CN111329859B - 叶绿素铜钠盐在制备用于抗肠道病毒的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了叶绿素铜钠盐在制备用于抗肠道病毒的药物中的应用。叶绿素铜钠盐具有广谱的抗EV‑A71、CV‑A16、CV‑B3和CV‑B5感染的作用。目前的叶绿素铜钠盐药物具有不同剂型,这些剂型都有望成为有效抗EV‑A71、CV‑A16、CV‑B3和CV‑B5感染的有效药物,以期治疗手足口病等肠道病毒引起的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,尤其涉及叶绿素铜钠盐在制备用于抗肠道病毒的药物中的应用。
背景技术
小核糖核酸科(Picornaviridae)肠道病毒属包括100多种肠道病毒(Enterovirus,EV),可分为(A、B、C和D)四个亚型,其中有很多病毒可以感染人类。这些病毒每年可感染约30亿的人,引起的疾病包括轻微的感冒、呼吸道疾病、严重的手足口病、心肌炎、胰腺炎、脑膜脑炎以及脊髓灰质炎。近些年来,手足口病呈现全球爆发,尤其以亚太地区最为严重。
我国是一个手足口病的大国。在我国法定传染病中,手足口病已经连续多年位居发病数的首位。手足口病可由20多种肠道病毒引起,但主要病原是肠道病的A型中的肠道病毒71型(EV-A71)和柯萨奇病毒16型(Coxsackievirus 16,CV-A16)。手足口病主要感染婴幼儿以及免疫力低下的人,患者可表现手、足、臀等部位出现皮疹,口腔两侧出现疱疹。严重者可导致神经症状引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎、急性弛缓性麻痹。也可以引起呼吸系统症状导致神经源性水肿、出血等并导致死亡。而在手足口病的重症和死亡病例中,由EV-A71所导致的感染占据了绝大多数。
目前针对手足口病的预防和治疗,只有我国最近刚刚批准上市的两种预防EV-A71感染的疫苗。除此之外,国内外仍没有批准的可用于手足口病的药物。虽然一些小分子药物已经在开展了相关的临床实验,但这些药物都因毒性较大等问题而被终止。由于手足口病患者主要是儿童,药物的研发对安全性要求极高。因此,鉴于我国手足口病的流行形势,急需研发安全性高并可有些治疗手足口病的药物。
此外,柯萨奇病毒B3型(CV-B3)和柯萨奇病毒B5型(CV-B5)可以引起病毒性心肌炎和病毒性胰腺炎等,目前也没有相关的获批的抗CV-B3和CV-B5的药物。
叶绿素铜钠盐是一种食品添加剂和食用染料。其经常被加在例如蛋糕、冰淇淋、饮料以及糖果上。此外,叶绿素铜钠盐也是一种FDA批准上市的并在临床上应用了几十年的药物。其具有抗癌作用、抗氧化作用以及促进伤口愈合等作用。在生活中,叶绿素铜钠盐也被用作除臭剂加在空气清新剂中,或者加在牙膏中等。目前为止,没有任何有关叶绿素铜钠盐在人体中的副作用的报道。鉴于叶绿素铜钠盐具有安全性极高、成本低等诸多优点,可进一步探究其在抗病毒研究中的作用。
叶绿素铜钠盐其分子式为C34H31CuN4Na3O6,分子量为724.15,化学结构式如下:
因此,本领域的技术人员致力于开发一种抗肠道病毒药物,以期实现对手足口病、病毒性心肌炎和胰腺炎的预防和治疗。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明所要解决的技术问题是如何发现一种抗肠道病毒药物,以期实现对手足口病、病毒性心肌炎和胰腺炎的预防和治疗。
为实现上述目的,本发明提供了叶绿素铜钠盐在制备用于抗肠道病毒的药物中的应用。
优选的,所述叶绿素铜钠盐为化学结构如式I所示的化合物或其衍生物,
优选的,肠道病毒包括肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型柯萨奇病毒B3和B5型。
本发明还提供叶绿素铜钠盐在制备用于治疗由肠道病毒引起的疾病的药物中的应用。
优选的,叶绿素铜钠盐用于治疗由肠道病毒引起的手足口病、心肌炎和胰腺炎。
优选的,叶绿素铜钠盐制备得到的药物包括在药学上可接受的辅料,药物剂型包括乳膏、胶囊注射液、口服液。
技术效果
叶绿素铜钠盐具有广谱的抗EV-A71、CV-A16、CV-B3和CV-B5感染的作用。目前的叶绿素铜钠盐药物具有不同剂型,这些剂型都有望成为有效抗EV-A71、CV-A16、CV-B3和CV-B5感染的有效药物。例如外用的叶绿素铜钠盐乳膏被用于促进伤口愈合。因此叶绿素铜钠盐的乳膏可以涂抹于手足口病病人的皮肤水泡上,一方面具有抗病毒感染的作用,另一方面可以促进水泡愈合。此外,多种内服的叶绿素铜钠盐也有望成为治疗手足口病以及心肌炎和胰腺炎的有效药物。叶绿素铜钠盐可以有效抵抗多种肠道病毒的感染,使肠道病毒被阻断在入侵阶段。并且在体内具有抑制活性。同时其具有极高的安全性并可以做出多种剂型,操作简单,可以有效成为抗肠道病毒的候选药物。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1为不同浓度的叶绿素铜钠盐A(Chlorophyllin A)和叶绿素铜钠盐B(Chlorophyllin B)对EV-A71-GFP的抑制活性;
图2为不同浓度的叶绿素铜钠盐A(Chlorophyllin A)对EV-A71(MP4)的抑制活性;
图3为不同浓度的叶绿素铜钠盐A(Chlorophyllin A)对EV-A71(FJ08089)的抑制活性;
图4为不同浓度的叶绿素铜钠盐A(Chlorophyllin A)对EV-A71(VR-1432)的抑制活性;
图5为利用q-PCR实验检测叶绿素铜钠盐(Chlorophyllin A)在RD细胞中抑制EV-A71(FJ08089)、EV-A71(VR-1432)和EV-A71(MP4)的活性;
图6为为利用q-PCR实验检测叶绿素铜钠盐(Chlorophyllin A)在Vero细胞中抑制EV-A71(FJ08089)、EV-A71(VR-1432)和EV-A71(MP4)的活性;
图7不同浓度的叶绿素铜钠盐A(Chlorophyllin A)对CV-A16(CC097)的抑制活性;
图8不同浓度的叶绿素铜钠盐A(Chlorophyllin A)对CV-A16(GD09/24)的抑制活性;
图9不同浓度的叶绿素铜钠盐A(Chlorophyllin A)对CV-A16(CC045)的抑制活性;
图10为利用q-PCR实验检测叶绿素铜钠盐(Chlorophyllin A)在RD细胞中抑制CV-A16(CC097)、CV-A16(CC045)和CV-A16(GD09/24)的活性;
图11为利用q-PCR实验检测叶绿素铜钠盐(Chlorophyllin A)在Vero细胞中抑制CV-A16(CC097)、CV-A16(CC045)和CV-A16(GD09/24)的活性;
图12为叶绿素铜钠盐(Chlorophyllin A)在RD细胞上的细胞毒性检测;
图13为叶绿素铜钠盐(Chlorophyllin A)在小鼠上肌肉上抑制EV-A71活性的检测;
图14为叶绿素铜钠盐(Chlorophyllin A)在小鼠上肺脏上抑制EV-A71活性的检测。
图15为叶绿素铜钠盐(Chlorophyllin A)在RD细胞上抑制CV-B3(Woodruffvariant)的活性;
图16为绿素铜钠盐(Chlorophyllin A)在RD细胞上抑制CV-B5(319JS/CHN/2013)的活性。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1
利用带有绿色荧光蛋白标签的重组EV-A71病毒鉴定叶绿素铜钠盐及其衍生物的抗病毒活性:
(1)配置叶绿素铜钠盐及其衍生物的溶液,即叶绿素铜钠盐A和叶绿素铜钠盐B。将叶绿素铜钠盐用去离子水溶解,浓度为10M/mL。
(2)传代RD细胞,并以1000个细胞每孔将RD细胞铺于96孔板中,37℃培养24h。
(3)待细胞密度约为80%时,开始稀释叶绿素铜钠盐,用DMEM进行连续的2倍稀释,将其加入96孔板中。
(4)将终浓度为0.5MOI的带有GFP标签蛋白的EV-A71病毒加入96板中(该病毒在复制过程中会表达GFP),与稀释好的叶绿素铜钠盐混匀,37℃孵育30min。
(5)弃掉细胞上清,将病毒与药物的混合物加入到RD细胞中。同时设置无药物的病毒对照和细胞对照,37℃培养24h。
(6)24h后,置荧光倒置显微镜下观察GFP荧光信号。
结果如图1所示,叶绿素铜钠盐A和叶绿素铜钠盐B在100μM时完全看不到GFP荧光信号,50μM以及25μM可显著减少GFP信号的强度,说明叶绿素铜钠盐A和叶绿素铜钠盐B具有抑制EV-A71复制的作用。
实施例2
叶绿素铜钠盐在RD细胞中抗不同EV-A71亚型的作用效果。
(1)将RD细胞铺在96孔板中,每孔10000个细胞。
(2)24h后,将叶绿素铜钠盐进行不同浓度的稀释,然后分别加入0.5MOI的不同亚型的EV-A71,包括EV-A71(FJ08089)、EV-A71(VR-1432)以及EV-A71(MP4)。37℃孵育30min。
(3)将病毒和药物混合物一起加入到RD细胞中,继续培养。同时设置无药物的病毒对照孔和细胞对照孔。
(4)24h后,待病毒对照孔细胞病变明显时,弃掉细胞上清,加入CCK-8溶液。
(5)37℃孵育2h后,利用酶标仪测定OD450的吸光度。
(6)计算病毒抑制率,公式如下:病毒抑制率=(药物孔-病毒孔)×100%/(无药物孔-病毒孔)
结果如表1、2、3和图2、3、4所示,叶绿素铜钠盐对不同亚型的EV-A71都具有抑制效果。其在50μM时可基本完全抑制病毒的感染。
表1
表2
表3
实施例3
利用RT-qPCR检测叶绿素铜钠盐对不同EV-A71亚型的抑制效果。
(1)将RD和Vero细胞铺于96孔板中,每孔10000个。
(2)将100μM的叶绿素铜钠盐于0.5MOI的不同亚型的EV-A71分别混合后,于37℃孵育30min。
(3)将病毒和药物混合物加入RD和Vero细胞中,并做三个重复孔。设置无药物的病毒对照孔。
(4)24h后,待病毒对照孔病变明显时,收取细胞上清。
(5)利用北京全式金生物公司的病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。
(5)利用Takara公司一步法RT-qPCR试剂盒进行检测,具体操作参照说明书进行。
结果如表4、表5、图5和图6表明,以不加药物的病毒孔中的病毒RNA拷贝数为100%,叶绿素铜钠盐极显著的降低不同EV-A71亚型的病毒拷贝数。
表4
表5
实施例4
叶绿素铜钠盐在RD细胞上的抗CV-A16的作用效果:
(1)将RD细胞铺96孔板,每孔10000个细胞。
(2)待细胞密度达80%时,系列稀释叶绿素铜钠盐,并加入不同亚型的CV-A16于之混合。并在37℃孵育30min。
(3)将药物于病毒混合物一同加入到RD细胞中。每个浓度设置3个重复孔,同时设置无药物的细胞孔和无药物的病毒孔。
(4)24小时后,待病毒对照孔细胞病变明显时,弃掉细胞上清,加入CCK-8溶液。
(5)37℃孵育2h后,利用酶标仪测定OD450的吸光度。
(6)计算病毒抑制率,公式如下:病毒抑制率=(药物孔-病毒孔)×100%/(无药物孔-病毒孔)
结果如表6、7、8和图7、8和9所示,叶绿素铜钠盐同样可以有效抑制不同亚型的CV-A16。
表6
表7
表8
实施例5
利用RT-qPCR检测叶绿素铜钠盐对不同CV-A16亚型的抑制效果。
(1)将RD和Vero细胞铺于96孔板中,每孔10000个。
(2)将100μM的叶绿素铜钠盐于0.5MOI的不同亚型的EV-A71分别混合后,于37℃孵育30min。
(3)将病毒和药物混合物加入RD和Vero细胞中,并做三个重复孔。设置无药物的病毒对照孔。
(4)24h后,待病毒对照孔病变明显时,收取细胞上清。
(5)利用全是金公司的病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA.
(5)利用Takara公司一步法RT-qPCR试剂盒进行检测,具体操作参照说明书进行。
结果如表9、10和图10和11表明,以不加药物的病毒孔中的病毒RNA拷贝数为100%,叶绿素铜钠盐极显著的降低不同CV-A16亚型的病毒拷贝数。
表9
表10
实施例6
检测叶绿素铜钠盐的细胞毒性:
(1)对生长良好的RD细胞进行传代,并铺于96孔细胞培养板中,每孔1000个细胞。
(2)24h后,待细胞密度达到80%时,加入不同浓度的叶绿素铜钠盐。
(4)12h后,进行将细胞上清弃掉,加入新鲜的DMEM。
(5)12h后,加入CCK-8溶液。
(5)计算细胞存活率。
结果如表11和图12表明,在高达1M的浓度下,没有发现RD细胞特别明显的毒性。
表11
实施例7
叶绿素铜钠盐在小鼠体内抗EV-A71的活性检测:
(1)将新出生的ICR小鼠随机分成两组,第一组为攻毒对照组,第二组为叶绿素铜钠盐给药组。
(2)第一组对乳鼠进行腹腔注射攻毒EV-A71,攻毒剂量为107PFU。第二组将100mg/kg的叶绿素铜钠盐与EV-A71混合后通过腹腔注射到乳鼠中。
(3)在攻毒后,第二组每24h通过腹腔注射100mg/kg的叶绿素铜钠盐,第一组注射等量的PBS。
(4)在攻毒的第4天,安乐死小鼠。取小鼠肺脏和腿部肌肉。加入Trizol匀浆。
(5)提取肺脏和肌肉中的RNA,利用RT-qPCR进行病毒RNA拷贝数的检测。
结果如表12和表13以及图13和14所示,以病毒对照组的病毒拷贝数为100%,叶绿素铜钠盐可以显著的降低EV-A71在小鼠体内的病毒数。
表12
表13
实施例8
叶绿素铜钠盐在RD细胞中抗CV-B3感染的检测:
(1)将RD细胞铺在96孔板中,每孔10000个细胞。
(2)24h后,将叶绿素铜钠盐进行不同浓度的稀释,然后分别加入0.5MOI的CV-B3,37℃孵育30min。
(3)将病毒和药物混合物一起加入到RD细胞中,继续培养。同时设置无药物的病毒对照孔和细胞对照孔。
(4)24h后,待病毒对照孔细胞病变明显时,弃掉细胞上清,加入CCK-8溶液。
(5)37℃孵育2h后,利用酶标仪测定OD450的吸光度。
(6)计算病毒抑制率,公式如下:病毒抑制率=(药物孔-病毒孔)×100%/(无药物孔-病毒孔)
结果如表14和图15所示,叶绿素铜钠盐对CV-B3具有抑制效果。其在50μM时可基本完全抑制病毒的感染。
表14
实施例9
叶绿素铜钠盐在RD细胞中抗CV-B5感染的检测:
(1)将RD细胞铺在96孔板中,每孔10000个细胞。
(2)24h后,将叶绿素铜钠盐进行不同浓度的稀释,然后分别加入0.5MOI的CV-B5,37℃孵育30min。
(3)将病毒和药物混合物一起加入到RD细胞中,继续培养。同时设置无药物的病毒对照孔和细胞对照孔。
(4)24h后,待病毒对照孔细胞病变明显时,弃掉细胞上清,加入CCK-8溶液。
(5)37℃孵育2h后,利用酶标仪测定OD450的吸光度。
(6)计算病毒抑制率,公式如下:病毒抑制率=(药物孔-病毒孔)×100%/(无药物孔-病毒孔)
结果如表15和图16所示,叶绿素铜钠盐对CV-B5具有抑制效果。其在50μM时可基本完全抑制病毒的感染。
表15
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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