CN112691094A

CN112691094A - 防治病毒的新型化合物及其应用

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Publication number: CN112691094A
Application number: CN201911005611.4A
Authority: CN
Inventors: 王红艳; 魏滨; 肖俊; 李伟芸
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS; University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS; University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2039-10-22
Also published as: CN112691094B

Abstract

本发明提供了一种防治病毒的新型化合物及其应用。揭示了7‑脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或其上游代谢物7‑脱氢胆固醇对于抑制病毒具有非常优异的效果。并且，所述的7‑脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7‑脱氢胆固醇可促进细胞中I型干扰素IFN‑β表达。本发明提供了抵抗多种病毒感染的新途径，具有良好的应用前景。

Description

防治病毒的新型化合物及其应用

技术领域

本发明属于药物学领域，更具体地，本发明涉及一种7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)的抑制剂AY9944以及上游的产物7-脱氢胆固醇(7-DHC)在预防或治疗病毒感染中的应用。

背景技术

人类或者家禽的病毒性感染十分普遍，尤其是在第三世界国家，由于生活水平低下，卫生状况较差，病毒性感染往往呈爆发趋势。如最近几年引起人们恐慌的寨卡病毒和埃博拉病毒等，尚缺乏很好的药物或疫苗来抵御这些病毒引起的各种疾病。病毒性感染可以通过呼吸道、消化道、皮肤粘膜、眼及泌尿生殖器和胎盘传播。一旦病毒感染，如果不能得到及时有效控制，可能会引起死亡及遗留后遗症。如巨细胞病毒、风疹病毒等可通过胎盘感染胎儿，造成先天性感染，引起死胎、流产、早产及先天性畸形，是当前优生学研究的重要课题。此外，病毒感染与肿瘤的发生也有关，如原发性肝癌与乙肝病毒感染有关，子宫颈癌与HPV感染有关等。

病毒在长期进化的过程中，其感染能力、传播能力以及适应能力都会变得越来越强，包括少量的病毒就能够成功的感染宿主；通过较容易的方式(比如空气中的气溶胶)在宿主间播散；对宿主的包容度高，自然宿主种类多；此外，病毒还会进化出抵抗宿主天然免疫防御的能力，从而逃避宿主对其清除。如最近报道的关于寨卡病毒暴发流行的一种新机制，寨卡病毒NS 1蛋白上的一个位点突变有效抑制了宿主产生干扰素，使病毒成功逃逸宿主天然免疫，导致病毒的致病性得以增强。

因此，本领域还需要进一步开发防治病毒感染的物质，以更有效地应用于临床制药或必要时的环境中病毒的灭杀、消除，从而降低或避免病毒的感染。

发明内容

本发明的目的在于提供一种7-脱氢胆固醇还原酶(DHCR7)的抑制剂AY9944以及上游的产物7-脱氢胆固醇(7-DHC)在预防或治疗病毒感染中的应用。

在本发明的第一方面，提供7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇的用途，用于：制备预防、缓解或治疗病毒感染的组合物；制备抑制病毒的组合物；或制备促进I型干扰素IFN-β表达的组合物。

在一个优选例中，所述的抑制病毒为体内抑制病毒或体外抑制病毒。

在另一优选例中，所述的7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944还用于制备促进细胞内胆固醇前体7-DHC累积、减少下游胆固醇含量的组合物。

在另一优选例中，所述的病毒包括：DNA病毒或RNA病毒。

在另一优选例中，所述的病毒为能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒。

在另一优选例中，所述的病毒包括：寨卡病毒，甲型流感病毒，水疱性口炎病毒，巨细胞病毒。

在另一优选例中，所述的7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇通过促进I型干扰素IFN-β表达而抑制病毒。

在另一优选例中，所述的7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇通过抑制病毒的复制而抑制病毒。

在另一优选例中，所述的7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇通过抑制病毒的感染能力而抑制病毒。

在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物中，所述7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇与药学上可接受的载体混合。

在本发明的另一方面，提供一种体外非治疗性抑制病毒的方法，包括：以7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇处理感染病毒的对象。

在一个优选例中，所述的对象包括：感染病毒的细胞或细胞培养物，含有病毒的场所、容器、器物(等)。

在另一优选例中，所述的病毒包括：DNA病毒或RNA病毒；较佳地，所述的病毒为能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒；更佳地，所述的病毒包括：寨卡病毒，甲型流感病毒，水疱性口炎病毒，巨细胞病毒。

在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，该药物组合物含有7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇，至少一种有利于预防或治疗病毒感染的辅助药剂以及药学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种制备药物组合物的方法，所述组合物用于预防、缓解或治疗病毒感染，制备抑制病毒或制备促进I型干扰素IFN-β表达；所述方法包括：将7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇、至少一种有利于预防或治疗病毒感染的辅助药剂与药学上可接受的载体混合。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、靶向DHCR7的抑制子AY9944通过促进I型干扰素IFN-β的表达，抑制了多种病毒的感染；

a.AY9944促进巨噬细胞应对VSV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生；

b.AY9944显著地抑制VSV-GFP的复制；

c.AY9944促进巨噬细胞应对MCMV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生；

d.AY9944促进A594细胞对于ZIKV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生；

e.AY9944有效抑制ZIKV在A549细胞的感染；

f.AY9944有效抑制ZIKV的载量。

图2、代谢物7-DHC通过促进I型干扰素的表达，抑制了多种病毒的感染；

a.AY9944促进巨噬细胞中7-DHC的累积，并减少了胞内胆固醇的含量；

b.7-DHC促进巨噬细胞应对MCMV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生；

c.7-DHC促进巨噬细胞对于VSV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生；

d.7-DHC抑制VSV-GFP的复制。

图3、靶向DHCR7的抑制子AY9944提高小鼠抵御致死性剂量水疱性口炎病毒的感染；

a.AY9944和VSV-GFP病毒的给药流程；

b.动物血清中7-DHC的含量增加，胆固醇的含量减少；

c.感染病毒后血清中I型干扰素IFN-β的蛋白含量明显增加；

d.AY9944处理小鼠的存活能力更强；

e～f.肝脏中VSV-GFP的含量是显著降低。

图4、靶向DHCR7的抑制子AY9944提高小鼠抵御致死性剂量甲型流感病毒的感染；

a.AY9944处理后缓解H1N1病毒感染引起的小鼠体重下降；

b.AY9944处理后小鼠的存活能力更强；

c.AY9944处理后肺组织的病变情况减少。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，意外地发现7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或其上游代谢物7-脱氢胆固醇对于抑制病毒具有非常优异的效果。并且，所述的7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇可促进细胞中I型干扰素IFN-β表达，从而细胞可利用I型干扰素IFN-β发挥抑制病毒的作用。

化合物

7-脱氢胆固醇还原酶(7-dehydrocholesterol reductase，DHCR7)能够催化7-脱氢胆固醇(7-DHC)转变成胆固醇。AY9944(Cas：366-93-8)为7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂，其结构式为：

7-脱氢胆固醇(7-Dehydrocholesterol；CAS：434-16-2)是一种固醇类物质，其结构式为：

在本发明中，所述的AY9944或7-DHC可以是纯净形式存在的式(I)或(II)所示的化合物，或纯度大于85％的式(I)或(II)所示的化合物。

在本发明中，还包括AY9944或7-DHC的异构体、衍生物、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐，只要它们也具有与式(I)或(II)化合物相同或基本相同的功能。

本发明中，还包括与式(I)或(II)化合物具有相同或基本相同的母核结构的化合物，只要它们也具有与式(I)或(II)化合物相同或基本相同的功能。例如，在部分环结构上进行个别基团的替换后获得的化合物，就是括与式(I)或(II)化合物具有相同或基本相同的母核结构的化合物。

所述的“药学上可接受的盐”是指化合物与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。

化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。

所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物，或化学结构式(I)的一个化合物所组成的盐或溶液。

本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。

合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。

用途

本发明提供了AY9944或7-DHC的用途，用于：制备预防、缓解或治疗病毒感染的组合物；制备抑制病毒的组合物；或制备促进I型干扰素IFN-β表达的组合物。其中，所述的抑制病毒可以为体内抑制病毒或体外抑制病毒。本发明之前，AY9944或7-DHC在抗病毒感染方面的应用尚未见报道。

在本发明中，在无特殊说明的情况下，使用的术语如“抑制病毒”通常是指抑制病毒的复制、入侵或感染等环节，从而降低宿主中病毒的滴度。

本发明中，所述的病毒可以包括DNA病毒或RNA病毒。在本发明的一些优选方式中，所述的病毒为能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒。在本发明的具体实施方式中，所述的病毒包括：寨卡病毒(Zika Virus)、甲型流感病毒(H1N1)、水疱性口炎病毒(VesicularStomatitis Virus，简称VSV)和巨细胞病毒(Murine Cytomegalovirus，简称MCMV)等。

甲型流感病毒，也称H1N1病毒，甲型流感病毒的亚型则被人们称为“禽流感”，是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，病毒基因变异后能够感染人类，感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高也是人类最常感染的流感病毒之一。

寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)，最早于1940年代在非洲被发现，此后也传播到东南亚、太平洋岛国和美洲地区。由于以蚊媒、无症状携带者及性途径传播，传播速度非常快，给人们的健康带来威胁，病毒的爆发很可能会传播到更多国家。这一病毒与新生儿小头畸形之间存在联系。目前认为这些严重的神经系统表现是由孕妇宫内感染寨卡病毒从而偶然发生小头症、自然流产以及胎盘功能不全导致的胎儿宫内生长受限。

巨细胞病毒(Cytomegalovirus)是一种疱疹病毒组DNA病毒。亦称细胞包涵体病毒，由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体。巨细胞病毒分布广泛，其他动物皆可遭受感染，引起以生殖泌尿系统，中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。围生期感染的新生儿患者(其中部分可能系在宫内受染)可呈迁延性肺炎；儿童及成人患者可发生巨细胞病毒性肝炎(症状体征类似于一般病毒性肝炎)。有的患者可表现为畏寒、发热、咽痛、头痛、身痛、血中出现变异淋巴细胞，可高达10％～20％，其临床表现颇似于EB病毒感染所致的传染性单核细胞增多症，但嗜异性凝集试验呈阴性，可资鉴别。据统计，在传染性单核细胞增多症患者中，大约8％系因CMV感染所致。

水疱性口炎(Vesicular stomatitis)是由水疱性口炎病毒引起的一种急性热性人畜共患传染病。水疱性口炎是由病毒引起的人兽共患得传染性疾病，主要表现在口腔黏膜或在蹄冠部和趾间皮肤上发生水疱，出现泡沫一样的东西。患病动物主要是这种病的传染源。

本发明的化合物也可被应用于如上具体列举的病毒以外的病毒，例如其它一些能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒。

通过使用化合物AY9944，能够抑制上述病毒的感染，对宿主起到保护作用。在本发明的具体实施方式中，论证了AY9944能在人来源细胞、小鼠来源细胞和病毒感染小鼠模型中抑制多种病毒的感染，并能预防和/或治疗甲型流感病毒、水疱性口炎病毒引起的死亡，对基础研究和临床应用均有重要的意义。

在本发明的具体实施方式中，论证了用DHCR7的抑制剂AY9944处理的细胞，会导致细胞内胆固醇前体7-DHC的累积，同时减少下游胆固醇的含量。添加7DHC或者利用DHCR7的抑制剂AY9944处理巨噬细胞或小鼠，能提高预防和/或治疗多种DNA病毒和RNA病毒的感染。

本发明人发现，所述的AY9944或7-DHC通过促进I型干扰素IFN-β表达来发挥抑制病毒的作用。I型干扰素(Type I IFN)发现之初因其能干扰病毒感染而得名，其在抵抗病原入侵的过程中有着重要的作用。IFN-β是一种广谱抗病毒因子，它通过干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译，从而阻止或限制病毒感染，机体在早期的病毒感染期间，I型干扰素能够上调一系列干扰素相关基因ISG，可更有效的控制病毒的增殖和复制过程。另一方面，I型干扰素是免疫系统中的主要抗病毒防御的一类细胞因子。它能直接激活免疫细胞，活化包括自然杀伤细胞和巨噬细胞等免疫细胞，促进免疫监视功能清除病毒。

本发明克服了现有治疗新发病原或高致病力病毒的药物有限的缺点，提供一种抵抗广谱病毒感染的新方法，具有临床治疗的价值和应用前景。

组合物

如本文所用，术语“本发明的组合物”包括药物组合物、饮食补充剂或保健品组合物，只要它们含有AY9944或7-DHC作为预防、缓解或治疗病毒感染，的活性成分。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的AY9944或7-DHC传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。所述药学上可接受的载体可以为存在于药物组合物中的并非活性组分的任何成分，因此包括稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填料、着色剂、湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。

本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、或气雾剂。其中AY9944或7-DHC可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。本发明的AY9944或7-DHC及其组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。通常，在药物组合物中，AY9944或7-DHC作为活性成分占总重量的0.5-50％(较佳地1-40％，更佳地2-30％)，其余为药学上可接受的载体以及其他添加剂等物质。

本发明的药物组合物的适用对象可以为常见的易受病毒感染的人或哺乳动物，包括灵长类动物(如人或猴)、啮齿类动物(如鼠)或者猫、狗、猪等哺乳动物。

所用的活性成分的有效剂量可随所用的化合物、给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。根据治疗状况，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。给药的方法可以为常规的方式，如腹腔注射或静脉注射等。给药的剂量可以为本领域常规的剂量(有效量)，可以根据各种参数、尤其根据受试者的年龄、体重和性别来确定。例如，对于雄鼠，7-8周龄，体重20-22g的C57小鼠，AY9944的用量可以为25mg/kg体重(腹腔注射)。本领域技术人员可以根据给药的具体方式将AY9944制备成不同的剂型。

当两种或两种以上的药物联合给药时，一般具有优于两种药物分别单独给药的效果。因此，本发明的药物组合物中，还可包括至少一种有利于预防或治疗病毒感染的辅助药剂。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

(1)细胞、动物及试剂

293T细胞来自中国科学院细胞库，目录号为GNHu17；A549细胞来自中国科学院细胞库，目录号为TCHu150。

Vero细胞来自中国科学院细胞库，目录号为GNO10。

C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

小鼠由中国科学院上海生化细胞所SPF动物房饲养(Protocol No.IBCB0057)。所有动物试验均在中国科学院上海生化细胞所实验动物服务中心完成，且获得了中国科学院上海生化细胞所伦理委员会(批号)的许可。

AY9944 dihydrochloride(简称，AY9944)购自APExBIO公司，货号为A8658。

7-DHC购自Avanti公司，货号为700066p。

寨卡病毒(GZ01/2016strain)、甲型流感病毒(H1N1)、小鼠巨细胞病毒(MurineCytomegalovirus，简称MCMV)和水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，简称VSV)来自于上海大学。

(2)RNA抽提、反转录和实时定量PCR

RNA抽提：细胞处理后，收集细胞，用PBS洗涤一次，加入1ml Trizol裂解，室温放置5min，加入200μl氯仿，剧烈Vortex，室温放置3分钟，12000rpm，4℃离心15min，取上层水相(上层液体，约500μl)加入等体积的异丙醇，室温放置10min，12000rpm，4℃离心10min，加入1mL 75％乙醇洗涤一次，12000rpm，4℃离心5min。去上清，用小tip吸干液体，气干沉淀5-10min，加入20μl ddH2O(DEPC处理过)溶解混匀后，Nanodrop测定RNA浓度。RNA于-80℃保存。除非另外说明，其中的室温指“20℃”。

反转录：首先将1μg RNA和100ng Oligo(dN6)混合，用DEPC水调至14μl。70℃孵育10min，迅速冰浴2min，然后加入4μl反转录酶缓冲液(5X)，1μl M-MLV反转录酶，1μl 10mMdNTP，用DEPC水调至20μl。37℃孵育1h，72℃10min灭活反转录酶活性。反转录产物加入180μl去离子水，即可作为qPCR反应cDNA模板。

实时定量PCR：qPCR反应体系为20μl：3.2μl去离子水，10μl SYBR-Green MasterMix，6μl稀释后的cDNA模板，0.8μl正向和反向引物(各10μM)。反应程序为：95℃3min；95℃10sec，60℃30sec，72℃30sec，读荧光值，共计40个循环；95℃1min；55℃1min；55℃～98℃熔解，每5sec温度升高5℃，同时读荧光值。

Q-PCR引物序列如表1。

表1

(3)空斑实验检测VSV和ZIKA病毒的滴度

对于VSV病毒，铺0.25×10⁵个293T细胞于12孔板里过夜孵育。对于ZIKA病毒，铺2×10⁵个Vero细胞于12孔板里过夜孵育。待细胞长密后用PBS清洗细胞一次，待检测的细胞上清梯度稀释，与细胞孵育3小时；弃上清然后PBS洗一次，用含有0.75％低熔点琼脂糖和含2％FBS的DMEM培养基再孵育细胞4天。用结晶紫染色后对空斑进行计数。

(4)显微镜和流式细胞仪检测VSV-GFP的强度

小鼠巨噬细胞用10uM的AY9944或100nM的7-DHC预处理2h，然后VSV-GFP(MOI 0.1)感染细胞，12小鼠后荧光显微镜下直接观察VSV-GFP的强度并收集细胞通过流式细胞仪检测VSV-GFP阳性细胞的平均荧光强度。

(5)组织切片

对于冰冻切片，取VSV-GFP病毒感染12小时后的新鲜肝脏组织用包埋剂OTC包埋，放在-80°。待切片的时候，提前放在-20°，冰冻切片机切片。片子用PBS洗一遍，DAPI染色，封片，荧光显微镜下观察GFP的情况。对于石蜡切片，H1N1病毒感染4天后的肺组织，固定在4％的多聚甲醛中，经脱水-包埋-切片-脱蜡-复水-H&E染色，显微镜下观察组织的病变情况。

(6)动物实验

对于VSV-GFP的感染，AY9944(25mg/kg，腹腔注射)对C57BL/6小鼠进行预处理，连续三天给药后感染非死剂量VSV-GFP病毒(1×10⁶PFU/g，静脉注射)或致死剂量VSV-GFP病毒(1×10⁷PFU/g，静脉注射)。对于H1N1病毒的感染，AY9944(25mg/kg，腹腔注射)对C57BL/6小鼠进行预处理，2小时后通过鼻腔感染半致死剂量的H1N1(10LD50)病毒，然后连续两天AY9944(25mg/kg，腹腔注射)。

(7)统计学分析

本发明人利用GraphPad Prism 6软件对所有数据进行了统计分析。组间比较用非配对t检验分析，生存曲线分析。确定p<0.05为有显著性差异(*)；p<0.01为有显著性差异(**)，p<0.001为有显著性差异(***)，p<0.0001为有显著性差异(****)。

实施例1、AY9944在体外能够有效抑制MCMV、VSV和ZIKV病毒的感染

为了检测AY9944对宿主细胞I型干扰素IFN-β表达的调控作用，本发明人用10um的AY9944处理小鼠原代巨噬细胞，2小时后，经病毒MCMV(MOI 1)和VSV-GFP(MOI 1)感染细胞6小时后，收集细胞做RT-qPCR检测I型干扰素IFN-β的表达情况。

为了检测AY9944对VSV病毒的清除能力，10um的AY9944处理小鼠原代巨噬细胞2小时后，经病毒VSV-GFP(MOI 0.1)感染细胞12小时，荧光显微镜下直接观察VSV-GFP的荧光强度，并通过流式细胞仪检测VSV-GFP阳性巨噬细胞的平均荧光强度。

对于ZIKV病毒，用10um的AY9944处理A549细胞2小时后，用ZIKV(MOI 5)病毒感染细胞。30小时后，收集细胞做RT-qPCR检测I型干扰素IFN-β的表达情况。

为了检测AY9944对ZIKV病毒的清除情况，用10um的AY9944处理A549细胞2小时后，用ZIKV(MOI 0.1)病毒感染细胞。48小时后，分别收集细胞和上清做RT-qPCR和病毒滴度检测寨卡病毒的载量。

实验结果表明，与对照组(Vehicle)相比，10uM的AY9944能够显著地促进巨噬细胞应对VSV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生(图1a)，同时明显地抑制VSV-GFP的复制(图1b)；AY9944能够显著地促进巨噬细胞应对MCMV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生(图1c))。

对于寨卡病毒ZIKV的感染，AY9944能够显著地促进A594细胞对于ZIKV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生(图1d)，同时也能有效抑制ZIKV病毒在A549细胞的感染(图1e)，并降低了病毒的载量(图1f)。

实施例2、7-DHC在体外能够有效抑制MCMV和VSV病毒的复制

AY9944作为DHCR7的抑制剂，AY9944的处理会导致上游7-DHC的累积，并降低下游胆固醇的合成。本发明人进一步检测其上游代谢物7-DHC是否同样发挥抑制病毒感染的预防或治疗效果。

用10um的AY9944处理小鼠原代巨噬细胞，24时后利用LC/MS方法检测细胞中7-DHC和胆固醇的含量。为了测试7-DHC对宿主细胞I型干扰素IFN-β表达情况的影响，用100nM的7-DHC处理小鼠原代巨噬细胞2小时后，用病毒MCMV(MOI 1)和VSV-GFP(MOI 1)感染细胞，6小鼠后收集细胞做RT-qPCR检测I型干扰素IFN-β的表达情况；为了检测7-DHC对VSV病毒的清除能力，100nM的7-DHC预处理小鼠原代巨噬细胞2小时，然后用病毒VSV-GFP(MOI 0.1)感染细胞，12小鼠后荧光显微镜下直接观察VSV-GFP的强度，并收集细胞上清检测病毒滴度以确认对VSV的清除情况。

实验结果表明，与对照组(Vehicle)相比，10uM的AY9944能够显著促进巨噬细胞中7-DHC的累积，并减少了胞内胆固醇的含量(图2a)。100nM的7-DHC能够显著的促进巨噬细胞应对MCMV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生(图2b)。此外，100nM的7-DHC显著地促进了巨噬细胞对于VSV病毒感染引起的I型干扰素IFN-β的产生(图2c)，也明显的抑制了VSV-GFP的复制(图2d)。

实施例3、AY9944能够提高动物抵御致死性剂量VSV病毒的感染

用AY9944(25mg/kg，腹腔注射)或等量溶剂(Vehicle)对C57BL/6小鼠进行预处理，连续3天给药后，其中的3只小鼠采血检测血清中7-DHC和胆固醇的含量。一部分小鼠经非致死剂量的VSV-GFP病毒(1×10⁶PFU/g，静脉注射)感染。感染3小时后，尾静脉采血50ul，检测I型干扰素IFN-β的蛋白含量。感染12小时后，将小鼠安乐死，取肝脏组织做冰冻切片并抽提RNA检测VSV-GFP的含量。另一部分小鼠感染致死剂量的VSV-GFP病毒(1×10⁷PFU/g，静脉注射)，每天观察病征和死亡情况，直到感染后6天。用Log-rank(Mantel-Cox)分析比较对照组或AY9944处理组小鼠在经VSV毒感染后的存活情况。

实验结果显示，与对照组相比：AY9944处理3天后，小鼠血清中7-DHC的含量是显著增加的，同时减少了胆固醇的含量(图3a-b)。此外，AY9944处理后的小鼠，感染病毒3小时后血清中I型干扰素IFN-β的蛋白含量是明显增加的(图3c)，同时小鼠的存活能力更强(图3d)，肝脏中VSV-GFP的含量是显著降低的(图3e和3f)。

实施例4、AY9944能够提高动物抵御致死性剂量H1N1病毒的感染

用AY9944(25mg/kg，腹腔注射)或等量溶剂(Vehicle)对C57BL/6小鼠进行预处理，2小时后用致死剂量的H1N1(10LD50)病毒感染这些小鼠，然后连续两天给药。4天后，其中的3只小鼠安乐死，取肺组织做石蜡切片检测组织病变情况。剩余的小鼠每天观察体重变化和死亡情况，直到感染后15天。用Log-rank(Mantel-Cox)分析比较对照组或AY9944处理组的小鼠，应对H1N1病毒感染后的存活情况。

结果显示，与对照组相比，AY9944处理后能够显著缓解H1N1病毒感染引起的小鼠体重下降(图4a)，同时小鼠的存活能力更强(图4b)，肺组织的病变情况减少(图4c)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

上海大学

<120> 防治病毒的新型化合物及其应用

<130> 197510

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 1

tcacctacag ggcggacttc 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 引物(Primer)

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<210> 3

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<212> DNA

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<210> 7

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<400> 7

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<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

taggagccag agcagtaatc 20

Claims

1.7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇的用途，用于：

制备预防、缓解或治疗病毒感染的组合物；

制备抑制病毒的组合物；或

制备促进I型干扰素IFN-β表达的组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944还用于制备促进细胞内胆固醇前体7-DHC累积、减少下游胆固醇含量的组合物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的病毒包括：DNA病毒或RNA病毒。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的病毒为能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒。

5.如权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述的病毒包括：寨卡病毒，甲型流感病毒，水疱性口炎病毒，巨细胞病毒。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇通过选自下组的方法抑制病毒：

促进I型干扰素IFN-β表达；

抑制病毒的复制；或

抑制病毒的感染能力。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物为药物组合物中，所述7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇与药学上可接受的载体混合。

8.一种体外非治疗性抑制病毒的方法，其特征在于，包括：以7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇处理感染病毒的对象。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的对象包括：感染病毒的细胞或细胞培养物，含有病毒的场所、容器、器物。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的病毒包括：DNA病毒或RNA病毒；较佳地，所述的病毒为能被I型干扰素IFN-β抑制的病毒；更佳地，所述的病毒包括：寨卡病毒，甲型流感病毒，水疱性口炎病毒，巨细胞病毒。

11.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇，至少一种有利于预防或治疗病毒感染的辅助药剂以及药学上可接受的载体。

12.一种制备药物组合物的方法，所述组合物用于预防、缓解或治疗病毒感染，制备抑制病毒或制备促进I型干扰素IFN-β表达；所述方法包括：将7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY9944或7-脱氢胆固醇、至少一种有利于预防或治疗病毒感染的辅助药剂与药学上可接受的载体混合。