CN108034770A

CN108034770A - 质谱法检测甲型流感病毒h7n9多重pcr产物的方法及其产品

Info

Publication number: CN108034770A
Application number: CN201810068265.3A
Authority: CN
Inventors: 马庆伟; 钟逾; 安娜; 高佳敏; 刘昕超; 王佳
Original assignee: Beijing Yixin Bochuang Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Yixin Bochuang Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-01-24
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2038-01-24
Also published as: CN108034770B

Abstract

本发明提供一种通过质谱法直接检测甲型流感病毒的多重PCR产物的方法，包括使用特定引物对病毒DNA进行多重PCR扩增，并通过MALDI‐TOF MS检测多重PCR产物的片段的大小。该方法可检测选自H7N9亚型甲型流感病毒。本发明还保护相关检测产品。本发明方法将多重PCR和MALDI‐TOF MS相结合用于临床病原微生物鉴定，不仅快速、简便，还易观察、直观、准确性高。

Description

质谱法检测甲型流感病毒H7N9多重PCR产物的方法及其产品

技术领域

本发明属于分子生物学检测的技术领域，涉及一种利用质谱特征峰图检测多重PCR产物的方法及其产品。本发明还涉及使用多重PCR扩增技术检测甲型流感的引物组和试剂盒。

背景技术

流行性感冒简称“流感”，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，具有突然爆发、迅速蔓延、波及面广的特点，主要通过咳嗽和打喷嚏传播。流感在人类历史上已存在很长时间，早在1580年就有了全球性流感记录。20世纪共爆发过四次：1918-1920年的西班牙流感(H1N1)，1957年的亚洲流感(H2N2)，1968年的我国香港地区流感(H3N2)和1977年的俄罗斯流感(H1N1再次爆发)。我国在近半个世纪以来(1953年至今)，共发生大中小规模的流感17次，其中2次为大流行。

引起流感的病毒是单链核糖核酸病毒，有球形及多形性，直径约80-100nm。也有细丝状的，直径可能就几微米大小。根据其核蛋白(NP)和基质蛋白(M)抗原性的不同被分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒具有很强的变异性，是引起人类、家畜及禽类流感流行的主要病毒。

甲型流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属，为有包膜分节段的单负链RNA病毒。其基因组由8个单股负链RNA片段组成，每个基因在3′末端和5′末端都带有12-13个保守核苷酸序列。这8个片段可编码10种蛋白，其中，8个蛋白(HA、NA、PB1、PB2、NP、M1、M2和PA)为结构蛋白，NS1和NS2为非结构蛋白，位于宿主细胞的胞质中。根据HA和NA抗原性的差异，甲型流感病毒可分为若干亚型，迄今已发现有18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。任何一对HA和NA均可组合成一个亚型，如H1N1、H3N2、H5N1和H7N9等。

甲型流感病毒能产生低保真RNA聚合酶。低保真RNA聚合酶可引起流感病毒的高突变率以及基因重组，可使流感病毒呈现分子多样性，使每个病毒亚型可进化为多个分支。甲型H1N1流感病毒由经典猪流感病毒、人H3N2型流感病毒、北美禽流感病毒在20世纪90年代后期经过“三重配”后再与北美猪群中流行的H3N2和H1N2猪流感病毒及Eurasia avian-like猪流感病毒重配后而产生，HA和NA抗原的持续变异是引起病毒流行的主要原因。同样地，在家禽市场中，H5N2也会出现持续的重组变异。2012年在西藏的鸡群中就分离到一株天然的H9N2和H5N1重组的H5N2亚型流感病毒。近期报道表明，对水禽长期使用某种药物会导致H5N2亚型流感病毒发生突变进而更易于感染人类。而2013年3月底在上海发现的新型禽流感H7N9病毒是由5个病毒经过4次重组产生，产生两个主要流行株A和B型。即由野鸟H7N9(NA节段)、浙江的H7N3病毒(HA节段)及北京、江苏、上海浙江的家禽H9N2病毒(除HA和NA节段外)重组而产生。由于RNA聚合酶缺乏校正和修复功能，每个核苷酸在复制周期中突变率极高。另外，流感病毒宿主种类繁多，而且分段基因组复制周期短，感染频率高，因此在复制过程中极易发生变异，产生新毒株或新的亚型变种，这种情况在甲型性流感病毒中表现最为突出。并且，这种快速而持续的变异，使得机体免疫系统不能对流感病毒产生长期的免疫力，从而导致流感的反复流行和难以控制。

流感的确诊需要实验室检查证实，目前较为常见的检测方法有病毒分离培养、病毒核酸检测、血清学检测、病毒抗原检测、基因芯片技术等。快速检测方法包括酶联免疫法(ELISA)、流感抗原快速检测试剂盒等、直接和间接免疫荧光法、基于PCR的方法、测序法、寡核苷酸微阵列芯片法和核酸扩增产物质谱检测法等。

目前国内外有一些针对人甲型流感筛查的商品化试剂盒，灵敏度、特异度较高，常见的主要为抗原检测试剂盒(胶体金法)和荧光定量PCR(双重或多重)这2种商品。目前市场上已出现大量利用多重荧光PCR和胶体金的试剂盒可检测一种流感病毒，对甲乙型流感进行分型。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，即Matrix-Assisted Laser DesorptionIonisation-Time-Of-Flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比。MALDI-TOF这种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定，不产生或产生较少的碎片离子。

Chou等([J].J Nanotechnology，2011，9:52)报道了联合使用抗体-磁珠和MALDI-TOFMS以提高对流感病毒检测的敏感性和特异性，该方法使用抗病毒单克隆抗体包被的磁珠作为特异性探针吸附病毒，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳提取蛋白质，然后采用MALDI-TOFMS测定其蛋白质构成，得出鉴定结论。此方法可在1h内完成流感病毒的诊断，适用于快速筛查和早期确诊，对流感病毒的预防，疫苗接种和早期治疗具有重要意义。然而，该方法涉及免疫处理，过程复杂，因此限制其大规模应用。

此外，使用MALDI质谱检测大分子核酸时，由于样品离子化程度弱，获得样品信号峰困难，因此，有关MALDI质谱检测大分子核酸的研究报道并不多。1994年，唐凯等报道了大分子核酸质谱检测的相关工作，他们使用MALDI质谱，成功检测到了片段大小为500bp的大分子核酸，该研究拓宽了MALDI质谱检测核酸样品的质量范围。

中国专利申请201210272533.6“建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品”，公开了一种基于质谱技术快速鉴定幽门螺杆菌的方法，包括PCR扩增、SAP酶消化、转录和核酸酶切、纯化、质谱仪检测等步骤。该方法利用飞行时间质谱技术，对分子量和丰度各异的核酸片段进行检测，并形成谱图。但是，该方法中核酸片段经PCR的单碱基延伸扩增后，还需经过SAP酶消化、转录和核酸酶切，仅能识别单个碱基的变化，无法检测有特征序列的长片段DNA。

此外，基于MALDI-TOF MS，开发了一些核酸检测方法，如美国Agena公司的hME和iPLEX方法，德国Bruker公司的GOOD assay方法，韩国GeneMatrix公司的RFMP方法。各公司为了提高质谱仪的分辨率，对目标位点进行检测倾向于检测分子量较小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通过对含单核苷酸多态性(SNP)位点的多重PCR产物进行限制性酶切，产生2000～4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测，而GOOD assay方法通过磷酸二酯酶(Phosphodiesterase，PDE)将含SNP位点的寡核苷酸片段切割成1000～2000Da左右的小片段进行检测。然而，以上方法，都不可避免地存在操作复杂，耗时长等问题。

此外，美国Sampath等([J].PLoS One，2007，2(5):e489)报道了将RT-PCR和电喷雾色谱相结合的技术(reverse transcription PCR/electrospray-ionization massspectrometry，RT-PCR/ESI-MS)。该方法可快速检测出92种哺乳类动物及禽类流感分离株，推断出30种不同的H及N型病毒(其中包括29种AIV H5N1分离株)，准确率高达97％，时间只要短短几小时。同时该技术可以检测混合感染的病毒样品且可用于病毒的各个亚型及未知核酸序列病毒新变异株的大规模检测。但该技术所需的质谱仪价格昂贵，目前还只局限于在少数的研究机构中使用。

中国专利申请200880121570、发明名称“用于诊断和监测精神疾病的方法和生物标志物”报道了可以通过MALDI-TOF质谱技术，检测包括流感病毒在内的近百种与精神疾病相关的生物肽。然而，该方法仅仅简单概括了各种可能的技术，其既没有报道具体方案，也没有报道流感病毒的特定靶点，因此难以教导研究者通过MALDI-TOF质谱技术来检测流感病毒。

因此，目前需要一种能够利用MALDI-TOF质谱技术来改进检测流感病毒的新方法。

发明内容

本发明原理之一在于首次将MALDI-TOF质谱与多重PCR联用，通过优化多重PCR体系，获得靶点扩增产物后，即可直接将扩增产物进行MALDI-TOF MS检测。更具体的说，本方法利用多重PCR特异性地扩增多个大小不同的寡核苷酸片段，利用不同的寡核苷酸片段在质谱分型过程中生成的不同的时间飞行质谱特征峰图，针对多重核酸扩增产物的多个目的基因片段同时进行检测。

本发明原理之二在于，在多重PCR体系优化过程中，通过对目标核酸的全序列进行分析，选取保守序列设计引物进行多重PCR扩增，并且针对PCR扩增结果对引物进行改进，最终选定对于特异性扩增有效的引物序列；为了区分大小相近的PCR产物，在引物中引入不影响PCR扩增的tag序列；将多重PCR产物经纯化后直接进行MALDI-TOF MS分析，从而成功实现了目标核酸的快速检测。

因此，本发明第一个目的是提供一种使用MALDI-TOF MS检测流感病毒多重PCR产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

使用经设计的引物组合对流感病毒DNA进行多重PCR扩增；

将多重PCR产物通过吸附柱进行纯化；

将纯化后的多重PCR产物点样于基质结晶上，通过MALDI-TOF MS检测多重PCR产物的片段的大小；其中，

所述流感病毒选自H1N1、H3N2、H5N1和/或H7N9亚型甲型流感病毒，以及任意两种以上的组合。

在一个实施方案中，所述引物组合为扩增H1N1亚型甲型流感病毒的H1片断的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H1片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物序列为SEQID NO.3和SEQ ID NO.4。

在另一实施方案中，所述引物组合为扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-1片断、N2片断的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H3-1片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；用于扩增甲型流感病毒N2片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

还在另一实施方案中，所述引物组合为扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-1片断、N2片断的特异性引物、扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H3-1片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；用于扩增甲型流感病毒N2片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，以及用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

在一个具体实施方案中，用于扩增H3-2片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；用于扩增甲型流感病毒N2片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10，以及用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4。

在其他的实施方案中，所述引物组合为扩增H5N1亚型甲型流感病毒的H5片断、N1片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H5片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.11和SEQID NO.12；用于扩增甲型流感病毒N1片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14。

在另一实施方案中，所述引物组合为扩增H7N9亚型甲型流感病毒的H7片断、N9片断的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H7片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、用于扩增甲型流感病毒N9片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，以及用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

上述任一实施方案中，其中所述引物组合可根据需要加入tag序列，使多重PCR产物的大小能够容易地由MALDI-TOF MS进行区分。在一个具体实施方案中，所述tag序列为ACGTTGGATG。在优选的实施方案中，扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-2片断、扩增H5N1亚型甲型流感病毒的N1片断，以及扩增H7N9亚型甲型流感病毒的N9片断的两个引物都含有tag序列。

上述任一实施方案中，其中在所述PCR扩增的反应体系25μl中含有：

每组引物0.5-1μl

dNTP与Taq酶预混物12.5μl

DNA模板1-3μl

余量为双蒸水。

在一个优选实施方案中，其中每组引物对的浓度控制在10-20μM之间。

在另一优选实施方案中，其中在PCR扩增反应程序为：94-95℃预变性5min；94-95℃变性30s，55-60℃退火30s，72-75℃延伸40-60s，进行35-45个循环；然后，72-75℃延伸5min。

在上述任一实施方案中，其中在所述MALDI-TOF MS检测中所使用的点样基质中含有甲酸。在一个具体实施方案中，在所述MALDI-TOF MS检测中所使用的点样基质的组成为，3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。

本发明第二目的是提供用于上述MALDI-TOF MS检测流感病毒的多重PCR产物的引物组合，其中该流感病毒选自H1N1、H3N2、H5N1和/或H7N9亚型甲型流感病毒，以及任意两种以上的组合，并且该引物组合包括，

用于扩增H1N1亚型甲型流感病毒的H1片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

用于扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-1片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；

用于扩增H3N2亚型甲型流感病毒N2片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQID NO.10；

用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4；

用于扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3-2片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQID NO.4。

用于扩增H5N1亚型甲型流感病毒的H5片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12；

用于扩增H5N1亚型甲型流感病毒的N1片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；

用于扩增H7N9亚型甲型流感病毒的H7片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；

用于扩增H7N9亚型甲型流感病毒的N9片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18；

以及用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

本发明第三个目的是提供用于上述质谱法(MALDI-TOF MS)检测流感病毒的多重PCR产物的质谱试剂盒，其中该流感病毒选自H1N1、H3N2、H5N1和/或H7N9亚型甲型流感病毒，以及任意两种以上的组合，并且该试剂盒包含上述用于扩增上述病毒的特异性引物组合、质谱专用点样基质。

在一个实施方案中，所述点样基质的组成为，3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。

在另一实施方案中，所述引物组合为扩增H1N1亚型甲型流感病毒的H1片断的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H1片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

在另一实施方案中，所述引物组合为扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3片断、N2片断的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H3-1片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；用于扩增甲型流感病毒N2片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

还在另一实施方案中，所述引物组合为扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3片断、N2片断的特异性引物、扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H3-1片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；用于扩增甲型流感病毒N2片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10，以及用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

上述任一实施方案中，其中所述引物组合可根据需要加入tag序列，使多重PCR产物的大小能够容易地由MALDI-TOF MS进行区分。在一个具体实施方案中，所述tag序列为ACGTTGGATG。在优选的实施方案中，扩增H3N2亚型甲型流感病毒的H3片断、扩增H5N1亚型甲型流感病毒的N1片断，以及扩增H7N9亚型甲型流感病毒的N9片断的两个引物都含有tag序列。

每组引物0.5-1μl

dNTP与Taq酶预混物12.5μl

DNA模板1-3μl

余量为双蒸水。

在上述任一实施方案中，所述试剂盒还包括质谱专用微阵列芯片、质谱内标标准品、质谱外标标准品。

在上述任一实施方案中，其中所述试剂盒是用于检测一种或多种甲型流感病毒的试剂盒。

技术效果

本发明首次实践了将多重PCR产物纯化后直接应用于MALDI-TOF MS并成功分离多重PCR产物的方法，与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明首次提出利用多重PCR结合临床质谱实现对流感病毒的多重检测，具有极高的生物学价值。除上述的临床意义之外，此项研究还将在病毒学研究领域为以流感病毒为代表的RNA病毒提供新的方法，并为发现复杂多变的新型病毒提供研究方法和线索。

2、本发明检测甲型流感病毒快速方便，一次性上机就可以同时完成多个样品多个亚型的甲型流感病毒核酸检测；成本低，内含甲型病毒各个亚型的特异性引物，无需设计合成探针即可完成鉴定；选择性多，既可以单重检测引物，也可以双重以及多重检测引物。

3、本发明的引物组合特异性好，扩增效率高，可以很好地应用于多重PCR产物的扩增，并且，多重PCR产物经纯化后可以直接通过MALDI-TOF MS对纯化的多重PCR产物进行检测。通过MALDI-TOF MS准确快速地检测多重PCR产物，可以避免临床上因诊断不及时而延误病情。

4、在进行检测分析时，若2重PCR产物质谱检测出预期的两个峰信号则表明检测到目标DNA；若3重PCR产物质谱检测出预期的三个峰信号则表明检测到目标DNA。可以通过目标产物的大小对检测结果进行进一步的确认。检测结果通过质谱图可以容易地观测到，操作方便快捷。即使是没有受过特别训练的非专业人员，也可以在说明书的指导下成功实施本发明的检测方法。

5、本发明除了具有较强的可操作性、提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度之外，本发明实施的多重PCR是在同一个PCR体系中完成，节约了样本DNA以及PCR扩增体系各试剂特别是Taq的使用量，大大降低了检测成本，可广泛应用于临床多种传染性疾病的快速诊断。

6、另外，本发明可用于检测有特征序列的长片段DNA而非识别单个碱基的变化，能够实现最大能够检测到长度为600bp的单链信号峰，拓宽了MALDI-TOF MS检测核酸样品的质量范围，使得质谱检测大分子核酸样品成为可能。同时，该方法克服了多管增加污染的概率，简化了操作，可同时检测多个样本，缩短了检测时间，保持了检测灵敏度和特异性，在临床具有较高的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2中Clin-ToF-Ⅱ检测H1N1的H1和M的2重PCR产物结果图。

图2为本发明实施例3中Clin-ToF-Ⅱ检测H3N2的H3-1、N2和M的3重PCR产物结果图。

图3为本发明实施例4中Clin-ToF-Ⅱ检测H3N2的H3-2、N2和M的3重PCR产物结果图。

图4为本发明实施例5中Clin-ToF-Ⅱ检测H5N1的H5和N1的2重PCR产物的结果图。

图5为本发明实施例6中Clin-ToF-Ⅱ检测H7N9的H7、N9和M的3重PCR产物的结果图。

图6为对照实施例针对实施例2的PCR扩增结果的电泳图。

图7为对照实施例针对实施例6的PCR扩增结果的电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件实施。

需特别指出的是，尽管本发明的实施例中呈现的是50,000Da以下多重PCR产物的质谱检测数据，但50,000-100,000Da之间的多重PCR产物也可检测到，因此应用本发明对50,000-100,000Da之间的多重PCR产物质谱检测也包括在本发明所要求的权利范围之内。

实施例1.引物设计

为了检测甲型流感病毒，共搜集了H1N1、H3N2、H5N1和H7N9这4种常见亚型的甲型流感病毒的下述9个核酸序列。提取病毒RNA，针对目的检测区段(M、H1、H3、H5、H7、N1、N2、N9等)设计反转录引物，并把这些片段反转录为cDNA后，连接到质粒载体PmdTM19-T SimpleVector上进行转化，合成了分别包含该9个核酸序列的9个质粒。

经鉴定后提取质粒DNA，利用NanoDrop ND-2000核酸检测仪测量质粒DNA的浓度，确定DNA的拷贝数作为敏感度的标准品定量母液。

在以下序列中，将本发明选取的引物所对应的序列以下划线表示。

(1)H1N1的H1片段

Influenza A virus(A/canine/Beijing/cau9/2009(H1N1))segment 4hemagglutinin(HA)gene,partial cds

GenBank:JN540094.1

AGTGAGGGATCACGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTAGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAACATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTTGGGGCCATTGCCGGT

引物序列来源：几种甲型H1N1流感病毒SYBR Green I荧光RT-PCR检测方法的验证，《口岸卫生控制》，2013，18(6)，28-33

(2)H3N2的H3片段

①Influenza A virus(A/JiangxiDonghu/110.44/2010(H3N2))segment 4hemagglutinin(HA)gene,partial cds

GenBank:KR870226.1

CAACAGGTAAAATATGCGACAGTCCTCATCAGATCCTTGATGGAAAAAACTGCACACTAATAGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGATGGCTTCCAAAATAAGAAATGGGACCTTTTTGTTGAACGCAGCAAAGCCTACAGC AACTGTTACCCTTATGATGTGCCGGATTATGCCTCCCTTAGGTCACTAGTTGCCTCATCCGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGACTGGAGTCACTCAAAACGGAACAAGCTCTGCTTGCATAAGGGGATCTAAAAACAGTTTCTTTAGTAGATTGAATTGGTTGACCCACTTAAACTTCAAATACTCAGCATT

引物序列来源：五重荧光定量RT-PCR检测甲型流感病毒方法的建立和应用及2010-2013年杭州地区人H3N2病毒流行病学分析，浙江大学医学院硕士学位论文(2015)，临床检验诊断学

②Influenza A virus(A/chicken/Ganzhou/GZ157/2016(H3N2))segment 4hemagglutinin(HA)gene,complete cds

GenBank:KY415634.1

CACAAATGTGACAATGTTTGCATAGAGTCAATTAGAAATGGGACTTATGACCATGACGTATACAGGGATGAGGCATTGAACAACCGGTTCCAAATCAAAGGTGTTGAGCTAAAATCTGGGTACAAAGACTGGATCCTGTGGATTTCCTTTGCCATATCATGCTTTTTGCTTTGTGTTGTTTTGCTGGGGTTCATTATGTGGGCCTGCCAGAGAGGCAACATTAGGTGCAACATTTGCATTTGAGTATACTAATAATTAAAAACACCCTTGTTTCTACT

引物序列来源：H3N2亚型禽流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立，动物医学进展，2015，36(9)：28-32

(3)H3N2的N2片段

Influenza A virus(A/blue-winged teal/Guatemala/CIP049H108-45/2012(H3N2))segment 6 neuraminidase(NA)gene,complete cds

GenBank:KY644439.1

ACGCTGAACAACAAACACTCAAACGGTACAATACATGATAGGATCCCACACCGGACCCTTTTAATGAGTGAATTGGGTGTTCCGTTTCATTTGGGAACCAAACAAGTGTGCATAGCATGGTCCAGCTCAAGTTGCCATGATGGGAAAGCATGGTTGCATGTCTGTGTCACTGGGGATGATAGAAATGCAACTGCTAGTTTCATTTATGATGGGATGCTTGTTGACAGTATTGGTTCATGGTCTCAAAATATCCTCAGGACTCAGGAGTCAGAATGTGTTTCTATCATCCCCAGTGACACAG

(4)通用M片段(除H5N1外)

Influenza A virus(A/Fujian/S03/2015(H7N9))segment 7 matrix protein 2(M2)and matrix protein 1(M1)genes,complete cds

GenBank:KY286430.1

>KY286430.1Influenza A virus(A/Fujian/S03/2015(H7N9))segment 7matrixprotein 2(M2)and matrix protein 1(M1)genes,complete cds

CGCGCAGAGACTTGAGGATGTTTTTGCAGGGAAGAACGCAGATCTTGAGGCTCTCATGGAGTGGATAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGGTTTGTGTTCACGCTCACCGTGCCCAGTGAGCGAGGACTGCAGCGTAGACGGTTTGTTCAAAACGCCCTAAATGGGAATGGAGACCCAAACAACAT

引物序列来源：五重荧光定量RT-PCR检测甲型流感病毒方法的建立和应用及2010-2013年杭州地区人H3N2病毒流行病学分析，浙江大学医学院硕士学位论文(2015)，临床检验诊断学，戴玉柱，导师：陈瑜

(5)H5N1的H5片段

Influenza A virus(A/bar-headed goose/Qinghai/13/2008(H5N1))segment 4hemagglutinin(HA)gene,complete cds

GenBank:FJ602828.1

CATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAAATGGAGTAAAGCCTCTCATTATGAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCTATGTGTGACGAATTCACCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAG TGGAGAAGGCCAGTCCAGCCAATGACCTCTGTTACCCAGGGGATTTCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCAA

引物序列来源：建立实时荧光定量PCR技术检测H5N1亚型高致病力禽流感病毒，中华检验医学杂志，2009，32(1)：68-71

(6)H5N1的N1片段

Influenza A virus(A/chicken/France/150169a/2015(H5N1))segment 6neuraminidase(NA)gene,complete cds

GenBank:KU310449.1

TCTATTGAATGACAAACACTCCAATGGGACCGTCAAAGATAGAAGCCCCTACAGAACTTTGATGAGTTGTCCCGTGGGTGAGGCTCCTTCCCCATACAATTCAAGATTTGAGTCTGTTGCTTGGTCGGCAAGTGCCTGTCATGATG GCATCAATTGGTTGACAATCGGGATTTCTGGTCCAGACAATGGGGCTGTGGCTGTATTGAAGTACAATGGCATAATAACGGACACTATCAAGAGTTGGAGAAATAACATTTTGAGGACTCAAGAATCTGAGT

(7)H7N9的H7片段

Influenza A virus(A/Qingyuan/GIRD01/2017(H7N9))segment 4hemagglutinin(HA)gene,complete cds

GenBank:KY621542.1

GATTCACATACAATGGAATAAGAACTAATGGGGTGACCAGTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAAATGAAATGGCTCCTGTCAAACACAGATAATGCTGCATTCCCGCAGATGACTAAGTCATATAAAAATACA AGAGAAAGCCCAGCTATAATAGTATGGGGGATCCATCATTCCGTTTCAACTGCAGAGCAAACCA

引物序列来源：H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立，中国农业科学，2015，48(15)：3050-5

(8)H7N9的N9片段

Influenza A virus(A/chicken/Ganzhou/GZ79/2016(H7N9))segment 6neuraminidase(NA)gene,complete cds

GenBank:KY415729.1

ATATTATTTCAAAGAGGGAAAAATATTGAAATGGGAGTCTCTGACAGGAACTGCCAAGCATATTGAGGAATGCTCATGTTACGGGGAACGAACAGGAATTACTTGCACATGTAGAGACAATTGGCAGGGCTCAAATAGACCAGTAATTCAAATAGATCCAGTGGCAATGACACACACTAGTCAGTATATATGCAGTCCTGTTCTCACAGACAATCCCCGACCGAATGACCCAAATGTAGGTAAGTGTAACGATCCTTATCCAGGTAATAATAACAATGGAGTCAAAGGGTTCTCATACCTGGATGGGGTTAACACGTGGCTAGGGAGGACAATAAGCACAGCTTCGAGGTCTGGATATGAGATGCTAAAAGTGCCAAATGCATTGACAGATGATAGATCAAAGCCCATTCAAGGTC

引物来自于目标DNA的保守序列，可选地根据需要加入tag序列，使多重PCR产物的大小能够容易地由MALDI-TOF MS进行区分。

每个质粒对应的特异性PCR引物信息如表1。

其中H3-2、N1和N9的引物均附加了10bp的tag序列ACGTTGGATG，该序列为Agena验证的对PCR扩增无影响的一段很稳定的序列。其中，需要说明的是，甲型流感病毒的M片段特异性引物为甲型流感病毒通用引物。

表1.引物信息表

实施例2.H1N1亚型甲型流感病毒的2重PCR扩增

1.合成H1N1亚型甲型流感病毒的H1和M两个片段的质粒，并设计与其保守序列对应的特异性引物，质粒、特异性引物全部由上海捷瑞生物工程有限公司合成。质粒配成10ng/μL的工作液，引物配成10μM的工作液。如表1所示，使用下述引物对。

第一引物对H1：

上游引物：

SEQ ID NO.1：5′-TGCTGGATCTGGTATTATC-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.2：5′-TGGGAGGCTGGTGTTTATAG-3′；

第二引物对M：

上游引物：

SEQ ID NO.3：5′-GGCGTTTTGAACAAACCGTC-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.4：5′-CAATCCTGTCACCTCTGACT-3′。

2.PCR扩增

1)PCR反应体系的组成如下：

第一引物对1μl

第二引物对1μl

dNTP与Taq酶预混物12.5μl

质粒H1 1μl

质粒M 1μl

双蒸水8.5μl

引物浓度在10-20μM之间。

2)PCR扩增反应程序如下：

使用SMART PCR仪对DNA进行扩增，95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行45个循环，最后72℃延伸5min。

实施例3.H3N2的3重PCR扩增

1.合成H3N2亚型甲型流感病毒的H3、N2和M三个片段的质粒，并设计与其保守序列对应的特异性引物，质粒、特异性引物全部由上海捷瑞生物工程有限公司合成。质粒配成10ng/μL的工作液，引物配成10μM的工作液。如表1所示，使用下述引物对。

第一引物对H3-1：

上游引物：

SEQ ID NO.5：5′-CCGGATGAGGCAACTAGTGA-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.6：5′-GCAGCAAAGCCTACAGCAAC-3′；

第二引物对N2：

上游引物：

SEQ ID NO.9：5′-TATCATCCCCAGTGACACAG-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.10：5′-TGGGAACCAAACAAGTGTGC-3′；

第三引物对M：

上游引物：

SEQ ID NO.3：5′-GGCGTTTTGAACAAACCGTC-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.4：5′-CAATCCTGTCACCTCTGACT-3′。

2.PCR扩增

1)PCR反应体系的组成如下：

第一引物对0.5μl

第二引物对0.5μl

第三引物对0.5μl

dNTP与Taq酶预混物12.5μl

质粒H3 1μl

质粒N2 1μl

质粒M 1μl

双蒸水8μl

引物浓度在10-20μM之间。

2)PCR扩增反应程序如下：

实施例4.使用带有tag的引物的H3N2的3重PCR扩增

第一引物对H3-2：

上游引物：

SEQ ID NO.7：5′-ACGTTGGATGGGTGTTGAGCTAAAATCTGG-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.8：5′-ACGTTGGATGGAACCCCAGCAAAACAACAC-3′；

第二引物对N2：

上游引物：

SEQ ID NO.9：5′-TATCATCCCCAGTGACACAG-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.10：5′-TGGGAACCAAACAAGTGTGC-3′；

第三引物对M：

上游引物：

SEQ ID NO.3：5′-GGCGTTTTGAACAAACCGTC-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.4：5′-CAATCCTGTCACCTCTGACT-3′。

2.PCR扩增

1)PCR反应体系的组成如下：

第一引物对0.5μl

第二引物对0.5μl

第三引物对0.5μl

dNTP与Taq酶预混物12.5μl

质粒H3 1μl

质粒N2 1μl

质粒M 1μl

双蒸水8μl

引物浓度在10-20μM之间。

2)PCR扩增反应程序如下：

实施例5.H5N1的2重PCR扩增

1.合成H5N1亚型甲型流感病毒的H5和N1两个片段的质粒，并设计与其保守序列对应的特异性引物，质粒、特异性引物全部由上海捷瑞生物工程有限公司合成。质粒配成10ng/μL的工作液，引物配成10μM的工作液。如表1所示，使用下述引物对。

第一引物对H5：

上游引物：

SEQ ID NO.11：5′-GGCCTTCTCCACTATGTAAG-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.12：5′-TGGCTCCTCGGAAACCCTAT-3′；

第二引物对N1：

上游引物：

SEQ ID NO.13：5′-ACGTTGGATGTTGATGCCATCATGACAGG-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.14：5′-ACGTTGGATGGAGGCTCCTTCCCCATACAA-3′。

2.PCR扩增

1)PCR反应体系的组成如下：

第一引物对1μl

第二引物对1μl

dNTP与Taq酶预混物12.5μl

质粒H5 1μl

质粒N1 1μl

双蒸水8.5μl

引物浓度在10-20μM之间。

2)PCR扩增反应程序如下：

实施例6.H7N9的3重PCR扩增

1.合成H7N9甲流病毒的H7、N9和M片段的质粒，并设计与其保守序列对应的特异性引物，质粒、特异性引物全部由上海捷瑞生物工程有限公司合成。质粒配成10ng/μL的工作液，引物配成10μM的工作液。如表1所示，使用下述引物对。

第一引物对H7：

上游引物：

SEQ ID NO.15：5′-GCTGGGCTTTCTCTTGTATT-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.16：5′-GAAATGAAATGGCTCCTGTC-3′；

第二引物对N9：

上游引物：

SEQ ID NO.17：5′-ACGTTGGATGCAATGACACACACTAGTCAG-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.18：5′-ACGTTGGATGACCTGGATAAGGATCGTTAC-3′；

第三引物对M：

上游引物：

SEQ ID NO.3：5′-GGCGTTTTGAACAAACCGTC-3′，

下游引物：

SEQ ID NO.4：5′-CAATCCTGTCACCTCTGACT-3′。

2.PCR扩增

1)PCR反应体系：

第一引物对1μl

第三引物对1μl

第四引物对1μl

dNTP与Taq酶预混物12.5μl

质粒M 1μl

质粒H7 1μl

质粒N9 1μl

双蒸水6.5μl

引物浓度在10-20μM之间。

2)扩增反应程序：

使用SMART PCR仪对DNA进行扩增，95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，进行45个循环，最后72℃延伸5min；

实施例7.多重PCR产物的纯化

将多重PCR产物通过DNA吸附柱进行纯化以去除样品内的盐离子和金属离子。多重PCR产物的纯化使用Zymo-DNA纯化浓缩试剂盒，可以按照如下操作进行：

按照DNA Binding Buffer∶多重PCR产物＝5∶1的体积比向多重PCR产物中加入Binding Buffer后混匀；将上述混合液转移至吸附柱，吸附柱于收集管内，使用离心机10,000g离心30s，弃掉废液；加200μl DNA Wash Buffer于吸附柱中，使用离心机10,000g离心30s，重复该洗涤1次；加≥6μl的ddH₂O于吸附柱中，室温放置1min后转移至新的1.5ml离心管中10,000g离心30s获得纯化后的产物。

按照上述操作步骤操作即可完成质谱检测所需的纯化后的多重PCR产物。

实施例8.质谱检测

将上述多重PCR产物进行纯化后使用临床飞行时间质谱Clin-TOF-Ⅱ(MALDI-TOFMS)质谱仪进行检测，点样基质的组成为，3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。点样基质中，所使用的3-HPA和DHC浓度分别为60mg/ml和25mg/ml，溶剂均为40％的乙腈水溶液，所使用的甲酸纯度大于98％。基质点样体积为1.5μl/孔，样品的上样体积为1μl/孔。

使用含甲酸的点样基质能够检测到目标信号。如果使用不含甲酸的点样基质(3-HPA∶DHC＝4∶2)，则基本检测不到信号，说明甲酸的添加能够辅助目标信号的检测。

质谱的具体检测结果参见图1至图5。

图1为本发明实施例2(H1N1)中MALDI-TOF MS检测的图谱。点样基质为3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。图1显示，实施例2(H1N1)的多重PCR产物在29,286Da和31,500Da处检测到峰信号。

图2为本发明实施例3(H3N2)中MALDI-TOF MS检测的图谱。点样基质为3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。图2显示，实施例3(H3N2)的多重PCR产物在25,092Da、28,325Da和31,868Da处检测到峰信号。

图3为本发明实施例4(H3N2)中MALDI-TOF MS检测的图谱。点样基质为3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。图3显示，实施例4(H3N2)的多重PCR产物在28,077、31,729Da和36,375Da处检测到峰信号。

图4为本发明实施例5(H5N1)中MALDI-TOF MS检测的图谱。点样基质为3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。图4显示，实施例5(H5N1)的多重PCR产物在22,799Da和29,490Da处检测到峰信号。

图5为本发明实施例6(H7N9)中MALDI-TOF MS检测的图谱。点样基质为3-HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。图5显示，实施例6(H7N9)的多重PCR产物在27,072Da、31,740Da和38,075Da处检测到峰信号。

为检测多重PCR产物在MALDI-TOF MS上的灵敏度，将不同片段大小的多重PCR产物进行稀释，结果表明MALDI-TOF MS的检测下限(灵敏度)为305fmol的多重PCR产物(单链)及152fmol的多重PCR产物(双链)。

工业实用性

本发明是将多重核酸扩增产物直接进行质谱检测的方法，更具体的说，本方法利用不同的寡核苷酸片段在质谱分型过程中生成的不同的时间飞行质谱特征峰图，针对多重核酸扩增产物的多个目的基因片段同时进行检测。本检测方法操作简便，检测效率高，且该检测方法具有很高的敏感性、准确性以及应用性，可良好的用于临床多种感染性疾病的鉴定，适于大范围推广应用。本方法能够减少污染的概率，缩短检测时间，保持检测灵敏度和特异性，在临床上具有较高的应用前景。

对照实施例：多重PCR扩增产物的电泳结果

根据本发明的方法，依照实施例1-8中所描述的操作步骤，对上述实施例2和6的扩增结果进行纯化和电泳检测，步骤如下：

按照DNA Binding Buffer：PCR产物＝5：1的体积比往PCR产物中加入BindingBuffer后混匀；

将上述混合液转移至吸附柱，吸附柱于收集管内，10,000g离心30s，弃掉废液；加200μL DNAWash Buffer于吸附柱中，10,000g离心30s，重复该洗涤1次；加≥6μL的ddH₂O于吸附柱中，室温放置1min后转移至新的1.5mL离心管中10,000g离心30s，获得纯化后的产物。

取反应产物5μl加在1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml EB)板上，在TAE电泳液中电泳观察结果。

电泳结果显示，实施例2的2重PCR扩增产物中，扩增出94bp和101bp的两条条带，经过和表1进行比较，判断该片段为H1片段和M片段，见图6。

实施例6的3重PCR扩增产物中，扩增出86bp、101bp和121bp的3条带，经过和表1进行比较，判断该片段为H7片段、N9和M片段，见图7。

由此可见，本发明质谱法既能对多重PCR的产物进行准确定量，同时由能联合多重PCR方法快速获得检测结果，而避免了小分子片段电泳时间过长、分辨率低的缺点。

序列表

<110> 北京毅新博创生物科技有限公司

<120> 质谱法检测甲型流感病毒H7N9多重PCR产物的方法及其产品

<130> DEOM

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctggatct ggtattatc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tgggaggctg gtgtttatag 20

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgttggatg ggtgttgagc taaaatctgg 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgttggatg gaaccccagc aaaacaacac 30

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatcatcccc agtgacacag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgggaaccaa acaagtgtgc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggccttctcc actatgtaag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggctcctcg gaaaccctat 20

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgttggatg ttgatgccat catgacagg 29

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgttggatg gaggctcctt ccccatacaa 30

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctgggcttt ctcttgtatt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gaaatgaaat ggctcctgtc 20

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgttggatg caatgacaca cactagtcag 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgttggatg acctggataa ggatcgttac 30

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggcgttttga acaaaccgtc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caatcctgtc acctctgact 20

<210> 17

<211> 349

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 17

agtgagggat cacgaaggga gaatgaacta ttactggaca ctagtagagc cgggagacaa 60

aataacatta gaagcaactg gaaatctagt ggtaccgaga tatgcattcg caatggaaag 120

aaatgctgga tctggtatta tcatttcaga tacaccagtc cacgattgca atacaacttg 180

tcagacaccc aagggtgcta taaacaccag cctcccattt cagaatatac atccgatcac 240

aattggaaca tgtccaaaat atgtaaaaag cacaaaattg agactggcca caggattgag 300

gaatgtcccg tctattcaat ctagaggcct atttggggcc attgccggt 349

<210> 18

<211> 352

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 18

caacaggtaa aatatgcgac agtcctcatc agatccttga tggaaaaaac tgcacactaa 60

tagatgctct attgggagac cctcagtgtg atggcttcca aaataagaaa tgggaccttt 120

ttgttgaacg cagcaaagcc tacagcaact gttaccctta tgatgtgccg gattatgcct 180

cccttaggtc actagttgcc tcatccggca cactggagtt taacaatgaa agcttcaatt 240

ggactggagt cactcaaaac ggaacaagct ctgcttgcat aaggggatct aaaaacagtt 300

tctttagtag attgaattgg ttgacccact taaacttcaa atactcagca tt 352

<210> 19

<211> 278

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 19

cacaaatgtg acaatgtttg catagagtca attagaaatg ggacttatga ccatgacgta 60

tacagggatg aggcattgaa caaccggttc caaatcaaag gtgttgagct aaaatctggg 120

tacaaagact ggatcctgtg gatttccttt gccatatcat gctttttgct ttgtgttgtt 180

ttgctggggt tcattatgtg ggcctgccag agaggcaaca ttaggtgcaa catttgcatt 240

tgagtatact aataattaaa aacacccttg tttctact 278

<210> 20

<211> 301

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 20

acgctgaaca acaaacactc aaacggtaca atacatgata ggatcccaca ccggaccctt 60

ttaatgagtg aattgggtgt tccgtttcat ttgggaacca aacaagtgtg catagcatgg 120

tccagctcaa gttgccatga tgggaaagca tggttgcatg tctgtgtcac tggggatgat 180

agaaatgcaa ctgctagttt catttatgat gggatgcttg ttgacagtat tggttcatgg 240

tctcaaaata tcctcaggac tcaggagtca gaatgtgttt ctatcatccc cagtgacaca 300

g 301

<210> 21

<211> 279

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 21

catactggaa aagacacaca acgggaagct ctgcgatcta aatggagtaa agcctctcat 60

tatgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac cctatgtgtg acgaattcac 120

caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt ccagccaatg acctctgtta 180

cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta ttgagcagaa taaaccattt 240

tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccaa 279

<210> 22

<211> 278

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 22

tctattgaat gacaaacact ccaatgggac cgtcaaagat agaagcccct acagaacttt 60

gatgagttgt cccgtgggtg aggctccttc cccatacaat tcaagatttg agtctgttgc 120

ttggtcggca agtgcctgtc atgatggcat caattggttg acaatcggga tttctggtcc 180

agacaatggg gctgtggctg tattgaagta caatggcata ataacggaca ctatcaagag 240

ttggagaaat aacattttga ggactcaaga atctgagt 278

<210> 23

<211> 210

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 23

gattcacata caatggaata agaactaatg gggtgaccag tgcatgtagg agatcaggat 60

cttcattcta tgcagaaatg aaatggctcc tgtcaaacac agataatgct gcattcccgc 120

agatgactaa gtcatataaa aatacaagag aaagcccagc tataatagta tgggggatcc 180

atcattccgt ttcaactgca gagcaaacca 210

<210> 24

<211> 416

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 24

atattatttc aaagagggaa aaatattgaa atgggagtct ctgacaggaa ctgccaagca 60

tattgaggaa tgctcatgtt acggggaacg aacaggaatt acttgcacat gtagagacaa 120

ttggcagggc tcaaatagac cagtaattca aatagatcca gtggcaatga cacacactag 180

tcagtatata tgcagtcctg ttctcacaga caatccccga ccgaatgacc caaatgtagg 240

taagtgtaac gatccttatc caggtaataa taacaatgga gtcaaagggt tctcatacct 300

ggatggggtt aacacgtggc tagggaggac aataagcaca gcttcgaggt ctggatatga 360

gatgctaaaa gtgccaaatg cattgacaga tgatagatca aagcccattc aaggtc 416

<210> 25

<211> 207

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 25

cgcgcagaga cttgaggatg tttttgcagg gaagaacgca gatcttgagg ctctcatgga 60

gtggataaag acaagaccaa tcctgtcacc tctgactaag gggattttag ggtttgtgtt 120

cacgctcacc gtgcccagtg agcgaggact gcagcgtaga cggtttgttc aaaacgccct 180

aaatgggaat ggagacccaa acaacat 207

Claims

1.一种质谱法检测流感病毒多重PCR产物的方法，包括如下步骤：

使用经设计的引物组合对流感病毒DNA进行多重PCR扩增；

将多重PCR产物通过吸附柱进行纯化；

将纯化后的多重PCR产物点样于基质结晶上，通过MALDI‐TOF MS检测多重PCR产物的片段的大小；其中，

所述引物组合为扩增H7N9亚型甲型流感病毒的H7片断、N9片断的特异性引物与扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的组合，其中用于扩增H7片断的特异性引物序列为SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16、用于扩增甲型流感病毒N9片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18，以及用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4。

2.权利要求1的方法，其中所述引物组合可根据需要加入tag序列ACGTTGGATG，使多重PCR产物的大小能够容易地由质谱法进行区分。

3.权利要求1‐3任一所述的方法，其中在所述PCR扩增的反应体系25μl中含有：

每组引物0.5‐1μl，浓度控制在10‐20μM之间

dNTP与Taq酶预混物12.5μl

DNA模板1‐3μl

余量为双蒸水。

4.权利要求3的方法，其中在PCR扩增反应程序为：94‐95℃预变性5min；94‐95℃变性30s，55‐60℃退火30s，72‐75℃延伸40‐60s，进行35‐45个循环；然后，72‐75℃延伸5min。

5.权利要求1‐4任一所述的方法，其中在所述质谱法检测中所使用的点样基质组成为，3‐HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。

6.用于权利要求1‐5任一方法的引物组合物，该引物组合物包括，

用于扩增H7N9亚型甲型流感病毒的H7片断的特异性引物序列为SEQ ID NO.15和SEQID NO.16；和，用于扩增H7N9亚型甲型流感病毒的N9片断的特异性引物序列为SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18；以及，以及用于扩增甲型流感病毒M片断的特异性引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

7.权利要求8的引物组合物，其中所述引物组合可根据需要加入tag序列ACGTTGGATG，使多重PCR产物的大小能够容易地由质谱法进行区分。

8.用于质谱法检测流感病毒的多重PCR产物的试剂盒，包含权利要求6‐7所述的引物组合物，以及用于质谱检测中所使用的点样基质，其中点样基质的组成为，3‐HPA∶DHC∶甲酸＝4∶2∶1。

9.权利要求8的试剂盒，其中在所述PCR扩增的反应体系25μl中含有：

每组引物0.5‐1μl，浓度控制在10‐20μM之间

dNTP与Taq酶预混物12.5μl

DNA模板1‐3μl

余量为双蒸水。

10.权利要求8或9的试剂盒，其中包括质谱专用微阵列芯片、质谱内标标准品、质谱外标标准品。