进行检测时，将PCR反应试剂和扩增引物和探针混合，再加入待测样品或对照品，即可进行PCR扩增反应。

为达到定量检测的目的，所述试剂盒还可包括副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)、不耐热溶血素基因(tlh)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和耐热相关溶血素基因(trh)的标准品，所述标准品序列如下：

tdh标准品：tctgcttttga gcttccatct gtcccttttc ctgcccccg gttctgatga gatattgtttgttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca；

tlh标准品：ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagt gatccttgtt tggacatcaaccgctcatcg tctgtcgatt acatgtacacc；

toxR标准品：ttccgt cagattggtg agtatcagaa cgtaccagtg atgacacctgtaaatcaccc gcaaatcaac aactggttgc cttctattga gca；

trh标准品：tgctattg gcttcgatat tttcagtatc taaatcattc gcgattgacc taccatccataccttttcct tctccaggtt cg。

本发明还涉及一种副溶血性弧菌毒素基因多重荧光定量PCR检测方法，所述方法包括：

(1)提取待测样品DNA；

(2)以待测样品DNA为模板，加入副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)、不耐热溶血素基因(tlh)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和耐热相关溶血素基因(trh)的特异性引物和探针，PCR缓冲液，脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反应液，进行PCR扩增，以非靶细菌为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性；所述特异性引物和探针如前所述。

为达到定量检测的效果，所述方法可同时以副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)、不耐热溶血素基因(tlh)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和耐热相关溶血素基因(trh)标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，分别根据拷贝浓度的对数值与各标准品Ct值的关系绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照相应标准曲线获得样品DNA中相应基因的拷贝浓度；所述标准品序列如前所述。

所述PCR反应条件如下：95℃预变性5分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增，最后置4℃。荧光采集在每个循环的退火温度时进行。

本发明的有益效果主要体现在：本发明针对副溶血弧菌毒素基因提供了一种快速、敏感、特异的多重荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法，为及时控制副溶血性弧菌食物中毒及其早期诊断提供了基础。

(四)附图说明

图1为标准品检测结果；1～7分别为30ng、3ng、0.3ng、30pg、3pg、0.3pg、30fg/μL标准品；

图2为四种毒素基因对应的标准曲线；Y：对应的Ct值；X：基因的质量数。

图3为阳性菌株DNA检测结果；1为tdh基因，2为toxR基因，3为tlh基因，4为trh基因。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：标准品的获得

1、材料：

pGEM-T-Easy克隆系统、PCR相关试剂及Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司，377型测序仪(ABI公司)、Bio-Rad icycler PCR仪(Bio-Rad公司)、ABI7500 fast定量PCR仪(ABI公司)。

2、引物及探针设计与合成：

以副溶血性弧菌tdh(耐热直接溶血素)基因(Genbank注册号为GU971653)、tlh(不耐热溶血素)基因(Genbank注册号为AY829372)、toxR(毒素表达调控蛋白)基因(Genbank注册号为JN188468)和trh(耐热相关溶血素)基因(Genbank注册号为DQ359749)为模板，使用PrimerExpress TM(V3.0，美国ABI公司)软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择最佳组合。由上海辉睿生物科技有限公司进行引物和探针的合成与纯化。

3、阳性参考品的制备：

以副溶血性弧菌标准株(ATCC 17802)做为模板，用DNA提取试剂提取基因组DNA，用分光光度计测定浓度，取1.0μL(50ng/μL)做PCR反应模板，分别用上述的上下游引物在Bio-Rad icycler PCR仪上进行PCR扩增：

PCR反应液组成如下：

去离子水补足至20μL。

PCR条件为：94℃5分钟变性，94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒进行35个循环扩增，最后于72℃延伸5分钟后置4℃。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。tdh(耐热直接溶血素)、tlh(不耐热溶血素)、toxR(毒素表达调控蛋白)和trh(耐热相关溶血素)基因对应的片段长度分别为100bp、81bp、89bp和80bp片段，即为标准品，测定浓度并换算成质量/体积，分别命名为质粒tdh、tlh、toxR和trh。

4、结果：

经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下：

tdh(耐热直接溶血素)基因标准品序列：tctgcttttga gcttccatct gtcccttttcctgcccccg gttctgatga gatattgttt gttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca。

tlh(不耐热溶血素)基因标准品序列：ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagtgatccttgtt tggacatcaa ccgctcatcg tctgtcgatt acatgtacacc。

toxR(毒素表达调控蛋白)基因标准品序列：ttccgt cagattggtgagtatcagaa cgtaccagtg atgacacctg taaatcaccc gcaaatcaac aactggttgc cttctattgagca。

trh(耐热相关溶血素)基因标准品序列：tgctattg gcttcgatat tttcagtatctaaatcattc gcgattgacc taccatccat accttttcct tctccaggtt cg。

实施例2：多重荧光定量PCR法检测副溶血性弧菌四种相关毒素基因方法的建立

1、质粒DNA及其他细菌DNA提取：

采用基因组DNA提取试剂提取细菌基因组DNA，采用质粒DNA提取试剂盒提取阳性质粒DNA，分别取1.0μL(50ng/μL)做模板，用检测用上下游引物在ABI7500 fast定量PCR仪(ABI公司)上进行PCR扩增。

PCR反应液组成如下：

去离子水补足至50μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增，最后置4℃，荧光采集在每个循环的退火温度时进行。

以非靶细菌志贺菌(ACCC04121)为阴性对照于相同条件下进行PCR检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测模板荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。

同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测，并绘制标准曲线。

待测DNA的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测副溶血性弧菌含有tdh(耐热直接溶血素)、tlh(不耐热溶血素)、toxR(毒素表达调控蛋白)和trh(耐热相关溶血素)基因的数量。

以肠出沙门氏菌(CICC21490)、血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7(ATCC43889)，致病性大肠杆菌(EPEC)(ATCC 43887)，肠产毒性大肠杆菌(ETEC)(ATCC35401)，肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)(ATCC 43893)，创伤弧菌(CICC 10383)等按照上述方法进行检测，结果均为阴性，说明本发明方法特异性好。

2.检测结果

标准品检测结果参见图1，标准曲线参见图2，其中tdh基因标准方程(FAM)：Y＝-3.5782×lgX+38.406，R²＝0.9695；toxR基因标准方程(ROX)：Y＝-3.9223×lgX+39.3586，R²＝0.9819；tlh基因标准方程(VIC)：Y＝-3.6574×lgX+41.3161，R²＝0.9889；trh基因标准方程(CY5)：Y＝-3.7139×lgX+40.0543，R²＝0.9987。

阳性菌株DNA检测结果见图3；1为tdh基因，Ct值为26.05，基因浓度为2.84pg/μL；2为toxR基因，Ct值为28.30，基因浓度为0.67pg/μL；3为tlh基因，Ct值为29.62，基因浓度为1.59pg/μL；4为trh基因，Ct值为29.61，基因浓度为0.65pg/μL。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省疾病预防控制中心

<120> 副溶血性弧菌多重定量PCR检测试剂盒及检测方法

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

tctgcttttg agcttccatc tgt 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

tgaccggagc ttgggtatta a 21

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

cctgcccccg gttctgatga gatatt 26

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

ccagaagagc acggtttc 18

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

ggtgtacatg taatcgacag acgat 25

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

cgatccttgt ttggacatca accgct 26

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

ttccgtcaga ttggtgagta tcag 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

tgctcaatag aaggcaacca gtt 23

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

tgatgacacc tgtaaatcac ccgcaaatc 29

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

tgctattggc ttcgatattt tcagta 26

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

cgaacctgga gaaggaaaag gt 22

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

ctaaatcatt cgcgattgac ctgccatc 28

<210> 13

<211> 100

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 13

tctgcttttg agcttccatc tgtccctttt cctgcccccg gttctgatga gatattgttt 60

gttgttcgag atacaacttt taatacccaa gctccggtca 100

<210> 14

<211> 81

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 14

ccagaagagc acggtttcgt gaacgcgagt gatccttgtt tggacatcaa ccgctcatcg 60

tctgtcgatt acatgtacac c 81

<210> 15

<211> 89

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 15

ttccgtcaga ttggtgagta tcagaacgta ccagtgatga cacctgtaaa tcacccgcaa 60

atcaacaact ggttgccttc tattgagca 89

<210> 16

<211> 80

<212> DNA

<213> Vibrio parahaemolyticus

<400> 16

tgctattggc ttcgatattt tcagtatcta aatcattcgc gattgaccta ccatccatac 60

cttttccttc tccaggttcg 80

Claims

1.一种副溶血性弧菌毒素基因多重定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，所述特异性引物和探针由副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)、不耐热溶血素基因(tlh)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和耐热相关溶血素基因(trh)的特异性引物和探针组成：

tdh上游引物：5′-TCTGCTTTTGAGCTTCCATCTGT-3′；

tdh下游引物：5′-TGACCGGAGCTTGGGTATTAA-3′；

tdh荧光探针：

5′-FAM-CCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATT-BHQ1-3′；

tlh上游引物：5′-CCAGAAGAGCACGGTTTC-3′；

tlh下游引物：5′-GGTGTACATGTAATCGACAGACGAT-3′；

tlh荧光探针：

5′-VIC-CGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCT-BHQ1-3′；

toxR上游引物：5′-TTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAG-3′；

toxR下游引物：5′-TGCTCAATAGAAGGCAACCAGTT-3′；

toxR荧光探针：

5′-ROX-TGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATC-BHQ2-3′；

trh上游引物：5′-TGCTATTGGCTTCGATATTTTCAGTA-3′；

trh下游引物：5′-CGAACCTGGAGAAGGAAAAGGT-3′；

trh荧光探针：

5′-CY5-CTAAATCATTCGCGATTGACCTGCCATC-BHQ2-3′；

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)、不耐热溶血素基因(tlh)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和耐热相关溶血素基因(trh)的标准品，所述标准品序列如下：

toxR标准品：ttccgt cagattggtg agtatcagaa cgtaccagtg atgacacctg taaatcacccgcaaatcaac aactggttgc cttctattga gca；

3.一种副溶血性弧菌毒素基因多重荧光定量PCR检测方法，所述方法包括：

(1)提取待测样品DNA；

(2)以待测样品DNA为模板，加入副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)、不耐热溶血素基因(tlh)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和耐热相关溶血素基因(trh)的特异性引物和探针，PCR缓冲液，脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反应液，进行PCR扩增，以非靶细菌为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性；

所述特异性引物和探针如下：

tdh上游引物：5′-TCTGCTTTTGAGCTTCCATCTGT-3′；

tdh下游引物：5′-TGACCGGAGCTTGGGTATTAA-3′；

tdh荧光探针：

5′-FAM-CCTGCCCCCGGTTCTGATGAGATATT-BHQ1-3′；

tlh上游引物：5′-CCAGAAGAGCACGGTTTC-3′；

tlh下游引物：5′-GGTGTACATGTAATCGACAGACGAT-3′；

tlh荧光探针：

5′-VIC-CGATCCTTGTTTGGACATCAACCGCT-BHQ1-3′；

toxR上游引物：5′-TTCCGTCAGATTGGTGAGTATCAG-3′；

toxR下游引物：5′-TGCTCAATAGAAGGCAACCAGTT-3′；

toxR荧光探针：

5′-ROX-TGATGACACCTGTAAATCACCCGCAAATC-BHQ2-3′；

trh上游引物：5′-TGCTATTGGCTTCGATATTTTCAGTA-3′；

trh下游引物：5′-CGAACCTGGAGAAGGAAAAGGT-3′；

trh荧光探针：

5′-CY5-CTAAATCATTCGCGATTGACCTGCCATC-BHQ2-3′；

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以副溶血性弧菌耐热直接溶血素基因(tdh)、不耐热溶血素基因(tlh)、毒素表达调控蛋白基因(toxR)和耐热相关溶血素基因(trh)标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，分别根据拷贝浓度的对数值与各标准品Ct值的关系绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照相应标准曲线获得样品DNA中相应基因的拷贝浓度；所述标准品序列如下：

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR反应条件如下：95℃预变性5分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40个循环扩增，最后置4℃。