CN107988402A

CN107988402A - 质谱鉴定副溶血性弧菌分型的试剂盒

Info

Publication number: CN107988402A
Application number: CN201810003305.6A
Authority: CN
Inventors: 马庆伟; 钟逾; 刘昕超
Original assignee: Beijing Yixin Bochuang Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Clin Bochuang Biotechnology Co Ltd; Beijing Yixin Bochuang Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-01-03
Filing date: 2018-01-03
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2038-01-03
Also published as: CN107988402B

Abstract

本发明公开了一种鉴定副溶血性弧菌分型的多重PCR产物的试剂盒，包括用于扩增副溶血性弧菌的tlh片段、tdh片段、trh片段的特异性引物、质谱专用点样基质、质谱专用微阵列芯片、质谱内标标准品、质谱外标标准品。本发明的试剂盒通过将所得核酸指纹特征图谱与库中副溶血性弧菌的核酸指纹图谱进行比较，从而判断待测细菌的种属。基于该试剂盒所产生的质谱峰图，可对待检样品中的副溶血性弧菌进行分类与鉴定，结果可广泛运用于副溶血性弧菌的分型与分类，以及环境卫生和公共安全检疫等领域。

Description

质谱鉴定副溶血性弧菌分型的试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，涉及一种利用飞行时间质谱技术快速鉴定副溶血性弧菌分型的多重PCR产物的产品。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)分布极广，主要分布在海水和水产品中，我国华东地区沿岸的海水的副溶血性弧菌检出率为47.5％～66.5％，海产鱼虾的平均带菌率为45.6％～48.7％，夏季可高达90％以上。此外，畜禽肉、咸菜、咸蛋、淡水鱼等都发现有副溶血性弧菌的存在。副溶血性弧菌对人类危害仅次于霍乱弧菌，致病菌株可引起人类腹泻、恶心、呕吐、腹部痉挛，严重的可以引起昏迷、脱水甚至死亡。除了临床上需要加强副溶血性弧菌的检测之外，在食品安全(如肉制品加工、烧烤店)、环境卫生(如学校机关的后勤场所)、进出口检验检疫、公共场所安全方面也需要对副溶血性弧菌进行分型鉴定，以维护公共卫生安全。

研究发现副溶血性弧菌的主要毒力因子包括多种溶血毒素，主要有不耐热直接溶血毒素(TLH)、耐热直接溶血毒素(TDH)与耐热直接溶血相关毒素(TRH)，分别由tlh、tdh和trh基因编码。通常副溶血性弧菌的鉴定方法是分离培养、镜检观察、生化鉴定、嗜盐性试验等，不仅耗时，且操作复杂，灵敏度有限。近年来随着分子生物学的发展，对副溶血性弧菌的研究更深入了一步，尤其是对其基因组DNA、质粒、鞭毛以及致病因子等方面的研究更是取得了长足的进展。因此需要采用分子分型技术作为辅助诊断的方法。近年来常用的副溶血性弧菌快速检测方法主要有ELISA、DNA探针、常规PCR、实时PCR等。以多重PCR为基础的核酸检测方法，对副溶血性弧菌的准确鉴定和传染源的快速发现具有重要意义。且多重PCR检测针对多个基因，假阴性率比单重PCR降低。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，简称MALDI-TOF MS)技术，是20世纪80年代末问世并迅速发展起来的一种质谱分析技术。其质量分析器是一个离子漂移管(iondirft tube)，由离子源产生的离子首先被收集，在收集器中所有离子速度变为0，使用一个脉冲电场加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器，离子质量越大，到达接收器所用时间越长；离子质量越小，到达接收器所用时间越短。根据这一原理，可以把不同质量的离子按质荷比大小进行分离，准确检测多肽、蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分子质量和纯度，具有准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短、性价比高的优点。

近年来，已经出现质谱技术来检测核酸和蛋白质领域，其中质谱技术应用于核酸检测领域的理论基础在于，组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，如ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP的分子量依次为271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTMP是经过修饰的)，它们之间的最小分子量差异在16Da，完全可以通过质谱进行分辨。使用质谱能够对碱基突变或多态位点(SNP)、插入/缺失(InDel)、甲基化位点、基因定量、拷贝数变化(copy number variation，CNV)等多种DNA变化类型进行检测。

已有一些公开文献使用质谱技术对微生物进行分类和鉴定，例如，中国专利申请CN102337223A，“产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制备方法”，公开了一种检测产黄青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-TOF鉴定方法，其中从平板上挑取产黄青霉A096孢子接种于SGY液体培养基培养，预处理得到粗蛋白溶液在色谱柱上分离纯化，并在羧甲基阳离子交换色谱柱上分离纯化，收集各洗脱组分，各组分离心超滤浓缩至所需体积，以宛氏拟青霉为敏感受试指示菌，追踪抗真菌活性组分，确定的活性成分判断获得蛋白的纯度；割取SDS-PAGE电泳图上的单一条带，进行MALDI-TOF鉴定。该方法仅适用于特定微生物，且需要多重蛋白纯化过程，最终用MALDI-TOF鉴定特征蛋白Pc-Arctin，其过程繁琐，适用面窄，不能实现质谱分类细菌或微生物的目的。

中国专利申请201110154723、“MALDI TOF MS辅助鉴定单增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS辅助鉴定副溶血性弧菌的方法”公开了一种利用MALDI TOFMS技术辅助鉴定细菌的方法，包括：预处理细菌培养物，采集所有菌株样品的MALDI TOF MS图谱，根据软件制备细菌标准图谱，使用相同的方法检测并采集待测细菌的图谱，以及比较二者图谱，根据匹配分数进行判定。由于该方法使用常规的处理(通过无水乙醇、甲酸和乙腈处理，并辅以离心，最后吸取上清液进行检测)，尽管其在一定程度上能表征该细菌的特征图谱，但由于其待测物中含有蛋白质、脂类、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被离子化的分子，其得到的图谱实质上是上述各种分子的图谱集合，因此既需要处理和比对的图谱信息量过大，并且因待检分子过于庞大而导致其图谱特征性偏低，只适用于某具体细菌而无法推广到其他大量的细菌检测中。

中国专利申请201210272533.6“建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品”，公开了一种基于质谱技术快速鉴定幽门螺杆菌的方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。该方法利用飞行时间质谱技术，对分子量和丰度各异的核酸片段进行检测，并形成谱图。但是，该方法中核酸片段经PCR扩增后，还需经过SAP酶消化、转录和核酸酶切，仅能识别单个碱基的变化，无法检测有特征序列的长片段DNA。

此外，基于MALDI-TOF MS，开发了一些核酸检测方法，如美国Agena公司的hME和iPLEX方法，德国Bruker公司的GOOD assay方法，韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。各公司为了提高质谱仪的分辨率，对目标位点进行检测倾向于检测分子量较小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通过对含单核苷酸多态性(SNP)位点的多重PCR产物进行限制性酶切，产生2000～4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测，而GOOD assay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)将含SNP位点的寡核苷酸片段切割成1000～2000Da左右的小片段进行检测。然而，以上方法，都不可避免地存在操作复杂，耗时长等问题。

此外，美国Sampath等([J].PLoS One，2007，2(5):e489)报道了将RT-PCR和电喷雾色谱相结合的技术(reverse transcription PCR/electrospray-ionization massspectrometry，RT-PCR/ESI-MS)。该方法可快速检测出92种哺乳类动物及禽类流感分离株，推断出30种不同的H及N型病毒(其中包括29种AIV H5N1分离株)，准确率高达97％，时间只要短短几小时。同时该技术可以检测混合感染的病毒样品且可用于病毒的各个亚型及未知核酸序列病毒新变异株的大规模检测。但该技术所需的质谱仪价格昂贵，目前还只局限于在少数的研究机构中使用。

中国专利申请200880121570、发明名称“用于诊断和监测精神疾病的方法和生物标志物”报道了可以通过MALDI-TOF质谱技术，检测包括流感病毒在内的近百种与精神疾病相关的生物肽。然而，该方法仅仅简单概括了各种可能的技术，其既没有报道具体方案，也没有报道流感病毒的特定靶点，因此难以教导研究者通过MALDI-TOF质谱技术来检测流感病毒。

因此，目前需要新的副溶血性弧菌的鉴定和分析方法来实现快速、准确、廉价、便捷的分类结果。本发明将多重PCR与飞行时间质谱技术相结合，多重PCR产物经纯化后可直接进行质谱检测，克服了多管增加污染的概率，简化了操作，缩短了检测时间，特异性强，检测灵敏度远高于传统的细菌分离培养和血清学鉴定，适用于大批量样本的检测，在临床具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明原理在于：组成遗传物质DNA的基本单元——四种核苷酸之间存在质量差异，对副溶血性弧菌基因组DNA上某几个片段进行多重PCR后，将产生分子量和丰度各异的片段，使用质谱检测可产生核酸指纹图谱，副溶血性弧菌的不同血清型之间的基因组DNA存在差异，将产生不同的核酸指纹图谱。建立数据库后，将实验结果与数据库中副溶血性弧菌标准图谱信息进行比对，即可完成对副溶血性弧菌的鉴定、分型、分类等。此方法具有特异性强，灵敏度高，成本低，操作简便，用时少等优势。

本发明原理之一在于，由于副溶血性弧菌的不同血清型之间的基因组DNA存在差异，导致基因的核苷酸组成存在细微差异，即四种核苷酸之间存在质量差异。因此将MALDI-TOF质谱与多重PCR联用，通过优化多重PCR体系，获得靶点扩增产物后，即可直接将扩增产物进行MALDI-TOF MS检测。更具体的说，本方法利用多重PCR特异性地扩增多个大小不同的寡核苷酸片段，利用不同的寡核苷酸片段在质谱分型过程中生成的不同的核酸指纹图谱，建立数据库后，将实验结果与数据库中副溶血性弧菌标准图谱信息进行比对，即可完成对副溶血性弧菌的鉴定、分型、分类等。此方法具有特异性强，灵敏度高，成本低，操作简便，用时少等优势。

本发明原理之二在于，在多重PCR体系优化过程中，通过对目标核酸的全序列进行分析，选取保守序列设计引物进行多重PCR扩增，并且针对PCR扩增结果对引物进行改进，最终选定对于特异性扩增有效的引物序列；为了区分大小相近的PCR产物，在引物中引入不影响PCR扩增的tag序列；将多重PCR产物经纯化后直接进行MALDI-TOF MS分析，从而成功实现了目标核酸的快速检测。

因此，本发明第一目的是提供用于鉴定副溶血性弧菌分型的多重PCR产物的引物组合，其中该引物组合包括，

引物为扩增副溶血性弧菌的tlh片段的特异性引物的SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2，其扩增产物的质谱峰值为33708Da；

扩增副溶血性弧菌的tdh片段的特异性引物的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，其扩增产物的质谱峰值为37250Da；

扩增副溶血性弧菌的trh片段的特异性引物的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，其扩增产物的质谱峰值为42702Da。

上述任一实施方案中，其中所述引物组合可根据需要加入tag序列，使多重PCR产物的大小能够容易地由MALDI-TOF MS进行区分。在一个具体实施方案中，所述tag序列为ACGTTGGATG。

本发明第二个目的是提供用于上述质谱法(MALDI-TOF MS)鉴定副溶血性弧菌分型的多重PCR产物的质谱试剂盒，其中该试剂盒包含上述用于扩增上述病毒的特异性引物组合、质谱专用点样基质。

在一个实施方案中，所述点样基质的组成为，3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。

在另一实施方案中，引物为扩增副溶血性弧菌的tlh片段的特异性引物的SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，其扩增产物的质谱峰值为33708Da；

上述任一实施方案中，其中在所述PCR扩增的反应体系30μl中含有：

在一个优选实施方案中，其中每组引物对的浓度控制在10-20μM之间。

在另一优选实施方案中，其中在PCR扩增反应程序为：94-95℃预变性5min；94-95℃变性30s，55-60℃退火30s，72-75℃延伸40-60s，进行35-45个循环；然后，72-75℃延伸5min。

在上述任一实施方案中，所述试剂盒还包括质谱专用微阵列芯片、质谱内标标准品、质谱外标标准品。

在一个实施方案中，所述试剂盒中还包含用于比较分析分离菌株的核酸指纹特征图谱的软件。在一个优选实施方案中，所述软件是发明人自行研究开发的BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号，登记号2009SR10700。

本发明的第三个目的是提供一种鉴定副溶血性弧菌分型的方法，步骤包括

使用特定引物组合对待测副溶血性弧菌的特征片段进行多重PCR扩增；

将多重PCR产物通过吸附柱进行纯化；

将纯化后的多重PCR产物点样于基质结晶上，通过质谱检测多重PCR产物的片段的大小；

将质谱结果与副溶血性弧菌指纹图谱库比较，以确定待检副溶血性弧菌的具体分型；

其中，

所述引物为扩增副溶血性弧菌的tlh基因片段的特异性引物的SEQ ID NO.1和SEQID NO.2，其扩增产物的质谱峰值为33708Da；

扩增副溶血性弧菌的tdh基因片段的特异性引物的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，其扩增产物的质谱峰值为37250Da；

扩增副溶血性弧菌的trh基因片段的特异性引物的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，其扩增产物的质谱峰值为42702Da。

在另一优选实施方案中，其中在PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行45个循环，最后72℃延伸5min。

在上述任一实施方案中，其中在所述MALDI-TOF MS检测中所使用的点样基质中含有甲酸。在一个具体实施方案中，在所述MALDI-TOF MS检测中所使用的点样基质的组成为，3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。

在上述任一实施方案中，该方法可作为非诊断目的的应用，广泛用于对环境卫生、食品安全检测、公共场所安全、进出口检验检疫等领域的副溶血性弧菌分型进行鉴定，以维护公共卫生安全。

本发明第四目的是提供一种用作上述质谱鉴定副溶血性弧菌分型的多重PCR产物的副溶血性弧菌指纹图谱库的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成副溶血性弧菌DNA片段保守序列的质粒，并设计其对应的特异性引物；

其中，保守序列分别选自副溶血性弧菌DNA的tlh片段(SEQ ID NO.7)、tdh片段(SEQ ID NO.8)、trh片段(SEQ ID NO.9)，所述片段的特异性引物序列分别选自：SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

(2)用步骤(1)中的引物组合对基因组DNA进行多重扩增；

(3)对PCR产物进行检测，检查PCR扩增质量；

(4)使用DNA吸附柱对多重PCR产物进行纯化；

(5)纯化产物与基质形成结晶混合物，点样于芯片上；

(6)质谱仪检测，得到不同副溶血性弧菌的特征核酸指纹图谱；

(7)将步骤(6)得到的不同分离株的核酸指纹特征图谱，通过计算机软件进行汇总和整理，得到副溶血性弧菌的标准核酸指纹特征图谱。

在一个实施方案中，PCR反应所扩增的细菌核酸序列，包括但不限定于副溶血性弧菌DNA基因组上一个区域。

在一个具体实施方案中，所述DNA吸附柱的固相支持物包括但不限于凝胶、树脂、硅土、硅胶、磁珠、玻璃粉、玻璃珠等。在一个具体实施方案中，所述基质为含有酸性成分的复合基质，该酸性成分包括但不限于甲酸、乙酸和柠檬酸。在另一个具体的实施方案中，所述芯片为飞行时间质谱专用微阵列芯片，其材质包括但不限于不锈钢、金刚石、单晶硅、石英晶体。

在一个具体实施方案中，所述质谱仪为MALDI TOF MS质谱仪。

上述任一方案中，所述副溶血性弧菌包括但不限于O1群和O139群。

在一个实施方案中，所述软件是发明人自行研究开发的BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号，登记号2009SR10700。

技术效果

1、本发明基于质谱检测技术，由于质谱检测的高灵敏性，使用本方案对副溶血性弧菌存在与否的检测下限能够远超出其他技术方案。

2、核酸扩增产物纯化后即可进行质谱检测，相对于现有技术，全过程仅仅数小时内完成，操作简便，特异性强，结果准确，通量高。

3、本发明实施的检测在同一个PCR体系中完成，节约了样本DNA以及PCR扩增体系中的各试剂，特别是Taq的使用量，大大降低了检测成本，可广泛应用于临床多种传染性疾病的快速诊断。

4、对于不同的样本，本发明可比对它们产生的核酸指纹图谱，将实验产生的核酸指纹图谱与数据库中副溶血性弧菌标准菌株的图谱进行对比，经生物信息学分析，可以判断该菌是否为副溶血性弧菌分离株。

5、使用本方案可以快速准确地进行副溶血性弧菌的分类与鉴定，并可用于临床检验等方面，避免临床上因诊断不及时而延误病情。

6、使用本发明可对环境卫生、公共场所等领域的副溶血性弧菌分型进行鉴定，以维护公共卫生安全。

7、本发明的数据库是开放式的，可不断补充新的分离株，不断完善和扩大数据库，以便更为准确的完成副溶血性弧菌的鉴定。

附图说明

图1：副溶血性弧菌核酸片段多重PCR产物的Multina电泳条带。

图2：副溶血性弧菌核酸片段多重PCR产物的MALDI-TOF MS检测图谱。

具体实施方式

为了进一步了解本发明的技术特征，下面结合具体实施例对本发明进行详细的阐述。实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上做出任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：副溶血性弧菌核酸指纹图谱的建立。

1、序列匹配

经过检索NCBI数据库，副溶血性弧菌DNA的保守序列分别选自tlh片段，>JQ929914.1Vibrio parahaemolyticus strain C1 Tlh(tlh)gene,partial cds，其序列为SEQ ID NO.7：

ACGAAAGCGCCTCAGTTTAAGTACTCAACACAAGAAGAGATCGACAAAATTCGTGCGAAAGTGCTTGAGATGAACGA GTTCATCAAGGCACAAGCGATGTACTACAAAGCGCAAGGTTACAACATCACGTTGTTTGATACTCACGCCTTGTTCGAGACGCTAACTTCTGCGCCAGAAGAGCACGGTTTCGTGAACG；

tdh片段，>JX453039.1 Vibrio parahaemolyticus strain J-M2-8athermostable direct hemolysin(tdh)gene,partial cds，其序列为SEQ ID NO.8：

TGTAAAGGTCTCTGACTTTTGGACAAACCGTAATGTAAAAAGAAAACCGTACAAAGATGTTTATGGTCAATCAGTATTCACAACGTCTGGTACTAAATGGCTGACATCCTACATGACTGTGAACATTAATGATAAAGACTATACAATGGCAGCGGTGTCTGGCTATAAGCACGGTCATTCTGCTGTGTTCGTAAAATCAGATCAAGTACAG

trh片段>AY742213.1 Vibrio parahaemolyticus isolate VP8 thermostabledirect haemolysin-related haemolysin(trh)gene,complete cds，其序列为SEQ IDNO.9：

TACACATAACAAACATATGCCCATTTCCGCTCTCATATGCTTCGACATTGACGAAATATTCTGGCGTTTCATCCAAATACGTTACACTTGGCAATGATTCTTCATTTTCACCAACGAAATCACTAACAGAAGAATAGTTCTGATTTAGGCTTGTTTTTTCTGATTTTGTGAAGACCGTTGAAAGGCCATCTTTATAGCCAGAAAG

2、引物设计

对副溶血性弧菌设计3对特异性引物，全部由上海捷瑞生物工程有限公司合成：

编号	引物(5'→3')
		SEQ ID No：1	ACGTTGGATGGAACGAGTTCATCAAGGCAC
SEQ ID No：2	ACGTTGGATGTCTTCTGGCGCAGAAGTTAG
		SEQ ID No：3	ACGTTGGATGCGTCTGGTACTAAATGGCTG
SEQ ID No：4	ACGTTGGATGACGAACACAGCAGAATGACC
		SEQ ID No：5	ACGTTGGATGCCAAATACGTTACACTTGGC
SEQ ID No：6	ACGTTGGATGATGGCCTTTCAACGGTCTTC

3、PCR扩增：

(1)PCR反应体系：

(2)扩增反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行45个循环，最后72℃延伸5min。

4、Multina电泳检测：使用岛津的Multina电泳仪对PCR产物进行检测，扩增出128bp、129bp和137bp三条条带表示扩增成功(图1)。

5、多重PCR产物纯化：(1)按照DNA Binding Buffer：PCR产物＝5：1的体积比往PCR产物中加入Binding Buffer后混匀；(2)将上述混合液转移至吸附柱，吸附柱于收集管内，10,000g离心30s，弃掉废液；(3)加200μL DNA Wash Buffer于吸附柱中，10,000g离心30s，重复该洗涤1次；(4)加≥6μL的ddH₂O于吸附柱中，室温放置1min后转移至新的1.5mL离心管中10,000g离心30s，获得纯化后的产物。

6、、芯片点样：(1)用镊子取一张飞行时间质谱专用微阵列芯片，轻放置于靶托上；(2)按照样品顺序依次点样，每个样品取样0.5-1.0μL；(3)室温晾干(10-15min)或者使用加热器加热干燥。

7、质谱检测：使用Clin-ToF Ⅱ(MALDI-TOF原理)质谱仪检测峰信号，参见图2。

8、使用飞行时间质谱信号处理系统(MALDI MS)对检测结果进行分析。

结果如图2及分析结果所示，质谱图谱在33708Da，37250Da和42702Da处检测到特征峰值，分别表征扩增副溶血性弧菌的tlh片段、tdh片段、trh片段。该三条特征峰基线平滑，丰度大，信噪比高，相邻信号峰之间分离度高，图谱质量得到明显改善，能够提供更多的信息，有助于提高鉴定结果的准确性和重复性。

Claims

1.一种用于MALDI-TOF质谱鉴定副溶血性弧菌分型的多重PCR产物的引物组合物，其中该引物组合包括，

引物为扩增副溶血性弧菌的tlh片段的特异性引物的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，其扩增产物的质谱峰值为33708Da；

2.权利要求1的组合物，其中所述引物组合物可根据需要加入tag序列，使多重PCR产物的大小能够容易地由MALDI-TOF MS进行区分。

3.权利要求2的组合物，其中所述tag序列为ACGTTGGATG。

4.包含权利要求1-3的引物组合物并用于鉴定副溶血性弧菌分型的多重PCR产物的质谱试剂盒，其中该试剂盒包含上述用于扩增上述病毒的特异性引物组合、质谱专用点样基质。

5.权利要求4的试剂盒，其中所述点样基质的组成为，3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。

6.权利要求5的试剂盒，其中在所述PCR扩增的反应体系30μl中含有：

。

7.权利要求6的试剂盒，其中每组引物对的浓度控制在10-20μM之间。

8.权利要求7的试剂盒，其中在PCR扩增反应程序为：94-95℃预变性5min；94-95℃变性30s，55-60℃退火30s，72-75℃延伸40-60s，进行35-45个循环；然后，72-75℃延伸5min。

9.权利要求8的试剂盒，其中所述试剂盒还包括质谱专用微阵列芯片、质谱内标标准品、质谱外标标准品，以及用于分析比较分离菌株的核酸指纹特征图谱的软件。

10.权利要求9的试剂盒，其中所述软件是BioExplore软件，其版权号为软著登字第136879号，登记号2009SR10700。