CN105769877A

CN105769877A - β- 谷甾醇在制备治疗或预防甲型流感的药物中的应用

Info

Publication number: CN105769877A
Application number: CN201610135752.8A
Authority: CN
Inventors: 杨子峰; 钟南山; 李菁; 周倍贤; 潘锡平; 关文达; 李征途; 李润峰; 姜志宏
Original assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Disease; State Key Laboratory Of Quality Research In Chinese Medicine (macau University Of Science And Technology); STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: Guangzhou Institute Of Respiratory Disease; State Key Laboratory Of Quality Research In Chinese Medicine (macau University Of Science And Technology); STATE KEY LABORATORY OF RESPIRATORY DISEASE; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2016-03-10
Filing date: 2016-03-10
Publication date: 2016-07-20
Anticipated expiration: 2036-03-10
Also published as: CN105769877B

Abstract

本发明提供β‑谷甾醇在制备用于治疗或预防甲型流感药物方面的新用途。本发明还提供一种用于治疗或预防甲型流感的药物，该药物的活性成分包括β‑谷甾醇。本申请发明人发现β‑谷甾醇对甲型流感病毒介导的炎症反应具有显著的抑制活性。采用荧光实时定量PCR证实，β‑谷甾醇能够明显抑制H1N1病毒感染A549细胞炎症因子的异常表达并呈剂量依赖关系；采用免疫印迹法证实，β‑谷甾醇可抑制与宿主炎症相关信号通路的活化，呈剂量依赖关系。通过动物实验证实，β‑谷甾醇能够明显抑制甲型流感病毒H1N1诱导的肺损伤和炎症。

Description

β- 谷甾醇在制备治疗或预防甲型流感的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种天然产物在制备抗流感药物方面的应用，特别涉及β-谷甾醇在制备治疗或预防甲型流感药物的新用途。

背景技术

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病，具有高度传染性。人流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中甲型流感对人类威胁最大，H1N1是最主要的季节性甲型流感病毒。全球每年流感发病率在成人中约为5％-10％，在儿童中约为20％-30％，在高危人群如婴幼儿、老年人或慢性病患者中易造成住院和死亡。全世界每年流感造成约300万至500万例严重疾病和约25万至50万例死亡，严重威胁人类的生命健康，并造成巨大经济损失。预防及控制流感传播的最有效方法是接种疫苗，但是由于流感病毒的抗原变异能力强，疫苗的生产仅针对已流行流感亚型毒株，对于抗原漂移和变异产生新型流感病毒感染不产生机体的保护作用，且对高危人群如老人与免疫力低下儿童的保护作用低下。因此，流感疫苗预防流感具有一定的滞后性，保护率也有限。目前用于流感治疗的化学药物主要有两类：金刚烷胺类(金刚烷胺和金刚乙胺)和神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦和扎那米韦)，通常需在疾病早期(症状出现后48小时内)给药，且由于作用靶点单一已出现耐药，极大影响了疗效。因此，临床迫切需求具有不同靶点的新型抗流感药物。

在流感病毒感染过程中，宿主启动固有免疫反应产生抗病毒因子(如干扰素)和炎症反应以抑制入侵的病毒，适度的炎症反应有利于流感病毒的清除。但过度炎症反应会引起“炎症因子风暴”，导致机体严重的组织损伤，这是流感导致死亡的主要原因之一。因此，以抑制流感病毒诱发宿主产生过度炎症反应为靶标的药物研发已成为研究热点。该类药物调控宿主固有免疫反应相关的信号通路及炎症因子的分泌，不针对病毒体，故不易产生耐药。

β-谷甾醇(β-sitosterol，式1)是一种常见植物甾醇，广泛存在于植物界，具有降血脂、抑菌、抗肿瘤、保护胃粘膜等多种药理活性。但，关于β-谷甾醇在抑制甲型流感病毒介导的炎症反应方面的作用未曾见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供β-谷甾醇在制备用于治疗或预防甲型流感药物方面的新用途。

所述β-谷甾醇其具有如下结构式：

本发明还提供β-谷甾醇在制备用于抑制甲型流感病毒介导的炎症反应的药物中的应用。

本发明还提供一种用于治疗或预防甲型流感的药物，该药物的活性成分包括β-谷甾醇，β-谷甾醇可作为唯一活性成分，也可和其他药用许可的物质组合。该药物可进一步包括药学上可接受的载体或辅料，根据需要可制备成药学上可接受的剂型，剂型例如为片剂、硬胶囊、软胶囊、颗粒剂、滴丸等各种口服剂型。所需的药学上可接受的载体或辅料，具体如药学上常用的稀释剂和吸收剂，例如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；药学上常用的湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；药学上常用的崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。关于药学上可接受的载体或辅料不再一一例举，本领域普通技术人员可根据所掌握的公知常识进行具体选择。

本申请发明人发现β-谷甾醇对甲型流感病毒介导的炎症反应具有显著的抑制活性。本申请发明人采用荧光实时定量PCR证实，β-谷甾醇能够明显抑制H1N1病毒感染A549细胞炎症因子(IL-6、IP-10、MCP-1、MIP-1β、IL-8、COX-2、CCL-5)的异常表达并呈剂量依赖关系；采用免疫印迹法证实，β-谷甾醇可抑制与宿主炎症相关信号通路COX-2、P38MAPK、ERK1/2MAPK、NF-kB的活化，呈剂量依赖关系。通过动物实验(感染H1N1病毒小鼠体内实验)证实，β-谷甾醇能够明显抑制甲型流感病毒H1N1诱导的肺损伤和炎症。β-谷甾醇有望成为一种安全有效的作用机理新颖的抗流感新型药物。

与现有药物比较，利用β-谷甾醇制备抗流感新型药物具备突出优势：1、β-谷甾醇作用靶标是宿主细胞而不是病毒，不易产生耐药；2、β-谷甾醇无明显毒副作用；3、β-谷甾醇是植物单体成分，结构明确，化学性质稳定，易于质量控制；4、β-谷甾醇来源丰富，价廉易得，可满足大生产需求。

附图说明

图1是β-谷甾醇对流感A/PR8/3/4(H1N1)(MOI＝0.1)诱导人A549细胞信号通路活化的作用

图2是细胞培养介质刺激实验检测β-谷甾醇对流感诱导干扰素下游分子活化作用

图3是β-谷甾醇干预流感A/PR8/3/4(H1N1)(MOI＝0.1)感染人A549细胞24h后，采用qRT-PCR技术检测Ⅲ型干扰素(IFN-Lambda)的基因转录水平，图中PR8为病毒组，PR8+β-谷甾醇为药物干预组，β-谷甾醇为单独药物组；

图4是在病毒感染A549细胞情况下，采用western blot技术检测β-谷甾醇对I型干扰素(IFN-β)引起下游信号分子活化的作用

图5是β-谷甾醇干预流感A/PR8/3/4(H1N1)(MOI＝0.1)感染人A549细胞24h后，采用qRT-PCR技术检测模式识别受体(RIG-1)的基因转录水平；图中PR8为病毒组，PR8+β-谷甾醇为药物干预组，β-谷甾醇为单独药物组；

图6中图A～H各图为采用实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测β-谷甾醇对流感病毒感染诱导宿主细胞的炎症因子基因表达水平；图中PR8为病毒组，PR8+β-谷甾醇为药物干预组，β-谷甾醇为单独药物组；

图7中图A～F各图为采用Bio-plex悬浮芯片技术在蛋白水平检测β-谷甾醇对流感病毒感染诱导宿主细胞的炎症应答的作用

图8中图A～E各图为体内评价β-谷甾醇对流感病毒感染小鼠的保护作用；其中A图为：β-谷甾醇对感染病毒小鼠的肺指数影响；B图为：β-谷甾醇对感染病毒小鼠的体重影响；C图为：β-谷甾醇对感染病毒小鼠肺泡灌洗液中蛋白浓度的调节作用；D图为：β-谷甾醇对感染病毒小鼠肺泡灌洗液中IP-10的调节作用；E图为：β-谷甾醇对感染病毒小鼠肺泡灌洗液中IL-6的调节作用

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案做进一步说明。实施例中所用仪器或试剂若未特别说明的，均为采用本领域常规试剂或仪器，可通过市场购买获得的常规产品。实施例中的百分比，若未特别说明，均为质量百分比。

实施例一β-谷甾醇对流感病毒诱导宿主信号通路的作用

1、材料：细胞和病毒

A549细胞购自ATCC，保存于本实验室；A/PR8/3/4(H1N1)保存于本实验室。

2、化学试剂及抗体

Tris base购自Ameresco公司；氯化钠(NaCl)购自广州化学试剂厂；氯化钾(KCl)购自广州化学试剂厂；磷酸二氢钾(KH₂PO₄)购自广州化学试剂厂；磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)购自广州化学试剂厂；甘氨酸Glycine购自广州化学试剂厂；十二烷基磺酸钠(SDS)购自美国sigma公司；吐温Tween-20购自广州化学试剂厂；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo公司；RIPA裂解液购自美国Thermo公司；Easysee Western marker(20-90kDa)购自中国Transgen Biotech公司；Blue plus II protein marker购自中国TransgenBiotech公司；过硫酸胺(APS)购自美国Ameresco公司；PVDF膜购自美国Life science公司；Cocktail(蛋白酶抑制剂)购自美国sigma公司；脱脂奶粉购自Gibco公司；胎牛血清购自Gibco公司；TEMED(N,N-亚甲基双丙烯酰胺)购自美国Bio-rad公司；兔抗人p-p65抗体购自美国CST公司；兔抗人p65抗体购自美国CST公司；兔抗人p-pERK抗体购自美国CST公司；兔抗人ERK抗体购自美国CST公司；兔抗人p-p38抗体购自美国CST公司；兔抗人p38抗体购自美国CST公司；兔抗人COX-2抗体购自美国CST公司；兔抗人p-STAT3抗体购自美国CST公司；兔抗人p-STAT1抗体购自美国CST公司；兔抗人GAPDH抗体购自美国CST公司；羊抗兔二抗购自美国Earthox公司。

3、其它试剂

DMEM/DF12(1：1)培养基购自Gibco公司；β-谷甾醇系从中药板蓝根中分离得到，为白色针状结晶，制法参照文献[现代药物与临床，2011,26(5)：381-383]进行，也可采用现有的其他方法获得或者通过市场购买获得。

4、β-谷甾醇抑制流感诱导宿主细胞信号通路的活化

1)用胰酶将T75瓶中的A549细胞进行消化，待细胞全部脱落后，加入适量含10％FBS(体积比)的DMEM/DF12(1：1)培养基进行终止胰酶的作用；

2)将消化下来的细胞转移到15ml的离心管中，进行离心1000rpm×5min；

3)加入适量含10％FBS(体积比)的DMEM/DF12(1：1)培养基将细胞重悬，调整细胞的密度将细胞铺于6孔板中，放置于培养箱中，培养12h细胞贴壁后待用；

4)进行实验组的设置，包括：正常组；流感病毒组，低剂量药物干预组(流感病毒+β-谷甾醇(150μg/ml)),中剂量药物干预组(流感病毒+β-谷甾醇(300μg/ml))，高剂量药物干预组(流感病毒+β-谷甾醇(450μg/ml)),(流感病毒+β-谷甾醇(600μg/ml))。将A549细胞取出，弃去原有的培养基，加入PBS洗涤两次，然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)(MOI＝0.1)无血清的DMEM/DF12(1：1)培养基吸附细胞2h；

5)用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒，药物干预组加入不同浓度的β-谷甾醇(150μg/ml、300μg/ml、450μg/ml、600μg/ml)。继续培养24小时后；将细胞6孔板置于冰上，弃去细胞培养上清，并用冷的PBS洗涤两次；洗涤完毕，迅速加入130ul细胞裂解液RIPA(含有蛋白酶抑制剂cocktail,其与细胞裂解液RIPA体积比(V/V)为1：100加入及终浓度为10uM的PMSF)，进行提取细胞总蛋白。

6)将1.5mlEP管进行标记并它们置于冰上，将细胞裂解物转移至标记好各组的EP管，并在摇床上摇30min，让蛋白充分裂解；

7)将细胞裂解物移至4℃预冷的离心机，进行13000rpm×15min离心；

8)离心毕，将裂解物的沉淀弃去，并将上清进行分装保存在-80℃；

对细胞总提取物的蛋白浓度进行测定，按BCA蛋白检测试剂盒说明书进行配置标准品，取96孔板，加入10ul/孔的标准品及样品(2复孔)，然后逐孔加入BCA检测工作液200ul/孔(配置工作液A:B＝1：50)，混匀后37℃孵育30min，取出96孔板冷却至室温，于酶标仪于吸光度572nm测定OD值。绘制标准曲线，将样品OD值转换为浓度。

9)SDS聚丙烯酰胺凝胶的准备：

根据配方先配置10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶：4ml ddH₂O+3.3ml 30％ACr(丙烯酰胺)+2.5ml 1.5M Tris.HCl(PH＝8.8)+0.1ml 10％SDS+0.1ml 10％APS(过硫酸铵)+0.004ml TEMED，充分混匀后在分离玻璃板间灌注分离胶，灌注完毕在最上层加入ddH₂0封住分离胶液面，等待30min，分离胶凝结完好；根据配方先配置5％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶：3.4ml ddH₂O+0.83ml 30％ACr(丙烯酰胺)+0.63ml 1M Tris.HCl(PH＝6.8)+0.05ml 10％SDS+0.05ml 10％APS(过硫酸铵)+0.005ml TEMED，充分混匀后在分离玻璃板间灌注浓缩胶，灌注毕插入梳子，等待30min，浓缩胶凝结完好，可以使用。

10)加样：用5xSDS聚丙烯凝胶加样缓冲液(5Xloading buffer)与样品(20μg)按体积比(V/V)(1:4))混合，95℃变性10min，立即转至冰上冷却5min防止蛋白复性。离心3000rpm×1min，逐孔加样；

11)电泳：用Bio-Rad垂直电泳仪，90V恒压电泳约(1-1.5)h，待溴酚蓝指示剂到达分离胶底部时停止电泳；

12)蛋白质转膜：PVDF膜先在甲醇浸泡15min。电泳结束后取下凝胶，切除多余的空白凝胶，修剪后按其大小裁剪6张Whatman3M滤纸。按3张滤纸-凝胶-PVDF膜-3张滤纸的顺序叠放整齐后置于湿转负极板上，用干净玻璃棒排去凝胶与PVDF膜间的气泡，在冷库中，以380mA的恒电转膜2h。转膜结束后，取出膜并加入5％脱脂奶粉(5％milk/TBST)封闭PVDF膜并于室温摇床上轻摇1h；

13)配置5％BSA/TBST，按购自CST公司的抗体COX-2、NF-κB、P38MAPK、ERK1/2MAPK说明书相应的比例稀释COX-2、NF-κB、P38MAPK、ERK1/2MAPK抗体，加入到已转膜完毕的PVDF膜上，置于4℃冷库中过夜孵育；

14)第二天，取出PVDF膜并恢复至室温，移去一抗并用洗液TBST洗膜3次，5min/次。随后加入按体积比(V/V)1:1000进行稀释的与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔二抗,室温孵育1h。移去二抗并用洗液TBST洗膜3次，5min/次；

15)取出膜，滤纸上滴干水分，加入ECL免疫荧光化学发光显色剂；

16)于暗室中进行压片，并在显影液显影及定影液固定胶片；

17)结果分析与整理。

结果整理后如图1所示，流感A/PR8/3/4(H1N1)感染A549 24h后，细胞信号通路COX-2，NF-κB，P38MAPK，ERK1/2MAPK明显活化。β-谷甾醇明显抑制流感A/PR8/3/4(H1N1)诱导人A549细胞信号通路COX-2，NF-κB，P38MAPK，ERK1/2MAPK信号通路的活化。

实施例二β-谷甾醇对外源干扰素(IFN-β)的刺激信号转导的影响

将A549细胞种至6孔板，放置于培养箱中，培养12h细胞贴壁后，弃去原培养基，加入PBS洗涤两次，然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)无血清的DMEM/DF12(1：1)培养基吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒，加入不同浓度的β-谷甾醇(200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml)，继续培养4小时。加入20ng/ml IFN-β刺激15min后，进行提取细胞总蛋白进行western blot(具体过程可参照实施例一相应步骤进行)，本实施例孵育抗体时使用兔抗人一抗P-STAT1、P-STAT3抗体检测P-STAT1、P-STAT3分子，二抗使用羊抗兔，购自美国Earthox公司。结果如图2显示，在病毒感染下I型干扰素刺激显著活化STAT1/3。进行药物干预后，STAT1/3的活化水平呈明显抑制。

实施例三β-谷甾醇对流感病毒感染诱导炎症介质的影响

将A549细胞种至6孔板，放置与培养箱中，培养12h细胞贴壁后，弃去原培养基，加入PBS洗涤两次，然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)无血清的DMEM/DF12(1：1)培养基吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒。采用药物治疗模式，药物干预组加入不同浓度的β-谷甾醇(150μg/ml、300μg/ml、450μg/ml)。单独药物组加入300μg/ml的β-谷甾醇，单独药物组的A549细胞未经流感病毒吸附。继续培养24小时后收集细胞培养上清，进行离心除去细胞碎片及过滤除去病毒颗粒。然后将处理完毕的培养介质加入刺激另一组已种于六孔板中的A549细胞，刺激总时间为15min。然后，进行提取细胞总蛋白进行westernblot(具体过程参照实施例一相应步骤进行),本实施例使用兔抗人一抗P-STAT1、P-STAT3抗体检测P-STAT1、P-STAT3分子，二抗使用羊抗兔二抗，购自美国Earthox公司。结果如图4所示，流感A/PR8/3/4(H1N1)感染A549 24h后，取细胞培养介质刺激另一组A549细胞明显引起干扰素通路下游分子的STAT1/3的显著活化。而β-谷甾醇干预后明显抑制STAT1/3的磷酸化。由结果我们初步推测β-谷甾醇抑制流感A/PR8/3/4(H1N1)诱导宿主细胞炎症介质(很可能干扰素)过度释放。

实施例四β-谷甾醇对流感感染诱导Ⅲ干扰素(IFN-Lambda)转录水平的影响

将A549细胞种至6孔板，放置于培养箱中，培养12h细胞贴壁后，弃去原培养基，加入PBS洗涤两次，然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)无血清的DMEM/DF12(1：1)培养基吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒。设病毒组、药物干预组，其中药物干预组采用药物治疗模式，药物干预组(图3中对应为PR8+β-谷甾醇)加入不同浓度β-谷甾醇(150μg/ml、300μg/ml、450μg/ml)；病毒组不加药物进行干预。还设有单独药物组，其A549细胞未经病毒吸附，加入300μg/ml的β-谷甾醇。继续培养24小时后，弃去6孔板中细胞培养上清后，冷PBS洗涤2遍，加入1ml Trizol(Life technologies公司)并在室温下孵育5min；(可选：或转至1.5mlEP管中，于-80°冰箱中保存；或直接进行提取)；之后按照如下步骤进行：

1)加入200ul氯仿，震荡15sec，于室温中孵育2-3min；置于4°离心机中进行离心：13000rpmx15min；

2)离心毕，将上清转移至新的1.5EP管，加入500ul异丙醇；室温下孵育10min；置于4℃离心机中进行离心：12000rpm x 10min；

3)离心毕，加入1ml 75％乙醇洗涤一次，置于4℃离心机中进行离心：7500rpmx10min；

4)弃去上清，室温放置5-10min，加入无RNase水溶解RNA，立刻进行逆转录成cDNA。

5)分光光度计中测定总RNA的浓度(ng/μl)并计算总RNA的体积：拟加入逆转录反应体系中总RNA的量为1000ng，则计算所需总RNA的体积V＝1000/RNA浓度；

mRNA逆转录成cDNA，配置逆转录反应体系如下(试剂盒：Takara RR036A)：

6)进行逆转录反应，反应条件如下：

37℃ 15min

85℃ 5Sec

4℃ ∞

收取样品进行后续定量PCR实验或保存于﹣20℃。

7)实时定量PCR反应(试剂盒：Takara RR390A)

配置反应体系如下：

进行Real time PCR反应条件(ABI7500)

Ⅲ型干扰素(IFN-Lambda)引物序列及探针序列如下:

*引物名称*引物序列(5'--3')

IFN-Lambda1-F GGACGCCTTGGAAGAGTCACT

IFN-Lambda1-R AGAAGCCTCAGGTCCCAATTC

IFN-Lambda1-Probe Fam-AGTTGCAGCTCTCCTGTCTTCCCCG-Tam

8)结果分析与统计。

结果如图3显示，流感A/PR8/3/4(H1N1)感染A549细胞24h后，Ⅲ型干扰素IFN-Lambda显著升高。进行药物干预后，Ⅲ型干扰素IFN-Lambda表达水平呈剂量依赖性降低。

实施例五β-谷甾醇对流感病毒感染诱导宿主表达模式识别受体(RIG-1)的基因转录影响

将A549细胞种至6孔板，放置于培养箱中，培养12h细胞贴壁后，弃去原培养基，加入PBS洗涤两次，然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)无血清的DMEM/DF12(1：1)培养基吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒。设病毒组、药物干预组，其中药物干预组采用药物治疗模式，药物干预组加入不同浓度β-谷甾醇(150μg/ml、300μg/ml、450μg/ml)；病毒组不加药物干预。还设有单独药物组，其A549细胞未经病毒吸附，加入300μg/ml的β-谷甾醇。继续培养24小时后，弃去6孔板中细胞培养上清后，冷PBS洗涤2遍，加入1mlTrizol并在室温下孵育5min；(可选：或转至1.5mlEP管中，于-80°冰箱中保存；或直接进行提取)；

细胞总RNA提取、mRNA逆转录成cDNA、及实时定量PCR反应均参照实施例四的相应步骤进行；其中，本实施例在实时定量PCR反应中所用的模式识别受体(RIG-I)引物序列及探针序列如下:

*引物名称*引物序列(5'--3')

RIG(Human)-Sense GATGCTCTGGATTACTTG

RIG(Human)-anti-Sense GTGGTACTCTTCTTGTAAG

RIG(Human)-Probe Fam-CTTCTTCAGCAATGTCCGAGCAG-Tam

结果如图5显示，流感病毒感染显著上调模式识别受体(RIG-I)的基因水平的表达，β-谷甾醇干预明显抑制模式识别受体(RIG-I)的基因水平的表达，提示β-谷甾醇通过抑制宿主模式识别受体(RIG-I)上调表达而抑制其对病原识别引起的炎症反应。

实施例六β-谷甾醇对流感病毒感染诱导宿主炎症基因表达的影响

将A549细胞种至6孔板，放置于培养箱中，培养12h细胞贴壁后，弃去原培养基，加入PBS洗涤两次，然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)无血清的DMEM/DF12(1：1)培养基吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒。设病毒组、药物干预组，其中药物干预组采用药物治疗模式，药物干预组加入不同浓度的β-谷甾醇(150μg/ml、300μg/ml、450μg/ml)；病毒组不加药物干预。还设有单独药物组，其A549细胞未经病毒吸附，加入300μg/ml的β-谷甾醇。继续培养24小时后，弃去6孔板中细胞培养上清后，冷PBS洗涤2遍，加入1mlTrizol并在室温下孵育5min；(可选：或转至1.5mlEP管中，于-80°冰箱中保存；或直接进行提取)；

细胞总RNA提取、mRNA逆转录成cDNA、及实时定量PCR反应均参照实施例四相应步骤进行，其中，本实施例中进行实时定量PCR反应时所用的炎症因子的引物序列及探针序列如下:

结果如图6中图A-H各图所示，β-谷甾醇干预后明显抑制流感病毒诱导的炎症因子(IL-6,TNF-alpha,IP-10,MCP-1,MIP-1b,IL-8,COX-2,CCL5)的基因转录水平。提示β-谷甾醇干预可能抑制流感感染诱导过度炎症应答。

实施例七Bio-plex悬浮芯片技术在蛋白水平检测β-谷甾醇对流感病毒感染诱导宿主细胞的炎症因子分泌的作用

将A549细胞种至6孔板，放置于培养箱中，培养12h细胞贴壁后，弃去原培养基，加入PBS洗涤两次，然后加入含流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)无血清的DMEM/DF12(1：1)培养基吸附细胞2h；然后，用PBS将细胞洗涤除去未吸附的病毒。设Control(对照组，为正常A549细胞)、病毒组、药物干预组；其中，药物干预组采用药物治疗模式，药物干预组加入不同浓度的β-谷甾醇(150μg/ml、300μg/ml、450μg/ml)；病毒组未添加药物干预。还设有单独药物组，其A549细胞未经病毒吸附，加入300μg/ml的β-谷甾醇。继续培养24小时后，将细胞培养上清移至1.5mlEP管。然后，置于4℃预冷的离心机中进行13000rpm x 15min的离心。离心毕，弃去沉淀的细胞碎片，并将上清进行小份分装，，然后于-80°冰箱中冻存，避免反复冻融，待检测时使用。

Bio-plex悬浮芯片技术检测细胞上清中炎症因子含量：

1)细胞因子检测实验：取出Bio-Plex悬液芯片检测试剂盒(Bio Rad公司)，使其平衡恢复至室温。同时，取出样品于冰上进行缓慢解冻。

2)设置平底板(96孔板)上标准品孔、空白孔、control孔及样品孔的位置，标准品孔及空白孔2个复孔。

3)按照说明书(Bio-Plex悬液芯片检测试剂盒)比例加入到检测缓冲液assaybuffer中进行稀释抗体微球，涡旋均匀磁性吸引微球，每孔50ul微球混合液加入到平底板中。

4)每孔加入100ul冲洗缓冲液wash buffer，并将平底板置于磁力架上进行洗涤磁性吸引微球，洗涤2次。

5)加样：将系列稀释好的标准品、准备好的样品分别加入到平底板的标准品孔、样品孔中，空白孔加入assay buffer，用封口膜封板。

6)孵育：用铝箔包好，室温下，将平底板在96孔板摇床300rpm孵育30min。

7)洗涤：孵育完毕，并将平底板置于磁力架上弃去液体。每孔加入100ul washbuffer，并将平底板置于磁力架上弃去液体，重复此过程洗涤3次。

8)加检测抗体：使用前涡旋摇匀检测抗体，将检测抗体按照说明书比例加入到检测抗体稀释液中，涡旋均匀炎症因子IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、IP-10、MCP-1(MCAF),RANTES、TNF-α的检测抗体，在平底板每孔加入25ul。在室温下，将平底板置于96孔板摇床300rpm孵育30min。

9)洗涤：孵育完毕，并将平底板置于磁力架上弃去液体，并每孔加入100ul washbuffer。并将平底板置于磁力架上弃去wash buffer，重复此过程洗涤3次。

10)在平底板每孔加入50ul荧光素PE标记的链霉亲和素，室温下，在96孔板摇床300rpm孵育10min。

11)洗涤:孵育完毕，并将平底板置于磁力架上弃去液体，并每孔加入100ul washbuffer。并置于磁力架上弃去wash buffer，重复洗涤3次检测

12)将平底板每孔加入125ul检测缓冲液assay buffer，避光室温下摇板1100rpm*30秒，用Bio-plex 200进行检测。

结果如图7中图A-F各图所示，β-谷甾醇干预后明显抑制流感病毒诱导的炎症因子(IL-6,TNF-alpha,IP-10,MCP-1,IL-8，Rantes)的水平。提示β-谷甾醇干预可能通过抑制流感感染诱导过度炎症应答发挥治疗流感感染作用。

实施例八体内β-谷甾醇对流感病毒感染小鼠的保护作用

1)将周龄4-6周、雌性、体重14-16g、购自广东省医学实验动物中心(许可证号：SYXK(粤)2013-0002)SPF级的BABL/C小鼠随机分成五组，分别为：Control(对照组)、PR8组(病毒组)、PR8(病毒)+奥司他韦(75mg/kg)(称为奥司他韦药物对照组)，及β-谷甾醇干预组：PR8(病毒)+β-谷甾醇(100mg/kg)、PR8(病毒)+β-谷甾醇(300mg/kg)。

2)将流感病毒A/PR8/3/4(H1N1)冻融后，稀释成1LD50，小鼠经乙醚轻度麻醉后，经滴鼻50μl制备流感感染模型；对照组同法滴入等量的PBS。

3)在制备BABL/C小鼠流感病毒感染模型前一天，β-谷甾醇干预组分别通过灌胃方式给予β-谷甾醇(灌胃剂量：100mg/kg；300mg/kg)，连续6天，每天一次，于感染后第5天停止给药。奥司他韦药物对照组则给予奥司他韦75mg/kg，该组的其他操作同β-谷甾醇干预组。对照组及病毒组则同时每天给予生理盐水。

4)制备流感感染模型第5天，乙醚麻醉处死小鼠，解剖观察小鼠肺部病变，并称量体重及肺重，测定肺指数(肺指数＝肺脏重量(g)/体重(g)×100)，评价小鼠体重及肺指数的变化；

5)同时进行肺泡灌洗，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测灌洗液中蛋白总浓度与ELISA试剂盒检测炎症因子(IL-6，IP-10)的浓度。

结果如图8中图A-E各图所示，其中，图8中图A显示，在流感模型制备方面，病毒组肺指数在1.5-2.0范围内，奥司他韦药物对照组肺指数0.5-1.0范围内，与病毒组比较有显著性差异(p<0.01)，提示小鼠流感模型构制备成功。β-谷甾醇干预组的肺指数与病毒组相比有统计学差异(p<0.01)。

图8中图B显示，制备流感感染模型第5天，对照组小鼠体重变化呈递增。奥司他韦药物对照组小鼠体重递增幅度小于正常组。病毒组小鼠体重呈现下降约20％。β-谷甾醇干预组小鼠体重下降的幅度小于病毒模型组。

图8中图C显示，病毒组肺泡灌洗液中含量显著升高。β-谷甾醇干预组小鼠肺泡灌洗液中蛋白含量显著低于病毒组。提示β-谷甾醇干预明显抑制流感致小鼠肺部严重损伤。

图8中图D与图E显示，制备流感感染模型第5天，病毒组小鼠肺泡灌洗液中的炎症因子(IL-6，IP-10)显著升高，β-谷甾醇干预组明显抑制肺泡灌洗液中炎症因子的水平。

实验结果提示，β-谷甾醇干预可明显抑制流感致小鼠肺部损伤及过度炎症应答，保护小鼠流感所致小鼠免受肺部的损伤。

上述体内外实验充分表明，β-谷甾醇对甲型流感病毒介导炎症反应具明显抑制活性，可能作用机理是调节宿主抗病毒应答的干扰素过度产生及其继发的过度炎症。因此，β-谷甾醇可以应用于制备新型抗流感药物。与现有药物比较，应用β-谷甾醇制备新型抗流感药物具备突出优势：1、β-谷甾醇作用靶标是宿主细胞而不是病毒，不易产生耐药；2、β-谷甾醇无明显毒副作用；3、β-谷甾醇是植物单体成分，结构明确，化学性质稳定，易于质量控制；4、β-谷甾醇来源丰富，价廉易得，可满足大生产需求。β-谷甾醇可单独或与其它药用许可的物质组合，方便地制成片剂、硬胶囊、软胶囊、颗粒剂、滴丸等各种口服剂型。

文中实施例涉及的具体实验操作若未特别说明，均为本领域普通技术人员根据其掌握的公知常识或常规技术手段所能理解或知晓的，对此不再一一赘述。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.β-谷甾醇在制备用于治疗或预防甲型流感的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述β-谷甾醇具有如下结构式：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述β-谷甾醇在制备用于抑制甲型流感病毒介导的炎症反应的药物中应用。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物含有药学上可接受的载体或辅料。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制成药学上可接受的剂型。

6.一种用于治疗或预防甲型流感的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括β-谷甾醇。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体或辅料。