CN112138032B - 片仔癀及其制剂在制备预防和治疗肠道病毒ev71感染药物中的应用 - Google Patents

片仔癀及其制剂在制备预防和治疗肠道病毒ev71感染药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药领域，具体涉及片仔癀及其制剂在制备抗肠道病毒EV71感染药物中的应用。本发明公开了片仔癀在制备抗肠道病毒EV71感染药物中的应用，对所述用途进行了抗病毒活性研究，说明了片仔癀在肠道病毒EV71感染过程中，显著抑制细胞病变、抑制病毒复制、降低病毒颗粒载量，具有较强的抗EV71病毒活性，为片仔癀的所述新用途提供科学依据。

Description

片仔癀及其制剂在制备预防和治疗肠道病毒EV71感染药物中 的应用
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及片仔癀及其制剂在制备预防和治疗肠道病毒EV71感染药物中的应用。
背景技术
肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)为嗜神经性病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属，是引起儿童手足口病，咽峡炎或皮疹的主要病原体之一，特别是手足口病，有实验室病原学诊断结果的手足口病病例中，EV71阳性比例约占44％，重症病例中EV71阳性占74％，死亡病例中占93％。EV71感染严重影响人们的日常生活和生命健康，已成为全球重要的公共卫生问题，引起了世界各卫生机构及研究机构广泛的关注和研究。
EV71感染导致的手足口病(Hand-Foot-and-Mouth Disease，HFMD)常见于婴幼儿，是如今造成中国儿童死亡的一个重要原因，成人偶尔也可被感染。常见症状是发热和手部、足部以及口腔黏膜的病毒性皮疹等特异性病变，可以导致被感染的病人发生严重的神经系统性和心血管并发症，包括无菌性脑膜炎、脑炎、急性肺水肿及心力衰竭等，重症患儿病情进展迅速，有着较高的致残率和致死率。而且我国各地全年均有发生，发病率为37.01/10万～205.06/10万，近年报告病死率在6.46/10万～51.00/10万之间。预防EV71感染最有效的方法是对适龄儿童接种疫苗；尽管目前已有疫苗上市，但尚缺乏有效的免疫持久性研究数据，其安全性和有效性仍有待于进一步验证。
对于EV71感染，目前尚缺乏有效的抗肠道病毒治疗药物。临床上虽然已有药物用于治疗EV71手足口病,但并未规范和广泛使用，仍存在一些不足：1)多数临床实验药物为小范围内试用,缺乏循证学依据；2)用于治疗EV71感染的模型(细胞及动物)药物远多于临床实验药物；3)动物感染模型之间，及其与临床人体感染之间的差异,增加了临床研究阶段药物的不确定性；4)EV71手足口病重症患儿死亡率较高主要是因为神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎、脑炎等严重并发症，然而因其机制尚未明确,限制了抗EV71药物的开发。因此，寻找安全、有效的抗EV71感染药物具有重要意义。
目前尚无针对EV71感染的治疗药物，因新药开发耗时长、费用高、风险大，从已上市药品中筛选具有抗EV71感染的药物，为EV71感染疾病的对症治疗和新药开发提供思路。片仔癀是近500年应用基础的清热解毒类中成药，前期药理药效及临床研究表明，片仔癀具有显著的抗炎解热、免疫调节、治疗肿瘤等作用，目前尚无报道片仔癀在治疗EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹等药物中的应用。
发明内容
为解决预防和治疗EV71感染药物的缺乏，本发明提供了片仔癀及其制剂在制备预防和治疗肠道病毒EV71感染的药物中的应用。
本发明公开了片仔癀及其制剂在制备预防和治疗肠道病毒EV71感染药物中的应用。
优选的，所述预防和治疗肠道病毒EV71感染药物包括预防和治疗由肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹的药物，所述预防和治疗肠道病毒EV71感染药物的剂型包括锭剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、合剂、酊剂、喷剂、膏剂中至少一种组成的口服给药、外用给药、注射给药等剂型。
优选的，所述预防和治疗肠道病毒EV71感染药物每单位剂量中含片仔癀为0.03-0.9g，其中所述单位剂量为具有一定生物效能的含有最小剂量片仔癀的药剂。
本发明还公开了片仔癀及其制剂在制备抑制肠道病毒EV71复制药物中的应用。
本发明还公开了片仔癀及其制剂在制备减少肠道病毒EV71病毒蛋白VP-1表达药物中的应用。
本发明还公开了片仔癀及其制剂在制备降低肠道病毒EV71子代感染性病毒颗粒产生水平药物中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
1.本发明所述片仔癀及其制剂在制备预防和治疗肠道病毒EV71感染药物中的应用，片仔癀及其制剂的细胞毒性小，能在无毒性浓度范围内有效抑制肠道病毒EV71的复制，呈剂量依赖地减少病毒感染导致的细胞病变(CPE)、减少EV71报告病毒的报告蛋白GFP的含量、减少病毒结构蛋白VP-1的表达、降低子代感染性病毒颗粒的产生水平，提高细胞存活率，具有显著的抗肠道病毒EV71感染活性，能应用于制备预防和治疗肠道病毒EV71感染的药物。
2.本发明所述片仔癀及其制剂在制备抑制肠道病毒EV71复制药物中的应用，片仔癀及其制剂在无毒性浓度下对EV71-GFP和EV71 C4(BrCr)病毒感染的Vero细胞或者RD细胞均有剂量依赖的保护作用，其在Vero细胞和RD细胞的CC50分别为0.8792mg/mL和0.6913mg/mL,在不同细胞和不同感染复数(MOI)感染情况下的SI在6.5-75之间，提示片仔癀具有较好的抗EV71病毒复制的作用，能应用于制备抑制肠道病毒EV71复制的药物。
3.本发明所述片仔癀及其制剂在制备减少肠道病毒EV71病毒结构蛋白VP-1表达药物中的应用，片仔癀可以剂量依赖地抑制两种EV71C4病毒感染的病毒蛋白VP-1的表达，其在不同MOI下的选择指数SI在27.9-109，提示片仔癀具有抑制EV71感染的蛋白VP-1表达作用，可以应用于制备减少肠道病毒EV71病毒蛋白VP-1表达的药物。
4.本发明所述片仔癀及其制剂在制备降低肠道病毒EV71子代感染性病毒颗粒产生水平药物中的应用，片仔癀及其制剂可以剂量依赖地抑制EV71 C4感染性病毒颗粒的产生，其CC50为0.6966mg/mL，EC50为0.01588mg/mL，选择指数为43.9，说明片仔癀具有抑制EV71感染性病毒颗粒产生的活性，可用于制备降低肠道病毒EV71子代感染性病毒颗粒产生水平的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明片仔癀(PZH)应用于EV71-GFP感染Vero细胞(MOI＝0.6)所得的细胞存活率曲线和抑制率曲线图以及阳性对照药物盐酸胍应用EV71-GFP感染的Vero细胞所得的细胞存活率曲线和抑制率曲线图；
图2是本发明片仔癀(PZH)应用于EV71-GFP感染RD细胞(MOI＝0.05)所得的细胞存活率曲线和抑制率曲线图以及阳性对照药物盐酸胍应用EV71-GFP感染的RD细胞所得的细胞存活率曲线和抑制率曲线图；
图3是本发明片仔癀(PZH)应用于EV71 C4(BrCr)感染Vero细胞(MOI＝0.2)所得的细胞存活率曲线和抑制率曲线图以及阳性对照药物盐酸胍应用EV71 C4(BrCr)感染的Vero细胞所得的细胞存活率曲线和抑制率曲线图；
图4是本发明片仔癀(PZH)应用于EV71 C4(BrCr)感染RD细胞(MOI＝0.01)所得的细胞存活率曲线和抑制率曲线图以及阳性对照药物盐酸胍应用EV71 C4(BrCr)感染的RD细胞所得的细胞存活率曲线和抑制率曲线图；
图5是本发明片仔癀(PZH)应用于EV71 C4(BrCr)感染Vero细胞(MOI＝1.5)的感染性病毒颗粒生产的抑制图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
仪器和材料
病毒株：
EV71-GFP报告病毒(基于EV71HeN09病毒株构建)为中国科学院武汉病毒研究所张波研究员赠予；
EV71 C4(SZDX，临床分离株)为苏州大学许琼明老师赠予；
EV71 C4(BrCr，野生型)来源于中国科学院武汉病毒研究所。
细胞模型：
非洲绿猴肾细胞Vero细胞和人恶性胚胎横纹肌瘤RD细胞为中国科学院武汉病毒研究所实验室传代保存。
培养条件：DMEM+10％胎牛血清，37℃条件下培养，CO2气体体积浓度为5％。
样品：
片仔癀样品(简称片仔癀)由漳州片仔癀药业股份有限公司提供。
称取400mg片仔癀粉末(取锭剂粉碎成细粉)加入到20mL PBS中，于37℃水浴超声溶解30min后室温放置20h，离心取上清，用0.22μM的滤膜过滤分装，于-40℃保存备用，贮存浓度记为20mg/mL，使用时稀释至最高测试浓度2mg/mL，制成片仔癀药物溶液。
阳性药物为盐酸胍由中国科学院武汉病毒研究所实验室提供，贮存浓度为5M为，使用时稀释至最高测试浓度1mM，制成盐酸胍药物溶液。
主要试剂
DMEM基础培养基：Life Science：Cat.No.12800-17，Lot No.1837973，按照说明书配置备用；
FBS:Biological Industry，Cat.No.04-001-1ACS-500mL，Lot No.1837973；
青链霉素(PS)：碧云天，Cat.No.ST488，配置成200000U/mL，过滤分装备用；
DMEM完全培养基用于药物毒性和抗病毒活性的细胞培养：DMEM+10％FBS+100U/mLPS；
DMEM维持培养基用于培养病毒：DMEM+2％wtFBS+100U/mL PS；
磷酸盐缓冲液(PBS)用于药物毒性和抗病毒活性的细胞清洗：1000mL ddH2O中加入NaCl 8.1816g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，KH2PO4 0.24g，搅拌溶解，调pH至7.3，高温高压灭菌后备用；
胰酶(Trypsin)用于药物毒性和抗病毒活性的细胞消化：Amaresco，Cat.No.0458-25G，Lot No.2466280。配置成0.25％Trypsin-EDTA备用，配置方法为：称取0.25g胰酶粉末加入到PBS溶液中，置于冰上低速搅拌溶解，调pH至7.4，加入0.02g的EDTA，继续冰上低速搅拌至溶解，0.22μM滤膜过滤分装；CellTiterGlo TM：Promega，货号：G7572，LotNo.0000158064，按说明书配置分装储存于-40℃；
EV71检测抗体用于IFA法检测VP-1蛋白：MOUSE ANTI-ENTEROVIRUS 71MONOCLONALANTIBODY,Millipore，货号：MAB979,-4℃保存；
固定液用于IFA法检测VP-1蛋白：质量分数为4％的多聚甲醛；
结合液用于IFA法检测VP-1蛋白：质量分数为3％的BSA、质量分数为0.3％的Triton-100溶于PBS中；
封闭液用于IFA法检测VP-1蛋白：质量分数为10％的FBS的结合液。I
仪器设备
二氧化碳培养箱：Thermo；
生物安全柜：哈东联(HDL)；
酶标仪：PerkinElmer型号Envision；
细胞计数仪：伯乐(Bio-Rad)TC10TM；
高内涵细胞分析仪：PerkinElmer HCS。
实施例1
片仔癀(锭剂，3g/粒)用于肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹，八岁以下儿童一次0.15-0.30克，一日2-3次；成人一次0.3-0.9克，一日2-3次。
实施例2
取片仔癀胶囊(0.3g/粒，由锭剂粉碎成颗粒及粉末装成胶囊)，用于肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹，八岁以下儿童一次0.15-0.30克，一日2-3次；成人一次0.3-0.9克，一日2-3次。
实施例3
取实施例1中片仔癀粉碎成颗粒，加入常规辅料按照常规工艺制备得到片仔癀片剂(每片含片仔癀0.3g)，用于肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹，八岁以下儿童一次0.15-0.30克，一日2-3次；成人一次0.6克，一日2-3次。
实施例4
本实施例所述片仔癀片剂与实施例3基本相同，区别仅在于，每片含片仔癀0.6g。
实施例5
取实施例1中片仔癀粉碎成颗粒，加入常规辅料按照常规工艺制备得到片仔癀颗粒剂(每袋含片仔癀1.8g)，用于肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹，八岁以下儿童一次0.15-0.30克，一日2-3次；成人一次0.6克，一日2-3次。
实施例6
取实施例1中片仔癀粉碎成细粉，加入常规辅料按照常规工艺制备得到片仔癀颗粒剂(每袋含片仔癀6g)，用于肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹，八岁以下儿童一次0.15-0.30克，一日2-3次；成人一次0.6克，一日2-3次。
实施例7
取实施例1中片仔癀粉碎成细粉，加入常规辅料按照常规工艺制备得到片仔癀合剂(每ml含片仔癀0.1g)，用于肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹，八岁以下儿童一次1.5-3ml，一日2-3次；成人一次6ml，一日2-3次。
实施例8
取实施例1中片仔癀粉碎成细粉，加入常规辅料按照常规工艺制备得到片仔癀酊剂(每ml含片仔癀0.1g)，用于肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹，八岁以下儿童一次1.5-3ml，一日2-3次；成人一次6ml，一日2-3次。
实施例9
取实施例1中片仔癀粉碎成细粉，加入常规辅料按照常规工艺制备得到片仔癀喷剂(每ml含片仔癀0.1g)，用于治疗肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹，擦于患处，每日3-6次。
实施例10
取实施例1中片仔癀粉碎成细粉，加入常规辅料按照常规工艺制备得到的片仔癀膏剂(每g含片仔癀0.03g)，用于治疗肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹，涂于患处，每日2-4次。
实施例11
本实施例所述片仔癀膏剂和实施例10基本相同，区别仅在于，每克片仔癀膏剂含片仔癀0.1g。
实验例1发光法检测片仔癀及其制剂对Vero细胞/RD细胞的毒性
1.实验原理
CellTiter-Glo试剂盒通过对ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目，有代谢活性细胞的呼吸作用和其他生命活动过程可以产生ATP，试剂盒中使用萤光素酶生成的稳定辉光型信号，发光过程中萤光素酶需要ATP的参与，向细胞培养基中加入等体积CellTiter-Glo试剂，测量发光值，光信号和体系中ATP量成正比，而ATP又和活细胞数正相关，因此光信号值可以反映细胞活性，药物对细胞的毒性的大小与活细胞的数目，即细胞活性呈反比，并以细胞活性来反映。
2.实验方法
步骤一：提前24h，将Vero细胞(或RD细胞)接种于96孔细胞培养板中，每孔10000个细胞(RD细胞每孔30000个细胞)；
步骤二：将实验药物(片仔癀、盐酸胍)溶液用DMEM维持培养基从最高测试浓度起连续2倍梯度稀释10个梯度，每个梯度设置2个平行孔；
步骤三：实验设细胞对照组(加细胞，未加药物)，药物组Ⅰ(加细胞和片仔癀药物溶 液)，药物组Ⅱ(加细胞和盐酸胍药物溶液)，空白对照组(未加细胞，检测时只加检测试剂)，其中药物组I和药物组II都使用步骤二所述的经连续2倍梯度稀释含有药物的DMEM维持培养基，于37℃的含CO2体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养；
步骤四：按照CellTiter-Glo试剂盒说明书操作，对荧光信号进行检测，荧光信号利用多功能读板仪进行读取(EnspireMultilabelReader，Perkin El mer)，计算细胞活性(药物对细胞的毒性的大小与细胞的活性呈反比，以细胞活性来反映药物的细胞毒性)。
3.实验结果
Figure BDA0002090325260000101
所述方程式中，药物组荧光值为药物组Ⅰ荧光值或药物组Ⅱ荧光值，空白对照组荧光值为未加细胞的检测试剂溶液荧光值；
利用Graphpad Prism软件，以细胞活性分别绘制药物组Ⅰ和药物组Ⅱ的V ero细胞和RD细胞存活率曲线(如图1-4的虚线)，通过软件中的计算公式lo g(inhibitor)vs.normalized response–Variable slope计算得出片仔癀在Vero细胞和RD细胞的半数存活浓度CC50(使得50％的细胞发生病变时的药物浓度)分别为0.8792mg/mL和0.6913mg/mL。
实验例2CPE法检测片仔癀在Vero细胞中抗EV71-GFP病毒活性
1.CPE法实验原理
EV71病毒感染细胞后，会使细胞产生团缩、折光性改变、凋亡等病变(CPE)，而药物可以保护细胞，通过检测的细胞存活率(细胞活性)可反映药物对细胞的保护作用。
2.实验方法
步骤一：提前24h，将Vero细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔10000个细胞；
步骤二：将药物(片仔癀、盐酸胍)溶液用DMEM培养基从最高测试浓度起连续2倍梯度稀释10个梯度，每个梯度设置2个平行孔；
步骤三：实验设无病毒感染的细胞对照组，EV71-GFP病毒感染后加片仔癀药物溶液的药物组Ⅰ和EV71-GFP病毒感染后加阳性对照药物盐酸胍的药物组Ⅱ，EV71-GFP病毒感染细胞后未加药物的病毒对照组(加等量培养基)，其中药物组I和药物组II都使用步骤二所述的含有经连续2倍梯度稀释药物的DMEM维持培养基，且在药物组Ⅰ和药物组Ⅱ和病毒对照组中添加病毒液进行感染，病毒感染的滴度MOI＝0.6，于37℃的含CO2体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养；
步骤四：Vero细胞培养60h后观察CPE程度，当病毒对照组的细胞有75％以上的细胞出现CPE时，检测细胞存活率，以试验例1所述的细胞活性的检测方法来测试细胞存活率，并计算药物的半数存活浓度CC50和药物对病毒的抑制率。
Figure BDA0002090325260000121
所述方程式中，药物组荧光值为药物组Ⅰ荧光值或药物组Ⅱ荧光值；
绘制抑制率曲线和细胞存活率曲线，并利用抑制率曲线计算药物的半数抑制浓度EC50(能够有效抑制50％细胞感染病毒的药物浓度)。
3.实验结果
片仔癀在Vero细胞对EV71-GFP的抑制作用和对Vero细胞的毒性结果如图1和表1所示，片仔癀对Vero细胞的CC50为0.8792mg/mL，EC50为0.0205mg/mL，选择指数SI＝CC50/EC50＝42.9。
实验例3 CPE法检测片仔癀在RD细胞中抗EV71-GFP病毒活性
本实验例与实验例2基本相同，区别仅在于：
在步骤一中，提前24h，将RD细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔30000个细胞；
在步骤三中，采用EV71-GFP感染细胞，病毒感染的滴度为MOI＝0.05；
在步骤四中，RD细胞培养40h后观察CPE程度。
片仔癀在RD细胞对EV71-GFP的抑制作用和对RD细胞的毒性结果如图2和表1所示，片仔癀对RD细胞的CC50为0.6913mg/mL，EC50为0.0092mg/mL，其中选择指数SI＝CC50/EC50＝75。
实验例4 CPE法检测片仔癀在Vero细胞中抗EV71 C4(BrCr)病毒活性
本实验例与试验例2基本相同，区别仅在于：
在步骤三中，采用EV71 C4(BrCr)感染细胞，病毒感染的滴度为MOI＝0.2。
片仔癀在Vero细胞对EV71 C4(BrCr)的抑制作用和对Vero细胞的毒性结果如图3和表1所示，片仔癀对Vero细胞的CC50为0.8792mg/mL，EC50为0.0895mg/mL，其中选择指数SI＝CC50/EC50＝9.8。
实验例5 CPE法检测片仔癀在RD细胞中抗EV71 C4(BrCr)病毒活性
本实验例与试验例2基本相同，区别仅在于：
在步骤一中，提前24h，将RD细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔30000个细胞；
在步骤三中，采用EV71 C4(BrCr)感染细胞，病毒感染的滴度为MOI＝0.01；
在步骤四中，RD细胞培养40h后观察CPE程度。
片仔癀在RD细胞对EV71 C4(BrCr)的抑制作用和对RD细胞的毒性结果如图4和表1所示，片仔癀对RD细胞的CC50为0.6913mg/mL，EC50为0.1063mg/mL，其中选择指数SI＝CC50/EC50＝6.5。
表1 PZH对EV71的抑制作用和对细胞的毒性作用
Figure BDA0002090325260000131
Figure BDA0002090325260000141
注：SI＝CC50/EC50
试验例6GFP法检测片仔癀在Vero细胞中抑制EV71-GFP病毒活性
1.实验原理
EV71-GFP携带GFP(绿色荧光蛋白)基因，病毒感染细胞后，GFP得到表达，通过检测GFP的表达量可以判断药物对病毒复制的抑制情况。
2.实验方法
步骤一：提前24h，将Vero细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔10000个细胞；
步骤二：将片仔癀药物溶液用DMEM维持培养基从最高测试浓度起连续2倍梯度稀释10个梯度,每个梯度设置2个平行孔；
步骤三：实验设无病毒感染的细胞对照组，EV71-GFP病毒感染后加片仔癀药物溶液的药物组Ⅰ，EV71-GFP病毒感染后未加药物的病毒对照组，其中药物组Ⅰ使用步骤二所述的经连续2倍梯度稀释含有片仔癀的DMEM维持培养基，所述细胞对照组和病毒对照组采用不含片仔癀药物溶液的DMEM维持培养基，且在药物组Ⅰ和病毒对照组中添加病毒液进行感染，病毒感染的滴度为MOI＝1、0.2或0.04，于37℃的含CO2体积分数为5％的二氧化碳培养箱中培养；
步骤四：分别在培养24h和48h后利用高内涵显微镜(HCS)观测及分析GFP表达情况，检测报告蛋白GFP的表达，并统计分析和计算片仔癀对病毒的抑制率。
Figure BDA0002090325260000142
所述方程式中，药物组荧光值为药物组Ⅰ荧光值。
3.实验结果
结果如表2所示，片仔癀对不同滴度的EV71-GFP感染Vero细胞具有很强的剂量依赖的抑制作用，其选择指数SI在79.2-113.5之间，提示其具有较强的EV71活性。
表2 PZH对不同MOI的EV71-GFP的抑制作用
Figure BDA0002090325260000151
实验例7免疫荧光法检测片仔癀抑制EV71 C4(BrCr)和EV71 C4(SZDX)病毒感染VERO细胞的结构蛋白VP-1表达
1.实验原理
EV71 C4病毒株感染Vero细胞后，病毒的结构蛋白VP-1随着病毒的复制得以表达，通过间接免疫荧光方法(Indirect immunofluorescence assay,IFA)检测VP-1蛋白来确定样品对病毒的抑制效果。
2.实验方法
步骤一：将Vero细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔10000个细胞，细胞贴壁后备用；
步骤二：片仔癀和盐酸胍药物溶液用DMEM维持培养基从2×最高测试浓度起连续2倍梯度稀释10个梯度，每个梯度设置2个平行孔；
步骤三：设无病毒感染的细胞对照组，EV71 C4(BrCr)或EV71 C4(SZDX)病毒感染后加片仔癀药物溶液的药物组Ⅰ和加阳性对照药物盐酸胍的药物组Ⅱ，EV71 C4(BrCr)病毒感染后未加药物的病毒对照组，其中药物组Ⅰ和药物组II都使用步骤二所述的经连续2倍梯度稀释含有药物的DMEM维持培养基，所述的细胞对照组和病毒对照组采用不含药物溶液的DMEM维持培养基；且药物组Ⅰ和药物组II和病毒对照组在弃去培养上清后，将稀释好的药物(病毒对照组加DMEM维持培养基)加入细胞孔中，同时加入稀释的EV71 C4病毒液进行感染，其中EV71 C4(BrCr)病毒感染的滴度为MOI＝1.5或0.015，EV71 C4(SZDX)病毒感染的滴度为MOI＝6或0.03，于37℃的含体积分数为5％的CO2培养箱中培养；
步骤四：培养48h后采用PBS洗涤并采用固定液固定细胞，用IFA方法检测病毒蛋白表达情况。实验设细胞对照、病毒对照。利用GraphPad Prism软件作图计算出样品对EV71VP-1的抑制作用，计算出半数有效浓度(EC50)。
Figure BDA0002090325260000161
所述方程式中，药物组荧光值为药物组Ⅰ荧光值或药物组Ⅱ荧光值。
结果如表3所示，表明片仔癀及其制剂可以剂量依赖地抑制两种EV71 C4病毒感染的病毒蛋白VP-1的表达，其在不同MOI下的选择指数SI在27.9-109，提示片仔癀具有较强的抗EV71活性。
表3 PZH对EV71的VP-1的抑制作用
Figure BDA0002090325260000162
实验例8 CPE法检测片仔癀抑制EV71 C4(BrCr)感染VERO细胞病毒颗粒的产生
1.实验原理
EV71病毒感染Vero细胞后，感染细胞会出现肿胀、变圆等病变，通过观察CPE可确定EV71的滴度。将药物处理后的细胞培养上清通过测定TCID50(致半数细胞病理改变的病毒感染剂量)法(极限稀释法)可测定感染性病毒颗粒的产生水平。
2.实验方法
步骤一：将Vero细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔10000个，培养至细胞贴壁后备用；
步骤二：将片仔癀药物溶液用DMEM维持培养基从最高测试浓度起连续2倍梯度稀释10个梯度，每个梯度设置2个平行孔；
步骤三：设EV71 C4(BrCr)病毒感染后加片仔癀药物溶液的药物组Ⅰ，EV71C4(BrCr)病毒感染后未加药物的病毒对照组，所述药物组Ⅰ待细胞长成单层后加入含不同稀释倍数的片仔癀DMEM维持培养基和稀释的病毒液EV71 C4(BrCr),所述病毒对照组加入稀释的病毒液EV71 C4(BrCr)，最终MOI为1.5；
步骤三：37℃培养3h后，弃除上清，细胞用PBS洗一次后重新加入含药的DMEM维持培养基继续培养；
步骤四：每天观察并记录细胞出现特异性CPE情况，待培养45h收集上清；
步骤五：上清样品采用极限稀释法稀释，每个梯度六个重复，加入新铺好的Vero细胞中培养，每天观察并记录CPE情况，在培养3天后判断终点，通过Karber法计算TCID50(致半数细胞病理改变的病毒感染剂量)。
Figure BDA0002090325260000171
绘制抑制率曲线，计算药物的半数抑制浓度(EC50)。
3.实验结果
用EV71 C4(BrCr)感染Vero细胞，加入含不同浓度的片仔癀的DMEM维持培养基培养细胞45h后收取上清，测定培养上清中新产生的感染性病毒颗粒的滴度，片仔癀浓度与TCID50结果如表4，片仔癀对感染性病毒颗粒产生的抑制作用结果如图5所示。
表4不同PZH浓度对应的TCID50
Figure BDA0002090325260000181
实验结果表明，片仔癀可以剂量依赖地抑制EV71 C4感染性病毒颗粒的产生，其CC50为0.6966mg/mL，EC50为0.01588mg/mL，选择指数为43.9，说明片仔癀具有抑制EV71感染性病毒颗粒产生的活性。
综上，片仔癀可减少EV71报告病毒(EV71-GFP)和野生型病毒EV71 C4感染的VERO和RD细胞的CPE，减少EV71报告病毒的报告蛋白GFP的含量，抑制EV71的核心蛋白VP-1的表达，抑制EV71感染性病毒颗粒的产生，具有较强的抗EV71活性。
上述实施方式仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.片仔癀及其制剂作为唯一活性成分在制备预防和治疗肠道病毒EV71感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的片仔癀及其制剂作为唯一活性成分在制备预防和治疗肠道病毒EV71感染药物中的应用，其特征在于，所述预防和治疗肠道病毒EV71感染药物包括预防和治疗由肠道病毒EV71感染导致的手足口病、咽峡炎或皮疹的药物，所述预防和治疗肠道病毒EV71感染药物的剂型包括锭剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、合剂、酊剂、喷剂、膏剂中至少一种组成的口服给药、外用给药剂型。
3.根据权利要求1或2所述的片仔癀及其制剂作为唯一活性成分在制备预防和治疗肠道病毒EV71感染药物中的应用，其特征在于，所述预防和治疗肠道病毒EV71感染药物每单位剂量中含片仔癀为0.03-0.9g。
4.片仔癀及其制剂作为唯一活性成分在制备抑制肠道病毒EV71复制药物中的应用。
5.片仔癀及其制剂作为唯一活性成分在制备减少肠道病毒EV71病毒蛋白VP-1表达药物中的应用。
6.片仔癀及其制剂作为唯一活性成分在制备降低肠道病毒EV71子代感染性病毒颗粒产生水平药物中的应用。
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