CN104095842A

CN104095842A - Egcg棕榈酸酯在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用

Info

Publication number: CN104095842A
Application number: CN201410359356.4A
Authority: CN
Inventors: 吴建国; 徐德; 邬开朗; 孙师; 刘映乐; 潭秋萍; 刘芳
Original assignee: WUHAN SHENGDAKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUHAN SHENGDAKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-07-25
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2014-10-15

Abstract

本发明涉及医药新用途技术领域，具体公开了一种EGCG棕榈酸酯在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用。本发明证实了EGCG棕榈酸酯在体外对肠道病毒71型感染细胞试验中具有良好的抗病毒作用，能够预防肠道病毒71型的感染，其作用效果比阳性对照药普可那利更为明显，揭示该药物有开发成抗肠道病毒71型药物的前景。

Description

EGCG棕榈酸酯在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药新用途技术领域，更具体涉及一种EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)棕榈酸酯在制备治疗或预防肠道病毒71型(EV71)感染药物中的应用。

背景技术

肠道病毒7l型(human enterovirus 71，EV71)是小RNA病毒科肠道病毒属成员，1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来。通常EV71感染会引起手足口病，病情较轻且多呈自限性，与柯萨奇A16引起的手足口病难以区别。除此之外，EV71还能引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹、急性心肺功能紊乱等多种严重的神经系统疾病，甚至死亡。近年来，EV7l在世界范围内多次引起疾病暴发或流行，如1997年马来西亚Sarawak地区、1998年中同台湾地区及2008年中国安徽等地均出现较大规模的EV71暴发流行，并引起死亡。在肠道病毒家族中，EV71和脊髓灰质炎病毒这两类能引起严重神经症状的嗜神经性病毒，随着脊髓灰质炎病毒在全球临近消灭，EV71有可能成为引起严重疾病暴发的病原，有关EV71的研究越来越受到人们的重视。

EV71病毒基因组为7408个核苷酸的单股正链RNA，基因组中仅有一个开放阅读框，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P33个前体蛋白，P1前体蛋白编码VP1、VP2、VP3、VP44个病毒外壳蛋白；P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白(2A～2C和3A～3D)。病毒粒子的衣壳由60个亚单位构成，后者由4种衣壳蛋白(VP1～VP4)拼装成五聚体样结构。4种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上。EV71感染可在同一家庭多成员中传播，成人症状一般较轻，而患儿发病中，并发症和死亡率较高。

EV71感染多发生于5岁以下婴幼儿，但其易感因素、传播途径、发病机制及流行趋势等均未明确。目前仍没有安全有效的疫苗来预防EV71的感染。EV71感染患者的治疗主要以对症治疗为主，目前缺乏特异、高效的抗病毒药物。现阶段报道较多并且疗效相对明显的则是用干扰素或是静脉注射丙种球蛋白IV IG。

EGCG是茶多酚中最有效的活性成分，属于儿茶素。EGCG具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用，由于其是低毒性和存在于绿茶中的天然化合物，使它成为一种具有极大吸引力的开发对象。EGCG是从中国绿茶中提取的一种成份，它是绿茶主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛重的9％-13％，因为具有特殊的立体化学结构，EGCG具有非常强的抗氧化活性，抗氧化活性至少是维生素C的100多倍，是维生素E的25倍，能够保护细胞和DNA不受损害，这种损害相信与癌症、心脏疾病和其他重大疾病有关，EGCG的这些功效归结于它们对氧自由基的清除(抗氧化)能力。

EGCG在抗癌和心血管疾病方面担当了重要角色。此外，它也用作肿瘤多药耐药性的逆转剂，能够改善癌细胞对化疗的敏感性并减轻对心脏的毒性。

此前人们已知道EGCG具有抑制病毒的作用，但直接饮用绿茶，EGCG会立刻在体内分解，无法发挥作用。EGCG在水中不稳定，而且容易氧化导致损失。为此，我们用的是经过修饰的脂溶性的EGCG棕榈酸酯。不但将水溶性的EGCG改性成为脂溶性，同时提高了化合物的稳定性。由于稳定性的提高，降低了因分解和氧化导致的损失，EGCG棕榈酸酯大大提高了杀灭病毒的活性。虽然EGCG及其衍生物对于流感病毒的抑制作用被研究和提及过，然而对现在较为流行且致病力较强的肠道病毒71型(EV71)的预防与治疗作用却尚未提及和应用。故本发明技术方案是对其新药用价值的发现，为肠道病毒71型(EV71)的预防和治疗提供了一种新的有效药物。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是在于提供了一种EGCG棕榈酸酯在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用，该药物是一种纯天然化合物的酯修饰物，无毒无副作用，有明显的预防作用，可口服或皮肤、黏膜给药，使用方便。申请人从细胞和分子层面对EGCG棕榈酸酯抗EV71病毒作用进行了评价，为其进一步开发应用奠定了良好的基础。表明该药物具有开发成抗EV71病毒的有效药物而应用于临床的前景。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

通过CCK-8细胞活性检测与Real-Time荧光定量PCR试验，对前期筛选的有效药物的给药剂量及有效性做出分析。药物浓度是以EGCG棕榈酸酯来计算质量体积比。同时采用体外细胞模型—RD细胞，从直接杀病毒、抑制病毒的吸附与入侵、抑制病毒的复制、影响病毒出膜等方面研究药物的抗病毒机制。

研究结果表明EGCG棕榈酸酯在细胞水平上对EV71病毒具有良好的预防病毒感染和抗病毒作用，表明该药物可以作为临床上潜在的抗EV71病毒药物进一步开发。从而为临床上肠道病毒71型(EV71)疾病的治疗提供一种安全有效、毒副作用小的药物，为其进一步开发应用奠定了良好的基础。

相对于目前其他抗EV71病毒药物而言，本发明具有以下优点和效果：

1、EGCG棕榈酸酯是一种纯天然化合物的酯修饰物，具有毒副作用小等优点；

2、EGCG棕榈酸酯中的EGCG是茶叶的主要组成成份，产量大、取材方便；

3、可口服、经皮肤或黏膜给药，使用方便；

4、EGCG棕榈酸酯是一种非抗生素药物，不会产生耐药性；

5、EGCG棕榈酸酯在较大浓度范围内没有细胞毒性；

6、EGCG棕榈酸酯能够提高细胞对病毒感染的预防作用。

附图说明

图1为实施例1EGCG棕榈酸酯以及对照药物对宿主RD细胞的细胞毒性测定。

呈梯度浓度药物加入到细胞之后培养48h时，采用CCK-8细胞毒性试剂盒测定细胞存活率情况。由实验结果可知，在一定浓度范围内的EGCG棕榈酸酯对RD细胞的毒性微弱，没有造成细胞大量死亡。

图2为实施例3先加药物后加病毒的实验步骤下，用荧光定量PCR检测EGCG棕榈酸酯对EV-71病毒复制的抑制效果在mRNA水平上表达量的影响。由实验结果可知，当先加入药物后感染病毒的情况下，在一定浓度范围内的EGCG棕榈酸酯对该病毒有很强的抑制作用。

图3为实施例4药物与病毒同时添加的试验步骤下，用荧光定量PCR检测EGCG棕榈酸酯对EV-71病毒复制的抑制效果在mRNA水平上表达量的影响。由实验结果可知，当病毒和药物同时作用于宿主细胞时，在一定浓度范围内的EGCG棕榈酸酯对该病毒的抑制作用不明显。

图4为实施例5先添加病毒后添加药物的实验步骤下，用荧光定量PCR检测EGCG棕榈酸酯对EV-71病毒复制的抑制效果在mRNA水平上表达量的影响。由实验结果可知，当先感染病毒后给药的情况下，在一定浓度范围内的EGCG棕榈酸酯对该病毒的抑制作用不明显。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明请求保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中：

所用的药物EGCG棕榈酸酯为一种结构式如下的单取代的EGCG棕榈酸酯：

上述结构式的单取代的EGCG棕榈酸酯的制备及纯化方法可参考如下文献：

Ping Chen.etal,Purification of long-chain fatty acid ester of epigallocatechin-3-O-gallate by high-speed counter-current chromatography,Journal of Chromatography A,982(2002)163–165.

所用的EV71病毒来自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏编号：GDV083。

细胞培养液为DMEM高糖液体培养基(货号：SH30022.01B，HyClone)加入10％(加入后占总体积的10％)的胎牛血清(FBS，货号：10099-141，gibco)。

细胞维持液为DMEM高糖液体培养基(货号：SH30022.01B，HyClone)加入2％(加入后占总体积的2％)的胎牛血清(FBS，货号：10099-141，gibco)。

CCK-8试剂盒(上海领潮生物科技有限公司)，其中的检测液为CCK-8检测液。

胰酶(货号：SH30042.01，HyClone)。

荧光定量PCR试剂为Bestar qPCR MasterMix(SYBR Green)，(货号：DBI-2043，DBI Bioscience)。

Pleconaril(普可那利)新型广谱抗小RNA病毒药物(货号与规格：SML0307-10mg，Sigma)。

EGCG棕榈酸酯储存液浓度为100mg/ml，溶剂为DMSO。

实施例1 EGCG棕榈酸酯对宿主细胞的毒性测定

经24-48h培养的RD细胞基本长满单层时，倒弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl(1*10⁵cell/ml，下同)。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。弃去培养液，将EGCG棕榈酸酯储存液用细胞培养液逐倍稀释，配置成五个浓度梯度，把不同浓度的药物加入细胞培养孔中，每孔100μl，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加药，只加细胞培养液)，再每孔补加100μl细胞培养液，置37℃，细胞培养箱内。Pleconaril(正对照药物)和DMSO与EGCG棕榈酸酯的毒性测试方法一样。培养48小时后，每孔加CCK-8检测液10μl。继续孵育4h，终止培养。选择450nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，并根据公式:细胞存活率(％)＝实验孔的OD值/对照孔的OD值×100％计算细胞存活率，找出药物对细胞的最大无毒浓度范围。实验结果见表1

表1EGCG棕榈酸酯对RD细胞毒性试验结果

药物浓度(μg/ml)	细胞存活率(％)
		10	93.1
8	92.9
		6	89.8
4	94.2
		2	95.1
Pleconaril(0.18μM)	91.6
		DMSO(10μl/ml)	66.7
细胞对照组(空白对照)	100

实验结果表明：EGCG棕榈酸酯在2μg/ml——10μg/ml的范围对RD细胞没有明显细胞毒性，并且对细胞的生长还有一定的促进作用，表明该药物的安全性较好。

实施例2 EV71对细胞半数感染量(TCID50)的测定

将培养成单层的RD细胞传至96孔细胞培养板上，置于细胞培养箱中培养18-24h。将病毒原液用细胞维持液10倍连续稀释(10^-1-10^-8)。将培养成单层的RD各孔的细胞培养液弃去，每孔PBS洗涤3次，各孔加入不同浓度的病毒稀释液100μl，37℃吸附1.5h，弃去病毒稀释液，各孔再补加100μl细胞维持液，每个浓度10个重复，设正常细胞对照孔(不加病毒)。逐日观察各孔细胞病变影响(CPE)，连续观察3天，记录CPE情况。然后通过Reed-Muench两氏法计算出病毒的滴度。以下为计算公式：

距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)

lgTCID₅₀＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数

计算得出本次试验用的病毒的TCID₅₀值为10^-3.8/0.1ml，含义为：将该病毒稀释10^3.8倍接种100μl可使50％的细胞发生病变。因此，以下抗病毒实验中，将该病毒原液稀释10^3.8倍接种100ul。

实施例3 EGCG棕榈酸酯对EV71病毒的预防作用

经24-48h培养的RD细胞基本长满单层时，倒弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。弃去细胞培养液，将EGCG棕榈酸酯储存液用细胞培养液逐倍稀释成实验所需的三个浓度梯度，稀释后再把不同浓度的药物加入细胞培养孔中，每孔100μl，每个浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加细胞培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒，加培养液)，并用Pleconaril做阳性对照药物。药物孵育1h后，弃去上清，用PBS缓冲液(pH7.4)洗三次，加入用培养液稀释的病毒，每孔100μl，37℃,5％CO₂培养箱中孵育1.5小时，弃去病毒液，用PBS(pH7.4)洗三次，加入新的细胞培养液，置于细胞培养箱中培养36-48h，用荧光定量PCR法通过检测病毒的特定保守基因VP1确定病毒的相对复制量。通过基因表达量计算出抑制指数：病毒抑制率(％)＝(药物处理组基因表达量－病毒对照组基因表达量)/(细胞对照组基因表达量－病毒对照组基因表达量)×100％。实验结果见表2：

表2先加药物后加病毒，EGCG棕榈酸酯对EV71病毒感染的抑制作用

药物浓度(μg/ml)	病毒抑制率(％)
		细胞对照组(空白对照)	100
病毒对照组	0
		10	95
5	86.7
		2	84
DMSO(10μl/ml)	3.3
		Pleconaril(0.18μM)	30

实验结果表明，细胞在被EGCG棕榈酸酯提前孵育后，再被病毒感染，成活率也是明显高于病毒对照组，并且随着药物浓度的增高，对EV71的感染的预防作用越为明显。根据实验数据显示EGCG棕榈酸酯在较低浓度时对细胞也有较好的预防病毒感染作用。

实施例4 EGCG棕榈酸酯对EV71病毒感染活性的抑制作用

经24-48h培养RD细胞基本长满单层时，倾弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。弃去细胞培养液，将药物EGCG棕榈酸酯储存液用细胞培养液逐倍稀释成实验所需的三个浓度梯度，稀释后再把不同浓度的药物与病毒混合，室温(20-25℃)孵育1h，然后加入到细胞培养孔中，每孔100μl，每个药物浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔(不加病毒不加药，只加细胞培养液)和病毒对照孔(不加药，加病毒，加细胞培养液)，并用Pleconaril做阳性对照药物。孵育1.5小时后，弃去药物病毒混合液，用PBS(pH7.4)洗三次，换新鲜细胞培养液，置于细胞培养箱中培养36-48h，用荧光定量PCR法通过检测病毒的特定基因VP1确定病毒的相对复制量。通过基因表达量计算出抑制指数：病毒抑制率(％)＝(药物处理组基因表达量－病毒对照组基因表达量)/(细胞对照组基因表达量－病毒对照组基因表达量）×100％。实验结果见表3

表3药物与病毒同时添加，EGCG棕榈酸酯对EV71病毒入侵活性的抑制作用

药物浓度（μg/ml）	病毒抑制率（%）
		细胞对照组（空白对照）	100
病毒对照组	0
		10	50
5	53.3
		2	46.7
DMSO(10μl/ml)	10
		Pleconaril（0.18μM）	76.7

实验结果表明：EV71病毒预先与EGCG棕榈酸酯孵育后，感染细胞的活性没有明显减弱，该数据显示EGCG棕榈酸酯对EV71病毒感染细胞的活性有一定的抑制作用，药物浓度梯度对抑制作用效果不明显。

实施例5 EGCG棕榈酸酯对EV71病毒感染的治疗作用

经24-48h培养的RD细胞基本长满单层时，倾弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至96孔无菌细胞培养板中，每孔100μl。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。用细胞培养液稀释病毒，每孔加入100ul的病毒稀释液，同时设立细胞对照孔（不加病毒不加药，只加细胞培养液）和病毒对照孔（不加药，加病毒，加细胞培养液），室温（20-25℃）孵育1.5h，弃去病毒上清，用PBS（pH7.4）洗三次，将EGCG棕榈酸酯储存液用细胞培养液逐步稀释成实验所需的三个浓度，把不同浓度的药物加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔100μl，每个药物浓度重复3孔，同时设立细胞对照孔（不加病毒不加药，只加细胞培养液）和病毒对照孔（不加药，加病毒，加细胞培养液），并用Pleconaril做阳性对照药物。置细胞培养箱中培养36-48h，用荧光定量PCR法通过检测病毒的特定基因VP1确定病毒的相对复制量。通过基因表达量计算出抑制指数：病毒抑制率(％)＝(药物处理组基因表达量－病毒对照组基因表达量)/(细胞对照组基因表达量－病毒对照组基因表达量)×100％。实验结果见表4。

表4先添加病毒后添加药物，EGCG棕榈酸酯对EV71病毒入侵活性的抑制作用

药物浓度(μg/ml)	病毒抑制率(％)
		细胞对照组(空白对照)	100
病毒对照组	0
		10	56.7
5	40
		2	13.3
DMSO(10μl/ml)	0
		Pleconaril(0.18μM)	90

试验数据通过上述公式计算得，EGCG棕榈酸酯在对病毒感染的细胞治疗试验中，浓度梯度变化，随着EGCG棕榈酸酯浓度的身高，对肠道病毒71型(EV71)感染后的细胞的病毒复制有一定的抑制作用，阳性对照药物Pleconaril抑制病毒复制效果明显。

Claims

1.EGCG棕榈酸酯在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用。

2.EGCG棕榈酸酯在制备预防肠道病毒71型感染药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的EGCG棕榈酸酯为结构式如下的单取代EGCG棕榈酸酯：