CN110452886A - 一种柯萨奇cva4病毒株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种柯萨奇CVA4病毒株及其应用。所述病毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17586，保藏日期为2019年4月25日，滴度为108.6TCID50/ml，其建立的稳定乳鼠感染模型，能够呈现与人类相似的病理变化，在此基础上首次验证CVA4全病毒灭活疫苗的免疫原性，并发现IFN‑α2a和毒株YT226R疫苗的抗血清在体内外具有理想的抗CVA4效果，其建立的CVA4动物模型在研究HFMD的发病机制、评价疫苗的有效性及抗病毒药物的筛选等方面具有十分重要的作用。

Description

一种柯萨奇CVA4病毒株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种柯萨奇CVA4病毒株及其应用。
背景技术
柯萨奇CVA4病毒(coxsackievirus A4，CVA4)属于小RNA病毒科肠道病毒A组成员，主要引起儿童疱疹性咽峡炎，也可引起手足口病HFMD。2009之前，引起HFMD的病原体主要是肠道病毒71型(EVA71)和CVA16，近几年在人群中其它型肠道病毒，比如CVA4、CVA6和CVA10感染率越来越高，并且出现CVA4与其它肠道病毒混合感染和基因重组事件，给临床诊断造成很大困难。尽管肠道病毒的感染通常是温和性、无症状的，但它们的传染性极高，临床症状多样，范围可从皮肤和粘膜出现疱疹的轻微症状，到引起无菌性脑膜炎、心肌炎和急性迟缓性麻痹等严重症状，因此，CVA4的感染对儿童身心健康造成极大危害，所涉及的公共卫生安全问题日益受到关注。
目前，临床治疗HFMD没有特效药物，主要采用广谱抗病毒药物利巴韦林和糖皮质激素对症治疗，但很难避免这些药物对人体先天免疫功能的损害和导致机体造血系统紊乱，接种疫苗是预防肠道病毒感染的最佳途径。CVA4的抗病毒研究尚处在起步阶段，关于CVA4动物模型的建立和灭活疫苗免疫原性的研究未见报道。
随着EVA71全病毒灭活疫苗在中国5岁以下儿童中推广接种，该疫苗有效免疫保护力可持续五年以上，可预见未来几年内HFMD的病毒谱必将发生改变，其它型肠道病毒感染率会逐渐上升，因此亟需研究CVA4的感染机制和开发抗病毒感染的药物和疫苗。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种柯萨奇CVA4病毒株及其应用，该毒株可用于CVA4动物模型的建立和灭活疫苗制备，对CVA4感染机制研究以及开发抗病毒感染的药物和疫苗具有重要意义。
首先，本发明提供了一株柯萨奇CVA4病毒株，所述病毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17586，分类命名为柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A组4型，病毒株编号为CVA4/YT226R/Shandong/China/2015，保藏日期为2019年4月25日，该病毒株以下简称病毒株YT226R。
本发明还提供了由所述病毒株YT226R或所述核酸分子、表达盒、重组载体、重组微生物或细胞系制备得到的用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品；优选的，所述疾病为柯萨奇CVA4病毒导致的疾病：疱疹性咽峡炎、手足口病、脊髓灰质炎、出疹性热病、心肌炎、和/或心包炎，更优选的，所述疾病为手足口病。
所述产品选自纯化的病毒颗粒、灭活的病毒、抗体、抗血清、疫苗、免疫原或其他免疫组合物；优选的，所述疫苗为灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗；更优选的，所述疫苗为灭活疫苗；更优选的，所述灭活采用加热或化学试剂处理灭活；优选的，所述化学试剂选自甲醛或/β-丙内酯；更优选的，所述化学试剂为甲醛；优选的，甲醛的终浓度为0.2-0.6％，优选0.3％-0.5％，更优选0.4％。
在上述产品中，所述病毒株YT226R还可以与其他类型的柯萨奇病毒株组合使用；优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自A6、EV71、A16病毒株或其任意组合。
当上述产品为疫苗时，单独使用所述病毒株YT226R可以制备单价疫苗，同时使用所述病毒株YT226R与其他类型的病毒株时，可以得到二价疫苗、三价疫苗、四价疫苗以及其他的多价疫苗。
在上述产品中，还包括佐剂；优选的，所述佐剂为弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或铝盐；优选的，所述铝盐选自氢氧化铝或磷酸铝；更优选的，所述佐剂为氢氧化铝；优选的，所述佐剂与所述病毒株的用量体积比为1:5-5:1，更优选1:2-2:1，更优选1:1。
另一方面，本发明还提供了所述病毒株YT226R或所述核酸分子、表达盒、重组载体、重组微生物或细胞系在制备用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品中的应用；
另一方面，本发明还提供了一种制备所述产品的方法，包括利用所述病毒株YT226R作为活性成分制备所述产品的步骤；
优选的，所述方法包含将所述病毒株YT226R进行培养的步骤；
更优选的，将所述病毒株YT226R在细胞株中进行培养；
更优选的，所述细胞株选自RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、Hep-2细胞、WI-38细胞或其任意组合，更优选的，所述细胞株为RD细胞。
在一种具体的实施方式中，本发明提供了一种对抗柯萨奇CVA4病毒的疫苗，该疫苗包括所述病毒株YT226R的颗粒；优选的，所述疫苗中所述毒株的颗粒无病毒活性。
在一种具体的实施方式中，本发明还提供了一种对抗柯萨奇CVA4病毒的抗体，以所述病毒株YT226R为免疫原制备得到；可选的，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；
优选的，所述抗体为多克隆抗体，更优选的，所述多克隆抗体为中和抗体。
本发明有益效果如下：
本发明筛选到一株新的柯萨奇CVA4病毒株YT226R(CGMCC No.17586)，其滴度为108.6TCID50/ml，用其建立的稳定乳鼠感染模型，能够呈现与人类疾病尤其是手足口病相似的病理变化。在此基础上首次验证CVA4全病毒灭活疫苗的免疫原性，并发现IFN-α2a和毒株YT226R疫苗的抗血清在体内外具有理想的抗CVA4效果。本发明建立的CVA4动物模型在研究HFMD的发病机制、评价疫苗的有效性及抗病毒药物的筛选等方面具有十分重要的作用。
生物材料保藏说明
病毒株编号：CVA4/YT226R/Shandong/China/2015；
分类命名：柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A组4型；
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏单位简称：CGMCC；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101；
保藏日期：2019年4月25日；
保藏编号：CGMCC No.17586；
附图说明
图1为基于全球CVA4毒株全基因组序列比对的系统发育树(7.4kb)。
图2为CVA4毒株YT226R感染乳鼠动物模型的建立。
图3为CVA4毒株YT226R感染乳鼠动物模型的组织病理学检测-切片HE染色结果(200×)，其中，图A为感染组肺部，图B为感染组后肢肌，图C为感染组脊柱肌，图D为感染组心脏，图E为对照组肺部，图F为对照组后肢肌，图G为对照组脊柱肌，图H为对照组心脏。
图4为CVA4毒株YT226R感染乳鼠动物模型的组织中CVA4病毒载量变化。
图5为CVA4毒株YT226R感染乳鼠动物模型的炎性细胞因子表达水平，其中，图A—D分别为炎性细胞因子IFN-γ,IL-6,IL-10,IL-4的表达情况。
图6为利巴韦林和细胞因子体外抗CVA4毒株YT226R作用，其中，图A为利用CCK 8法检测各药物对CVA4毒株YT226R的抑制率，图B为qRT-PCR检测8～48hpi(感染后小时数)细胞上清液中CVA4毒株YT226R绝对拷贝数变化，其中CVA4为阳性对照组结果。
图7为利巴韦林和细胞因子体内抗CVA4毒株YT226R作用。
图8为CVA4抗血清与其他肠道病毒的交叉保护作用。
图9为母源抗体对CVA4感染的保护作用，其中，CVA4代表注射致死剂量的CVA4毒株YT226R病毒液(100LD50)处理。
图10为母源抗体对异源CVA4感染的保护作用。
图11为抗CVA4血清的保护作用。
以上附图中，*代表差异显著P<0.05，**代表差异显著P<0.01，***代表差异显著P<0.001，n.s.代表差异不显著。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中实验动物为远系杂交的SPF ICR小鼠[合格证号：SCXK(京)2012-0001]，小鼠饲养和处置符合山东省实验动物管理委员会的动物福利与伦理指导意见。
下述实施例中统计学方法采用GraphPad Prism 5(GraphPad 5Software,SanDiego,CA,USA)软件进行数据统计分析。采用Mantel-Cox log rank软件对各组乳鼠的存活率和死亡率进行评估。采用two-tailed Mann-Whitney U检验对组织病毒载量和TCID50验证。定量变量采用均值、t检验或方差分析进行整理分析，P<0.05作为差异显著。
下述实施例中TCID50指半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量，即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(CPE)所需的病毒量。
下述实施例中临床评分的标准为：0分：健康，1分：嗜睡或无精打采，2分：消瘦或后肢无力，3分：单后肢瘫痪，4分：双后肢瘫痪，5分：死亡。
下述实施例中细胞培养液为含10％胎牛血清和1％青链霉素合剂的MEM培养基。
实施例1、CVA4病毒株的采集、分离和鉴定
1、采集
收集2015年中国山东省内医院HFMD病人发病3日内采集的粪便样本，低温运输并于-70℃冰箱保存。
2、分离和培养
将RD细胞(人横纹肌乳头瘤细胞)于含有10％胎牛血清的MEM细胞培养液中培养，将步骤1采集的样本分别接种至该RD细胞培养液中，于37℃、5％CO2孵育24h，保留出现明显细胞病变(CPE)的RD细胞培养液。
3、鉴定
将步骤2保留的培养液分别通过Trizol法提取病毒RNA，通过RT-PCR(使用引物为CVA4病毒VP1基因扩增引物)进一步筛选含CVA4的培养液，蚀斑纯化CVA4病毒收获单克隆CVA4病毒株，并通过所述RT-PCR确定为CVA4病毒株，再进一步全基因组测序CVA4病毒株，其中CVA4毒株YT226R为新的CVA4病毒株。
采用邻接法构建基于全球CVA4毒株全基因组序列比对的系统发育，分析确定CVA4毒株YT226R的基因型，结果如图1所示：CVA4毒株YT226R的基因型为D2亚型，其中，对随机种子进行了1000次重复，只显示引导值(>70％)的结果；箭头所示CVA4毒株分别为：YT226R和山东不同地区3个临床分离株：LY124R、H337、16114。
4、CVA4毒株YT226R的TCID50测定
取CVA4毒株YT226R接种RD细胞37℃、5％CO2条件下培养24h出现明显细胞病变(CPE)，获得CVA4毒株YT226R的病毒液。
将CVA4毒株YT226R的病毒液经8000g离心和0.22μm滤膜过滤后，采用Reed-Muench法(Reed LJ,Muench H.1938.A simple method of estimating 50 percent end-points.Am J Epidemiol 27:493-497.)对CVA4毒株YT226R进行定量为108.6TCID50/ml，-80℃冻存供后续实施例使用。
实施例2、对抗柯萨奇CVA4病毒的疫苗制备
取CVA4毒株YT226R病毒液(108.6TCID50/ml)10ml于37℃条件下加入37％(质量分数)的甲醛溶液，甲醛终浓度为0.4％，作用5天，再与氢氧化铝凝胶(InvivoGen公司产品)按体积比1:1混合制备CVA4全病毒灭活疫苗，将疫苗接种RD细胞并连续传代三次确定无活病毒存在，保存备用。
实施例3、对抗柯萨奇CVA4病毒的抗体制备
取实施例2制备好的CVA4全病毒灭活疫苗，对6～8周龄成年雄性ICR小鼠进行首次皮下接种，分别在左腹部、右腹部和背部各注射50μl。间隔两周后，小鼠在同样位置再次皮下免疫相同剂量的灭活疫苗。加强免疫后一周，从小鼠的眼眶静脉丛取血，每只小鼠取大约1～2ml静脉血于离心管中。将装有血液的离心管在室温条件下静置20分钟后，置于4℃冰箱中过夜。在4℃，5000rpm条件下，血液离心30分钟，取上层血清(即对抗柯萨奇CVA4病毒的抗体)分装至每管20μl，-20℃保存备用。
所述抗体滴度通过微量中和检测为几何平均滴度GMT＝3444.32。
实施例4、CVA4毒株YT226R感染乳鼠构建动物模型
1、最佳感染剂量
将CVA4毒株YT226R病毒液(108.6TCID50/ml)用MEM培养基连续10倍倍比稀释后分别按104.6TCID50/只、103.6TCID50/只、102.6TCID50/只、101.6TCID50/只、100.6TCID50/只通过肌肉途径(IM)感染不同组(每组乳鼠8～10只)的3日龄乳鼠，并设空白对照(NC)。乳鼠感染后，每天观察并记录乳鼠的体重变化、临床评分和生存率。
结果：如图2中的A、B和C图所示，感染剂量≥102.6TCID50/只的乳鼠出现临床症状时间≤2dpi(感染后的天数)，而感染剂量为101.6TCID50/只的乳鼠4dpi时出现症状，至9dpi全部死亡，与其他感染剂量的乳鼠相比，该剂量感染的乳鼠病程时间较长，出现神经麻痹、单或双后肢瘫痪、直至濒死等明显的临床症状，因此选择101.6TCID50/只为最佳感染剂量。
2、最佳感染途径
将CVA4毒株YT226R病毒液(108.6TCID50/ml)用MEM培养基稀释后按101.6TCID50/只的剂量分别通过不同的途径IM、腹腔(IP)和颅脑注射(IC)感染不同组(每组乳鼠8～10只)的3日龄乳鼠，并设空白对照(NC)。乳鼠感染后，每天观察并记录乳鼠的体重变化、临床评分和生存率。
结果：如图2中的D、E和F图所示，5dpi IM组乳鼠开始表现神经症状，至8dpi全部死亡，但IP和IC组的乳鼠全部死亡时间超过10天，因此，乳鼠经IM途径更易感CVA4毒株YT226R。
3、最佳感染日龄
选择1、3、7和9日龄乳鼠，每组相同日龄乳鼠8～10只，通过IM注射101.6TCID50/只剂量的CVA4毒株YT226R病毒液，并设3日龄乳鼠的空白对照(NC)。乳鼠感染后，每天观察并记录乳鼠的体重变化、临床评分和生存率。
结果：如图2中的G、H和I图所示，3日龄乳鼠到8dpi时全部死亡，而7和9日龄乳鼠12dpi死亡率≤50％，且临床评分≤3。由于1日龄乳鼠太小操作较困难且结果误差大，因此选择3日龄乳鼠经IM途径接种101.6TCID50/只建立CVA4感染模型。
病毒的感染模型是医学研究领域中极为重要的实验手段，是研究病毒发病机制和筛选抗病毒药物的基本条件。本申请选择ICR小鼠作为感染动物，原因是ICR小鼠较BALB/c对柯萨奇A组病毒更敏感，且CVA4感染乳鼠对接种剂量、感染途径和乳鼠日龄三因素具有选择性和依赖性。CVA4经IM途径接种可使乳鼠发病最快，肌肉组织能快速吸收CVA4并使病毒随着循环系统散布全身。小日龄乳鼠(≤3)对CVA4最易感，呈现较高的致死率，大日龄乳鼠(≥7)的免疫系统已逐渐发育，CVA4接种后症状轻微甚至无症状，不适合建立模型。通过对感染条件的最优组合，建立的CVA4乳鼠感染模型可实现后续实验的高重复性和稳定性。
实施例5、CVA4毒株YT226R感染乳鼠动物模型的组织病理学检查
感染组：3日龄乳鼠经IM感染致死剂量的CVA4毒株YT226R(100LD50，LD50＝10- 0.4TCID50/只乳鼠)，阴性对照组：3日龄乳鼠经IM接种不含CVA4毒株YT226R的MEM培养基。
当感染组乳鼠临床评分为5时，分别将感染组和阴性对照组乳鼠经乙醚麻醉后处死，取肺、后肢肌、脊柱肌和心脏，经4％甲醛固定、脱水、透化及包埋入石蜡，制作4μm厚度切片，进行HE染色(苏木精-伊红染色，细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色，细胞质和细胞外基质中的成分着红色)和病理观察。
结果如图3所示：感染组肺泡间隔明显增宽，血管扩张充血，间质水肿伴大量以单核细胞为主的炎性细胞浸润(图3A中箭头所指处)；后肢肌和脊柱肌病变严重，均呈现肌纤维坏死和肌束断裂现象(图3B和图3C中箭头所指处)；感染后期心肌组织可见大量的淋巴细胞和单核细胞浸润，并伴有心肌断裂(图3D箭头所指处)；各阴性对照组乳鼠肺、后肢肌、脊柱肌和心脏无明显组织学变化即无明显病理变化(图3E、F、G、H)。
该结果说明，CVA4毒株YT226R感染可引起较为严重的组织病变和炎症反应。
实施例6、CVA4毒株YT226R感染乳鼠动物模型的不同脏器病毒载量动态监测
感染组：3日龄乳鼠经IM感染致死剂量的CVA4毒株YT226R(100LD50，LD50＝10- 0.4TCID50/只乳鼠)，阴性对照组：3日龄乳鼠经IM接种不含CVA4毒株YT226R的MEM培养基。
感染乳鼠后1dpi～5dpi，每隔24h同时取感染组和阴性对照组乳鼠(每组3只乳鼠)的肺脏、后肢肌、脊柱肌和心脏，组织研磨后提取RNA，进行qRT-PCR检测病毒拷贝数，监测不同脏器CVA4载量随时间的变化趋势。
上述qRT-PCR检测方法如下：
将RNA反转录成cDNA。qRT-PCR检测CVA4核酸拷贝数，所用上游引物为：5’-GGCCTCACTCAGAGACATCTAACC-3’；下游引物为：5’-GTCTAGGGACCCATGCCCTCACT-3’；探针为：FAM-TGGACAGCCCACCACCGCAAGTGT-BHQ1；qRT-PCR反应参照肠道病毒的检测体系(DUgo E,Marcheggiani S,Fioramonti I,Giuseppetti R,Spurio R,Helmi K,Guillebault D,Medlin LK,Simeonovski I,Boots B,Breitenbach U,Koker L,Albay M,ManciniL.2016.Detection of human enteric viruses in freshwater from europeancountries.Food Environ Virol 8:206–214.)。反应条件为95℃10min 1个循环，95℃15s40个循环，60℃60s 40个循环，每个循环结束后检测荧光。将CVA4的VP1基因插入pMD18质粒建立qRT-PCR的标准品(质粒拷贝数浓度为102至1010拷贝/μl)并绘制标准曲线，根据每个样本的CT值计算每个样本的病毒拷贝数。
结果：阴性对照组的病毒拷贝数低于荧光定量检测最低极限值102拷贝/μl。感染组的病毒拷贝数如图4所示：各脏器病毒拷贝数在1dpi较低，随后病毒迅速扩散和复制，3dpi时拷贝数达到峰值并趋于稳定，各脏器中，后肢肌的病毒载量最高，3～5dpi达到106拷贝/mg，超过同时期其他脏器结果log10的2～3倍。
该结果表明，肌肉组织是CVA4复制的主要场所，病毒快速复制造成肌束断裂与乳鼠出现后肢瘫痪的临床表现相一致。
实施例7、CVA4毒株YT226R感染乳鼠动物模型的炎性细胞因子表达水平
感染组(CVA4)：3日龄乳鼠经IM感染致死剂量的CVA4毒株YT226R(100LD50)，阴性对照组(NC)：3日龄乳鼠经IM接种不含CVA4毒株YT226R的MEM培养基。
于不同时间点(1～5dpi)每天随机选取感染组和阴性对照组乳鼠(每组选3只)，麻醉后采集外周血(PB)，PB凝固后分离血清，经ELISA法检测血清中炎性细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α的浓度，以检测细胞因子在CVA4感染期间的水平变化，检测的理论极限值为：IFN-γ,1.74pg/ml；IL-4,0.22pg/ml；IL-6,1.17pg/ml；IL-10,1.17pg/ml和TNF-α,1.63pg/ml。
结果如图5所示，感染组的IFN-γ、IL-6在感染初期(1dpi)表达量较低，随后呈现先升后降的趋势，于3dpi分别达到峰值4800pg/ml和1000pg/ml，显著高于阴性对照组(图5A，5B)；感染组的IL-10表达量在1～5dpi相较于阴性对照组均没有显著变化(图5C)；而在2～4dpi，CVA4感染乳鼠后IL-4的表达水平(均值70.5pg/ml)显著低于对照组，呈明显减少的趋势(图5D)。
该结果表明，CVA4诱导的高水平IL-6和IFN-γ以及IL-4的低表达与组织严重的病理损伤密切相关。
肠道病毒感染机体可诱导一系列细胞因子的表达，细胞因子广泛参与机体免疫应答和免疫调节从而清除体内的病毒，也有人认为压倒性的病毒复制结合高水平的细胞因子是诱发HFMD重症的关键因素。本申请中乳鼠感染致死剂量的CVA4后，炎性细胞因子IL-6和IFN-γ的表达水平异常高(峰值为1000pg/ml和4800pg/ml)，与EVA71感染的儿童患者血清中IL-6和IFN-γ表达上升趋势相似。有学者认为持续高水平的IL-6会导致严重的组织损伤，体内经抗IL-6处理后，显著降低组织损伤和增强免疫细胞活性。同样，本研究发现感染CVA4的乳鼠经外源性IL-6治疗后，临床评分更低，加快乳鼠的死亡。有研究显示肠道病毒感染人的神经元细胞后，Th1分泌的IFN-γ表达水平升高，抑制Th2细胞分泌IL-4，导致IFN-γ/IL-4比例失衡，在清除被病毒感染细胞的同时，也产生了过强的炎症反应和细胞免疫反应。
实施例8、利巴韦林和细胞因子体外和体内抗CVA4作用
1、体外抗CVA4毒株YT226R作用
将96孔板中生长密度达到80～90％的RD细胞接种CVA4毒株YT226R(100LD50)1h后，向细胞中分别加入不同稀释浓度的药物：利巴韦林(1000μg/ml)、IL-1β(2000ng/ml)、IL-6(1000ng/ml)、IFN-λ1(1000ng/ml)、IFN-γ(650ng/ml)和IFN-α2a(1000ng/ml)，空白对照组只加入含2％胎牛血清的MEM，阳性对照组只接种CVA4毒株YT226R，在37℃、5％CO2孵育箱中孵育48h，在病毒接种后8h、16h、24h、32h、40h和48h观察CPE(细胞病变效应)，采用CCK8法检测药物对CVA4病毒复制的抑制率，并qRT-PCR检测(方法同实施例6)细胞上清中CVA4病毒载量。
结果：如图6所示，利巴韦林、IFN-α2a、IFN-γ、IL-1β、IFN-λ1和IL-6的体外抑制率分别为92.37％、93.03％、91.03％、48.38％、66.60％和72.19％(图6A)；同时，IL-1β、IFN-λ1和IL-6组的病毒拷贝数要显著高于利巴韦林、IFN-α2a和IFN-γ组(P<0.01,图6B)；其中，空白对照组均未检测到病毒。
结果表明，相比利巴韦林，在体外IFN-α2a和IFN-γ有较好的抗CVA4作用。
2、体内抗CVA4毒株YT226R作用
3日龄乳鼠经IM途径注射100LD50剂量的CVA4毒株YT226R病毒液，感染后1h分别注射不同稀释浓度的药物：利巴韦林(50mg/kg)、IL-1β(50μg/kg)、IL-6(25μg/kg)、IFN-λ1(25μg/kg)、IFN-γ(32.5μg/kg)和IFN-α2a(50μg/kg)，感染后24h再分别IM途径注射一次药物。每天统计各治疗组乳鼠(每组8～10只)的体重、临床评分和生存率至第二次药物治疗后12天为止。同时设空白对照组(NS)，未注射CVA4毒株YT226R病毒液和药物。
结果：如图7所示，在药物治疗后12天时，利巴韦林、IFN-α2a、IL-1β治疗组乳鼠的存活率分别为80％、82％、50％(图7C)，临床评分为1.25、1.47、2.50分(图7B)，体重呈明显的上升趋势(图7A)；IFN-γ、IFN-λ1和IL-6治疗组乳鼠均出现严重的临床症状，至药物治疗后12天全部死亡。
结果表明，相比利巴韦林，在体内IFN-α2a、IL-1β可抑制CVA4的复制，提高乳鼠的生存率。
实施例9、CVA4抗血清的交叉保护作用
将RD细胞铺96孔板(5000个/孔)，培养箱中培养24h，细胞生长密度达到80～90％。用含2％胎牛血清的MEM将实施例3制备的CVA4抗血清(对抗柯萨奇CVA4病毒的抗体)稀释512倍后加入RD细胞，37℃孵育2h，分组并对每组进行如下处理：加入CVA4毒株YT226R(100TCID50)、EVA71(100TCID50)、CVA16(100TCID50)、或CVA6(100TCID50)。空白对照组只加入含2％胎牛血清的MEM，每组处理均设阳性对照，即只加入相同剂量的相应病毒。病毒接种后24h、48h和72h观察CPE，并取细胞上清，提取RNA后，进行qRT-PCR检测细胞上清中CVA4病毒拷贝数，结果取3次重复的平均值。其中，CVA4的qRT-PCR检测方法同实施例6，qRT-PCR检测病毒EVA71的上下游引物和探针分别为：
EVA71-F：5’-TGGCAGACGTAATTGAAAGCTCCATAG-3’，
EVA71-R：5’-AGCTTGGAGTGCTGGAACCTTGC-3’，
EVA71-Pro：5’-FAM-ATACGGGCAAGGTTCCAGCACTCCAAG-BHQ1-3’，
qRT-PCR检测病毒CVA16的上下游引物和探针分别为：
CVA16-F：5’-ACTGTGAACAATCAAGTGAACC-3’，
CVA16-R：5’-CGGCTTGTAGTGCTGGTAC-3’，
CVA16-Pro：5’-Texas-Red-AGTGCCTAACCTGTGACTACTTGCCTC-BHQ2-3’，
qRT-PCR检测病毒CVA6的上下游引物和探针分别为：
CVA6-F：5’-ACTCGCTGTGTGATGAATCG-3’，
CVA6-R：5’-TACCCATCCAGGCTAGTGC-3’，
CVA6-Pro：5’-HEX-TTCACTTCCACAACTCCCACCAGCC-BHQ1-3’。
结果：空白对照组无上述任何病毒，CVA4抗血清能中和CVA4对RD细胞的感染性，48hpi病毒核酸拷贝数低于102拷贝/μl(检测值下限)，但不能中和CVA6、CVA16和EVA71感染(图8A、B和C)。
结果表明，在体外CVA4抗血清缺乏与其它肠道病毒的交叉免疫保护能力。
实施例10、母源抗体保护作用
将实施例2制备的CVA4全病毒灭活疫苗按照100μg/只的剂量对6周龄成年雌鼠进行皮下接种，雌鼠怀孕后，间隔2周以相同剂量灭活疫苗加强免疫一次。母鼠分娩后，3日龄乳鼠IM途径分别注射致死剂量的CVA4毒株YT226R病毒液(100LD50)、异源CVA4(CVA4毒株LY124R(Genbank号MH086031)、H337(Genbank号MH086030)、或16114(Genbank号MH086049)，100LD50)、CVA6(100LD50)、CVA16(100LD50)、或EVA71(100LD50)病毒液，以未注射任何病毒的3日龄乳鼠为对照组(NC)。病毒感染后每天统计各处理组(每组8～10只)乳鼠的体重、临床评分和生存率。
结果：如图9所示，注射CVA4毒株YT226R后，在观察期内体重增长速率正常(图9A)，无明显的症状(图9B)，存活率为100％(图9C)，且母源抗体能使乳鼠抵抗CVA4异源毒株(H337,LY124R,16114)的感染(图10A、B和C)；但是CVA16、EVA71、CVA6感染组乳鼠的症状表现严重(图9B)，分别于6dpi、7dpi、8dpi全部死亡(图9C)，与阴性对照组相比，CVA16、EVA71、CVA6组的乳鼠体重增长速率明显下降(图9A，P<0.001)。
结果表明：灭活的CVA4疫苗能诱导成年雌鼠体液免疫应答，且母源抗体能提供乳鼠对同源和异源CVA4的完全免疫保护力，但不能抵抗不同类型病毒的感染，表明在体内CVA4与CVA16、EVA71和CVA6病毒之间无交叉免疫保护性。
实施例11、CVA4抗血清的治疗作用
3日龄乳鼠经IM途径接种剂量为100LD50的CVA4毒株YT226R病毒液，感染后选择临床评分为1～2的乳鼠为早期治疗组，选择临床评分≥3的乳鼠为晚期治疗组。将实施例3制备的CVA4抗血清(GMT＝3444.32)与MEM分别按照1:1、1:10、1:100和1:1000的体积比混合，获得不同浓度的血清稀释液。
对早期治疗组和晚期治疗组乳鼠经IM途径分别注射50μl不同浓度的血清稀释液进行治疗处理(每个处理8～10只乳鼠)，间隔48h后再注射一次。每天统计各组各处理乳鼠的体重、临床评分和生存率至治疗后12天为止。计算CVA4抗血清的50％被动免疫保护剂量(ED50)。
结果：如图11所示，早期治疗组经1:1、1:10、1:100、1:1000血清稀释液两次治疗12天后，临床评分分别为0、0、0.63、3.75(图11B)，存活率为100％、100％、80％、20％(图11C)，计算ED50＝260；晚期治疗组经两次治疗后，乳鼠临床症状出现时间有所延缓，但1:1、1:10、1:100不同稀释血清治疗处理乳鼠分别在治疗12、11、9天后全部死亡。
结果表明，在病毒感染的早期进行抗体治疗效果好于晚期，因为乳鼠一旦出现严重的神经症状，抗血清很难逆转疾病的进展。
随着CVA4人群中感染率逐年升高，接种CVA4全病毒灭活疫苗是预防CVA4传播和感染最有效的措施。尽管EVA71灭活疫苗已接种儿童，但是缺乏不同型别病毒之间的交叉免疫保护能力。因此，开发CVA4疫苗并验证其良好的免疫原性显得尤为重要。本申请制备的CVA4灭活疫苗也可诱导成年雌鼠产生保护性抗体，并可传递给后代乳鼠，保护乳鼠抵抗致死剂量YT226R的感染。重要的是，对异源CVA4毒株感染乳鼠的保护率同为100％，但缺乏对CVA16、EVA71和CVA6的中和能力，因此将不同病毒的抗原结合起来，研发能同时抵抗不同病毒感染的多价疫苗是非常必要的。CVA4灭活疫苗诱导的抗血清能缓解乳鼠感染早期的临床症状，生存下来的乳鼠恢复正常，但对感染晚期的乳鼠无治疗效果，原因可能是发病晚期的乳鼠(≥3级)已呈现不可逆转的全身炎症反应或者神经系统损伤。同样，由EVA71感染所致的HFMD重症患者，病情恶化迅速，很容易死亡。尽管肠道病毒感染的重症患者比例≤1.1％，但每年发病人数超过百万，因此，HFMD患者一旦病情加重，要及时进行抗病毒和对症治疗。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种柯萨奇CVA4病毒株，其特征在于，所述病毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17586，分类命名为柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A组4型，病毒株编号为CVA4/YT226R/Shandong/China/2015，保藏日期为2019年4月25日。
2.由权利要求1所述病毒株制备得到的用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品；优选的，所述疾病为疱疹性咽峡炎、手足口病、脊髓灰质炎、出疹性热病、心肌炎、和/或心包炎，更优选的，所述疾病为手足口病。
3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品选自纯化的病毒颗粒、灭活的病毒、抗体、抗血清、疫苗、免疫原或其他免疫组合物；优选的，所述疫苗为灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗；更优选的，所述疫苗为灭活疫苗；更优选的，所述灭活采用加热或化学试剂处理灭活；优选的，所述化学试剂选自甲醛或/β-丙内酯；更优选的，所述化学试剂为甲醛。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述病毒株还可以与其他类型的柯萨奇病毒株组合使用；优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自A6、EV71、A16病毒株或其任意组合。
5.根据权利要求2-4中任一所述的产品，其特征在于，所述产品还包括佐剂；优选的，所述佐剂为弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或铝盐；优选的，所述铝盐选自氢氧化铝或磷酸铝；更优选的，所述佐剂为氢氧化铝。
6.权利要求1所述的病毒株在制备用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品中的应用；
优选的，所述疾病为疱疹性咽峡炎、手足口病、脊髓灰质炎、出疹性热病、心肌炎、和/或心包炎；更优选的，所述疾病为手足口病；
优选的，所述产品选自纯化的病毒颗粒、灭活的病毒、抗体、抗血清、疫苗、免疫原或其他免疫组合物；优选的，所述疫苗为灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗；更优选的，所述疫苗为灭活疫苗；更优选的，所述灭活采用加热或化学试剂处理灭活；优选的，所述化学试剂选自甲醛或/β-丙内酯；更优选的，所述化学试剂为甲醛；优选的，甲醛的终浓度为0.2-0.6％，优选0.3％-0.5％，更优选0.4％。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述病毒株还可以与其他类型的柯萨奇病毒株组合使用；优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自A6、EV71、A16病毒株或其任意组合。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述产品还包括佐剂；优选的，所述佐剂为弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或铝盐；优选的，所述铝盐选自氢氧化铝或磷酸铝；更优选的，所述佐剂为氢氧化铝；优选的，所述佐剂与所述病毒株的用量体积比为1:5-5:1，更优选1:2-2:1，更优选1:1。
9.一种制备权利要求2-5中任一所述产品的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的病毒株作为活性成分制备所述产品的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包含将权利要求1所述病毒株进行培养的步骤；
优选的，将所述病毒株在细胞株中进行培养；
更优选的，所述细胞株选自RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、Hep-2细胞、WI-38细胞或其任意组合，更优选的，所述细胞株为RD细胞。
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