CN102274234A - 灵芝酸y在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝酸Y在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用，该发明证实灵芝酸Y在体外对肠道病毒71型感染细胞试验中具有良好的抗病毒作用。同时灵芝酸Y对肠道病毒71型具有一定的杀伤作用，能够预防肠道病毒71型的感染，并对肠道病毒71型感染后的细胞具有较好的治疗作用以及对病毒复制也有较好的抑制作用，其作用效果比阳性对照药利巴韦林更为明显。另外灵芝酸Y对肠道病毒71型引起的炎症反应也有较好的抑制作用，揭示该药物有开发成抗肠道病毒71型药物的前景。

Description

灵芝酸Y在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体涉及一种灵芝酸Y在制备治疗或预防肠道病毒71型(EV71)感染药物中的应用。

背景技术

肠道病毒71型(human enterovirus 71，EV71)是小RNA病毒科肠道病毒属成员，1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来。通常EV71感染t要引起手足口病，病情较轻且多呈自限性，与柯萨奇A16引起的手足口病难以区别。除此之外，EV71还能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹、急性心肺功能紊乱等多种严重的神经系统疾病，甚至死亡。近年来，EV71在世界范围内多次引起疾病暴发或流行，如1997年马来西亚Sarawak地区、1998年中同台湾地区及2008年中国安徽等地均出现r较大规模的EV71暴发流行，并引起死亡。在肠道病毒家族中，EV71和脊髓灰质炎病毒足两类町引起严重神经症状的嗜神经性病毒，随着脊髓厌质炎病毒在全球临近消灭，EV71有可能成为引起严重疾病暴发的病原，有关EV71的研究越来越受到人们的重视。

EV71是小RNA病毒科，肠道病毒属成员。病毒基因组为7408个核苷酸的单股正链RNA，基因组中仅有一个开放阅读框，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P33个前体蛋白，P1前体蛋白编码VP1、VP2、VP3、VP44个病毒外壳蛋白；P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白(2A～2C和3A～3D)。病毒粒子的衣壳由60个亚单位构成，后者由4种衣壳蛋白(VP1～VP4)拼装成五聚体样结构。4种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上。根据病毒衣壳蛋白VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C 3个基因型，其中B型和C型又进一步分为B1、B2、B3、B4以及C1和C2亚型。EV71感染可在同一家庭多成员中传播，成人症状一般较轻，而患儿发病中，并发症和死亡率较高。关于病毒毒力的机制未明，有研究结果显示，EV71毒力决定簇在基因组中并非单一位点，病毒的毒力是多个位点共同作用决定的；另一方面，复杂的宿主因素，如宿主抵抗力水平的差异以及宿主对肠道病毒属内的不同病毒存在免疫交叉保护反应等对病毒的毒力也有影响。McMinn等对1999年澳大利亚流行的EV71的VP1基因进行了序列分析，发现属于同一亚型(C2)的分离株中，只表现HFMD的分离株与具神经毒性的分离株的主要区别在于第170位氨基酸的不同，前者为丙氨酸，而后者是缬氨酸。EV71的VP1蛋白的第170位氨基酸是非常保守的，可能正是这一个氨基酸的变化，改变了VP1蛋白的空间结构，导致病毒与受体结合能力下降，从而使其毒力发生根本的改变。

EV71感染多发生于5岁以下婴幼儿，但其易感因素、传播途径、发病机制及流行趋势等均未明确。目前仍没有安全有效的疫苗来预防EV71的感染。EV71感染患者的治疗主要以对症治疗为主，目前缺乏特异、高效的抗病毒药物。现阶段报道较多并且疗效相对明显的则是用干扰素或是静脉注射丙种球蛋白I VIG)。

目前，中药治疗EV1的报道还不多见，因此，抗EV71病毒的药物的研究方兴未艾。中草药是天然宝库，以其内在科学性和实践的有效性，正日益受到世界各国医药学工作者的关注。中药不仅具有耐药性低、副作用和不良反应少等优点，而且还有抑制病毒复制、调节免疫功能、改善血液循环、解热镇痛、及抗菌消炎等综合功效，其在防治EV71病毒方面具有独特的优势和广阔的发展前景。因此，近年来，国内外均开展了抗EV71病毒中草药的研究，取得了较好的结果。

灵芝是一种珍贵的药用真菌，属于担子菌门，灵芝科，灵芝属。灵芝科的真菌共98种，分属于4个属。其中在《中华人民共和国药典》上收入的作为药材灵芝来源的是灵芝和紫芝。现代研究表明，灵芝具有丰富的营养成分，含有人体必需的氨基酸、脂肪酸、微量元素等，同时是影响人体健康的膳食纤维的很好来源。药理研究表明，灵芝对人体免疫系统、神经系统、心血管系统等均有很好的调节作用，同时具有抗种瘤、抗哀老作用。

灵芝的化学成分复杂，从该属真菌中已分离得到灵芝多糖、三萜类化合物、核苷、氨基酸、甾醇、生物碱等多种成分，其中灵芝多糖、三萜类物质、微量元素是其具有良好的药理作用和临床效果的物质基础，引起了广大科研工作者的关注旧，部分活性物质已经应用于临床。其中，灵芝多糖由于其显著的免疫调节作用受到国内外学者的高度重视，研究不断深入，相对而言，灵芝中的三萜类成分作为另一大类成分，研究的进展却还无法同灵芝多糖相比。灵芝中含有的主要三萜类成分是灵芝酸，而本发明的研究对象灵芝酸Y则是灵芝酸的一种。

虽然灵芝酸在抗肝损伤和抗HIV病毒领域曾被提及过，但是对柯萨奇病毒的抗病毒效果之前曾未有所报道，而对现在较为流行且致病力较强的肠道病毒71型(EV71)的预防与治疗作用也尚并未提及和应用。故本发明是对其新药用价值的发现，对肠道病毒71型(EV71)的预防和治疗提供了一种新的有效药物。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种灵芝酸Y在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用，该药物是一种纯天然药物，具有毒副作用小，有明显治疗作用，也有预防作用，可口服给药，使用方便，为非核苷类化合物，兼有抗炎作用，故能提高治疗过程中的耐受性，提高治疗质量和给药依从性，减轻治疗痛苦。从细胞和分子层面对灵芝酸Y抗EV71病毒作用进行了评价，为其进一步开发应用奠定了良好的基础。表明该药物具有开发成抗EV71病毒的有效药物而应用于临床的前景。

为了实现上述的任务，本发明采用以下技术方案：

通过MTT细胞活性检测与Real-Time荧光定量PCR试验，对前期筛选的有效药物的给药剂量及有效性做出分析。同时采用体外细胞模型——RD细胞，从直接杀病毒、抑制病毒的吸附与入侵、抑制病毒的复制、影响病毒出膜等方面研究药物的抗病毒机制。

研究结果表明灵芝酸Y在细胞水平上对EV71病毒具有良好的预防病毒感染和抗病毒作用，表明该药物可以作为临床上潜在的抗病毒药物进一步开发。

并且灵芝酸Y具有一定的抗感染和消炎作用，同时在临床上用于抗病毒抗肿瘤有很好的应用基础，而病毒所引起的传染性疾病发生过程中常伴随有炎症反应，故该药物在治疗病毒性疾病的同时对病毒所引起的炎症等症状均有较好的缓解和辅助治疗作用。

从而为临床上肠道病毒71型(EV71)性疾病的治疗提供一种安全有效毒副作用小的天然药物。为其进一步开发应用奠定了良好的基础。

1、灵芝酸Y对宿主细胞的毒性测定：

经24-48h培养RD细胞基本长满单层时，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。将灵芝酸Y储存液用细胞培养液逐倍稀释，配置成五个浓度梯度，之后再把不同浓度的药物加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μl，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加药，只加培养液)，再每孔补加100μl细胞培养液，置37℃，细胞培养箱内，培养48小时后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH＝7.4)20ul.继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm(570nm)波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据公式：细胞存活率(％)＝实验孔的OD值/对照孔的OD值×100％计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。实验结果见表1

表1 灵芝酸Y对RD细胞毒性试验结果

实验结果表明：药物在0.8μg/ml——100μg/ml的范围对该细胞没有明显细胞毒性，并且对细胞的生长还有一定的促进作用，表明药物的安全性较好。(由于药物的溶解度的关系，所得到可以作用于细胞的最大药物浓度为100μg/ml)

2、灵芝酸Y对EV71病毒的预防作用：

经24-48h培养RD细胞基本长满单层时，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。将灵芝酸Y储存液用细胞培养液逐倍稀释成实验所需的五个浓度梯度，稀释后再把不同浓度的药物加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μl，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒，加培养液)。药物孵育1H后，弃去上清，用PBS洗三次，加入用培养液稀释的病毒，每孔100μl，室温(20-25℃)孵育1.5小时，弃去病毒液，用PBS洗三次，换新鲜细胞培养液，置于细胞培养箱中培养36-48h，用MTT法检测细胞存活率。通过OD值计算出抑制指数：病毒抑制率(％)＝(药物处理组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)x100％。实验结果见表2：

表2 灵芝酸Y对EV71病毒感染的预防作用

实验结果表明，细胞在被灵芝酸Y提前孵育后，再被病毒感染，成活率也是明显高于病毒对照组的，并且随着药物浓度的增高，对EV71的感染的预防作用越为明显。根据实验数据显示灵芝酸Y在较低浓度时对细胞也有较好的预防病毒感染作用。

3、灵芝酸Y对EV71病毒感染活性的抑制作用：

经24-48h培养RD细胞基本长满单层时，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。将药物用细胞培养液逐倍稀释成实验所需的四个浓度梯度，稀释后再把不同浓度的药物与病毒混合，室温(20-25℃)孵育1h，然后加入到弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μl，每个药物浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒，加培养液)。孵育1.5小时后，弃去药物病毒混合液，用PBS洗三次，换新鲜细胞培养液，置于细胞培养箱中培养36-48h，用MTT法检测细胞存活率。通过OD值计算出抑制指数：病毒抑制率(％)＝(药物处理组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)x100％。实验结果见表3

表3灵芝酸Y对EV71病毒入侵活性的抑制作用

实验结果表明：EV71病毒预先与灵芝酸Y孵育后，感染细胞的活性明显减弱，并且在4ug/ml的浓度下，病毒抑制率可达到76.02％，是实验组的最高，该数据显示灵芝酸Y对EV71病毒感染细胞的活性有明显的抑制作用。

4、灵芝酸Y对EV71病毒感染的治疗作用：

经24-48h培养RD细胞基本长满单层时，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。用细胞培养液稀释病毒，每孔加入100ul的病毒稀释液，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒，加培养液)，室温(20-25℃)孵育1.5h，弃去病毒上清，用PBS洗三次，将灵芝酸Y用细胞培养液逐步稀释成实验所需的五个浓度，把不同浓度的药物加入弃去上清液的细胞培养孔中(并用利巴韦林做了阳性对照)，每孔100μl，每个浓度重复3孔，置细胞培养箱中培养36-48h，用MTT法检测细胞存活率。通过OD值计算出抑制指数：病毒抑制率(％)＝(药物处理组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)x100％。实验结果见图1。

试验数据通过上述公式计算得，灵芝酸Y在对病毒感染的细胞治疗试验中IC50＝0.028ug/ml而阳性对照(利巴韦林)的IC50＝6.49ug/ml；并且在不同浓度的条件下普遍优于利巴韦林的治疗效果，在实验组中，病毒抑制率最高则是浓度为20ug/ml的条件下达到76.57％。结果表明，灵芝酸Y对肠道病毒71型(EV71)感染后的细胞具有较好的治疗作用，其作用效果比阳性对照药利巴韦林更为明显。

5、灵芝酸Y抑制病毒感染所导致的炎症反应：

为了检测药物在抗病毒过程中所引起的对炎症反应的影响，提取实验细胞的mRNA，通过实时荧光定量PCR试验检测EV71较为相关的炎症因子的mRNA的量。选取与之前结果向对应的最佳浓度1ug/ml的实验组细胞，分别检测了EV71感染条件下上调较为明显的三个炎症因子TNF-α、IL-6、COX-2mRNA水平上表达量的变化。实验结果见表3。

实验结果表明，在病毒感染情况下，灵芝酸Y在不同浓度的条件下对三种炎症因子的表达都有不同程度的抑制作用，并且在药物浓度相对较高时效果较为明显。药物作用被病毒感染的细胞后，增强了细胞的存活率，对炎症反应也有很好的缓解作用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、灵芝酸Y在较大浓度范围内没有细胞毒性。

2、灵芝酸Y能够提高细胞对病毒感染的预防作用。

3、灵芝酸Y能够提高受病毒感染细胞的成活率，对病毒感染有治疗作用。

4、灵芝酸Y能够抑制病毒感染所导致的炎症反应。

相对于目前的其他抗EV71病毒药物而言，本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：1、该药物是一种纯天然药物，具有毒副作用小等优点。2、既有治疗作用，也有预防作用。3、可口服给药，使用方便。4、为非核苷类化合物，兼有抗炎作用，故能提高治疗过程中的耐受性，提高治疗质量和给药依从性，减轻治疗痛苦。

附图说明

图1为一种药物细胞治疗试验示意图。

不同浓度药物加入到病毒感染细胞之后培养48h时，采用MTT测定细胞存活率情况。并用公式计算不同浓度药物的病毒抑制率。利巴韦林为阳性对照组。

图2为一种用荧光定量PCR检测灵芝酸Y对病毒感染细胞的炎症反应中TNF-α的mRNA水平上表达量的影响示意图。

图3为一种用荧光定量PCR检测灵芝酸Y对病毒感染细胞的炎症反应中IL-6的mRNA水平上表达量的影响。

图4为一种用荧光定量PCR检测灵芝酸Y对病毒感染细胞的炎症反应中COX-2的mRNA水平上表达示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

药物毒性检测试验(MTT法)

经24-48h培养RD细胞基本长满单层时，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。将药物用细胞培养液逐倍稀释。稀释后再把不同浓度的药物加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μl，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加药，只加培养液)，再每孔补加100μl细胞培养液，置37℃，5％CO2培养箱内，培养48小时后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH＝7.4)20ul.继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm(570nm)波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据公式计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。实验结果见表一。

细胞存活率(％)＝实验孔的OD值/对照孔的OD值×100％

结果显示药物在10μg/ml——5000μg/ml的范围对该细胞没有明显细胞毒性，在显微镜下观察细胞也没有病变发生，因此说明药物有比较安全的适用范围。

实施例2：

EV71对细胞半数感染量(TCID50)的测定

将培养成单层的RD细胞传至96孔细胞培养板上，置于细胞培养箱中培养18-24h。将病毒液用维持液10倍连续稀释(10-1...10-8)。将培养成单层的RD各孔的培养液弃去，每孔PBS洗涤3次，各孔加入不同浓度的病毒液100μl，37℃吸附1.5h，吸弃病毒稀释液，各孔再补加100μl维持液，每个浓度10个重复，设正常细胞对照孔。逐日观察各孔细胞病变(CPE)，连续观察3天，记录CPE情况。然后通过以下公式计算出病毒的滴度。

PD/[log(dilution bov 50％)-log(dilution below 50％)]＝[(％next bove50％)-50％]/[(％next above 50％)-(％next below 50％)]

本次试验用的病毒浓度为3.28*10^7PFU/ml

实施例3：

灵芝酸Y对EV71抗病毒作用的实验：

1)灵芝酸Y对EV71病毒感染的预防作用：

经24-48h培养RD细胞基本长满单层时，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。将药物用细胞培养液逐倍稀释。稀释后再把不同浓度的药物加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μl，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒，加培养液)。药物孵育1H后，弃去上清，用PBS洗三次，加入用培养液稀释的病毒，每孔100μl，孵育1.5小时，弃去病毒液，用PBS洗三次，换新鲜细胞培养液，置于5％CO2孵箱中培养36-48h，用MTT法检测细胞存活率。通过OD值计算出抑制指数：病毒抑制率(％)＝(药物处理组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)x100％。实验结果表明：细胞在被灵芝酸Y提前孵育后，在被病毒感染，成活率也是明显高于病毒对照组，并且随着浓度的增高，对EV71的感染的预防作用越为明显。

2)灵芝酸Y对EV71病毒感染活性的抑制作用：

经24-48h培养RD细胞基本长满单层时，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。将药物用细胞培养液逐倍稀释。稀释后再把不同浓度的药物与病毒混合，室温孵育1h，然后加入到弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μl，每个药物浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒，加培养液)。孵育1.5小时后，弃去药物病毒混合液，用PBS洗三次，换新鲜细胞培养液，置于5％CO2孵箱中培养36-48h，用MTT法检测细胞存活率。通过OD值计算出抑制指数：病毒抑制率(％)＝(药物处理组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)x100％。实验结果表明：EV71病毒预先与灵芝酸Y孵育后，感染细胞的活性明显减弱，并且根据灵芝酸Y在四种浓度下的病毒抑制率来看，说明灵芝酸Y在较低浓度时也对EV71病毒感染的活性有明显的抑制作用。

3)灵芝酸Y对EV71病毒感染的治疗作用：

经24-48h培养RD细胞基本长满单层时，倾弃培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。用细胞培养液稀释病毒，以1moi的量，每孔加入100ul的病毒稀释液，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒，加培养液)，孵育1.5h，弃去病毒上清，用PBS洗三次，将药物用细胞培养液逐倍稀释，稀释后再把不同浓度的药物加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μl，每个浓度重复3孔，置于5％CO2孵箱中培养36-48h，用MTT法检测细胞存活率。通过OD值计算出抑制指数：病毒抑制率(％)＝(药物处理组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)x100％。实验结果表明：灵芝酸Y对肠道病毒71型(EV71)感染后的细胞具有较好的治疗作用，其作用效果比阳性对照药利巴韦林更为明显。

实施例4：

灵芝酸Y对EV71病毒感染所引起的炎症反应的影响作用：

为了检测药物在抗病毒过程中所引起的对炎症反应的影响，通过实时荧光定量PCR试验检测EV71较为相关的炎症因子的mRNA的量。炎症因子检测引物的设计如下：

TNF-αcheck-s	AGGGAAGAGTTCCCCAGG
		TNF-αcheck-as	GGGAGTAGATGAGGTACAGGC
IL-6  check-s	AGTAGTGAGGAACAAGCCAGAG
		IL-6  check-as	ATGCTACATTTGCCGAAGAG
COX-2 check-s	TTCCTCCTGTGCCTGATG
		COX-2 check-as	CTGATGCGTGAAGTGCTG

提取实验组的细胞的总mRNA，用RealTime PCR检测病毒RNA的表达量，反应条件：1、95℃5分钟，为第一个步1个循环；2、95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟为第二步40个循环；3、72℃10分钟。

Real-Time PCR的结果表明：灵芝酸Y不但有保护细胞抗病毒的疗效还有抑制炎症的作用。

Claims (1)

1.一种灵芝酸Y在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用。

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