CN103127094A

CN103127094A - 牛蒡子苷元在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的用途

Info

Publication number: CN103127094A
Application number: CN2012105440314A
Authority: CN
Inventors: 赵志全; 徐真真; 刘奋
Original assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Current assignee: Lunan Pharmaceutical Group Corp
Priority date: 2011-12-02
Filing date: 2012-12-01
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及牛蒡子苷元在制备治疗乙肝药物中的用途。本发明提供牛蒡子苷元在治疗乙肝时的疗效确切、毒性低、用量小，并且不会产生耐药性，能够抑制停药后的反跳，具有很好的临床应用前景。

Description

牛蒡子苷元在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的用途

技术领域

本发明涉及牛蒡子苷元的一种新的医药用途，特别涉及牛蒡子苷元在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的用途，属于医药领域。

背景技术

乙型病毒性肝炎是由乙型病毒性肝炎病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种病。本病广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种病。乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发病，但多属散发。近年来乙型病毒性肝炎发病率呈明显增高趋势。

慢性乙型病毒性肝炎治疗的目的是在肝脏发生明显损伤之前抑制HBV的复制。治疗的初期目标是抑制病毒复制，阻止肝脏损伤；治疗的远期目标是清除病毒，阻止疾病向肝硬化以及肝癌的发展，延长生存期。抗病毒治疗还用于防止肝移植后、化疗或免疫抑制治疗时乙型病毒性肝炎病毒的再复制。因为目前所有的抗病毒药物不能有效的清除HBV DNA，所以实现长期清除HBV的目标几乎不可能实现。慢性乙型病毒性肝炎的治疗有两种方式：免疫调节和抑制病毒。肝移植可用于对药物治疗无效的终末期肝病患者。

目前市场上治疗乙型病毒性肝炎的方法主要有注射干扰素类药物、服用阿德福韦酯，恩替卡韦等核苷类似物类药物以及注射乙型病毒性肝炎疫苗三种方式。但上述三种方式均存在比较大的缺点，长期服用干扰素会造成患者出现流感感样症状、并可能使患者出现消化道症状、脱发等不良反应。严重者还能抑制骨髓导致白细胞、血小板减少，这样就会导致患者的凝血功能下降。而服用阿德福韦酯，恩替卡韦等核苷类似物类则会导致乳酸性酸中毒和重度的脂肪性肝肿大，且很多患者服用半年左右就会耐药，而且还不能随时停药，否则可能会导致病情迅速恶化，甚至转化为肝硬化、肝癌。虽然乙型病毒性肝炎疫苗能够抑制HBV的复制，其安全性和耐受性都很好，但是还不足以打破乙型病毒性肝炎的免疫耐受状态进而清除HBV，仍需辅以抗乙型病毒性肝炎药物的治疗。

牛蒡苷与牛蒡子苷元均来源于牛蒡的干燥成熟果实牛蒡子，牛蒡苷活性很小，必须经过代谢转化为牛蒡子苷元才能被人体吸收，而牛蒡子苷元是可以被人体直接吸收的有效成分。牛蒡子苷元为白色粉末或无色块状结晶，不易挥发，空气中不易被氧化，物理及化学性质均较为稳定，在氯仿、甲醇、乙醇等有机溶剂中易溶，熔点为111-112℃。目前，已有文献报道了牛蒡子苷元的提取分离工艺，比如Zeng Y，et al.Lack of significant modifying effect ofarctiin on prostate carcinogenesis in probasin/SV40 T antigen transgenic rats[J].Cancer Lett.2005；222(2)：145-151公开了一种经蜗牛酶水解牛蒡苷制备牛蒡子苷元的方法。以及《中药化学成分分离提取手册》(P77，杨云等主编，中国中医药出版社)也报道了牛蒡子苷元制备方法，经HPLC检测纯度≥90％。中国专利CN101134031A公开了牛蒡子苷元的两种制备方法及其片剂、软胶囊、滴丸和注射液的制备方法。

另外，也有文献报道牛蒡子苷元具有抗流感病毒作用(Gao Y，et al.Activity of in vitroanti-influenza virus of arctigenin[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs(中草药).2002；33(8)：724-726.公开了牛蒡子苷元具有抗流感病毒的作用)，但并没有关于牛蒡子苷元可以抗乙型病毒性肝炎病毒方面的报道及技术启示。

发明内容

为了克服现有乙型病毒性肝炎治疗药物毒副作用大，治疗过程中易出现耐受性等不足，本发明提供一种治疗乙型病毒性肝炎的有效治疗药物。该治疗药物以牛蒡子苷元为活性成分，其用于乙型病毒性肝炎患者治疗时，疗效确切，毒副作用小，且牛蒡子苷元的安全性和耐受性均较好，具有十分广泛的医疗应用前景。

牛蒡子苷元是从牛蒡中提取获得的有效治疗成分，现已有证据证明牛蒡子苷元具有广泛的药理活性，本发明涉及牛蒡子苷元的一种新的医药用途，即牛蒡子苷元用于制备治疗乙型病毒性肝炎的药物中的应用，其中所述的牛蒡子苷元为注射剂。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明所提供的含牛蒡子苷元的注射剂，由牛蒡子苷元和助溶剂组成，其中所述的助溶剂选自吐温-80、丙二醇、甘油、乙醇和PEG-400中的一种或几种，优选地，牛蒡子苷元和助溶剂重量份为：牛蒡子苷元5-50份、助溶剂2-5份，其余为0.9％氯化钠溶液或注射用水。

本发明的药效试验结果说明牛蒡子苷元注射剂对HBsAg和HBeAg均有明显的抑制作用，对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果也尤为显著，并有抑制停药反跳的特点，因此，本发明的牛蒡子苷元的注射剂治疗乙型病毒性肝炎病毒感染鸭有效，剂量为0.1-3mg/kg，一天2次，给药10天疗效最佳，停药后对乙型病毒性肝炎病毒仍有抑制作用。

总之，本发明提供的牛蒡子苷元注射剂同现有技术相比，具有如下突出的优势：

1.有较强的抗病毒活性，并且不会产生耐药性；

2.毒性低，用量小；

3.具有抑制停药后反跳的特点。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。

实施例1牛蒡子苷元注射剂

处方：

制备工艺：

将处方量的丙二醇和乙醇混合均匀，加入牛蒡子苷元，搅拌溶解，加入处方量的0.9％氯化钠溶液，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。

实施例2牛蒡子苷元注射剂

处方：

牛蒡子苷元 10mg

PEG-400 2ml

0.9％氯化钠溶液加至10ml

制备工艺：

将处方量的PEG-400加入牛蒡子苷元，搅拌溶解，加入0.9％氯化钠溶液至10ml，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。

实施例3牛蒡子苷元注射剂

处方：

制备工艺：

将处方量的乙醇和吐温-80混合均匀，加入牛蒡子苷元，搅拌溶解，加入注射用水至10ml，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。

实施例4牛蒡子苷元注射剂

处方：

制备工艺：

实施例5牛蒡子苷元注射剂

处方：

制备工艺：

实施例6牛蒡子苷元注射剂

处方：

牛蒡子苷元 20mg

乙醇 3.3ml

注射用水加至10ml

制备工艺：

将处方量的乙醇加入牛蒡子苷元，搅拌溶解，加入注射用水至10ml，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。

实施例7牛蒡子苷元注射剂

处方：

牛蒡子苷元 10mg

乙醇 3.3ml

注射用水加至10ml

制备工艺：

实施例8牛蒡子苷元体外抗HBV药效测定

1、HepG2.2.15细胞培养

利用目前公认的研究HBV复制的细胞模型HepG2.2.15细胞为研究对象，实验采用的HepG2.2.15细胞购买于中国典型微生物保藏中心。

细胞培养液为MEN培养液，每100ml含胎牛血清10ml，质量百分比浓度为3％的谷氨酰胺溶液1ml，G418 380μg/ml，庆大霉素50U/ml；细胞消化液为含质量百分比为0.25％胰酶溶液，用Hanks液配制。

细胞培养方法：将HepG 2.2.15细胞解冻后，接种入25cm²培养瓶，浓度为1×10⁵个/ml，待细胞长满后，加0.25％胰酶37℃消化3-5分钟。加培养液吹打，1∶3传代，每天收集上清，连续2周，冷藏待检。

2、药物的细胞毒性试验

用MTT法测定药物的细胞毒性，96孔板每孔3×10⁵个细胞/ml 2.2.15细胞100μl，37℃ 5％CO₂培养箱中培养。一天后，换用含药培养液，每个浓度4孔，将实施例1制备的牛蒡子苷元用DMEM培养液稀释成(100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml)，每3天换同浓度含药培养液，37℃ 5％CO₂培养箱中继续培养8天。向每孔细胞中加入5μg/ml MTT 10μl，每孔中存留有上清100μl，37℃ 5％CO₂培养箱中培养4h后，酶标仪570/630nm波长测定OD值。空白对照及细胞对照各4孔。细胞抑制百分率＝[(细胞对照0D值-药物作用组OD值)/(细胞对照OD值一空白对照OD值)]×100％。按Reed-Muench法计算半数有毒浓度(TC50)，最大无毒浓度(TC0)。每个浓度牛蒡子苷元进行两批实验，每批进行3组平行实验，得平均TC50为96.5μg/ml，TC0为50μg/ml。表1显示牛蒡子苷元对HepG2.2.15细胞有低毒作用，它的最大无毒剂量是50μg/ml。

表1牛蒡子苷元对HepG2.2.15细胞的毒性作用

3、牛蒡子苷元抗HBV药效测定

96孔板每孔3×10⁵个细胞/ml 2.2.15细胞100μl，37℃ 5％CO₂培养箱中培养。一天后，换用含药培养液，每个浓度4孔，将实施例1制备的牛蒡子苷元用DMEM培养液稀释成(50μg/ml，25μg/ml，12.5μg/ml，6.25μg/ml)，每3天换同浓度含药培养液，第9天收集培养上清，-20℃冰冻保存。ELISA检测试剂盒测定HBsAg和HBeAg，酶标仪540/630nm波长测定OD值。空白对照及细胞对照各4孔。抑制百分率＝[(细胞对照OD值一药物作用组OD值)/(细胞对照OD值一空白对照OD值)]×100％。结果见表2。

表2牛蒡子苷元对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响

本实验结果显示牛蒡子苷元对2.2.15细胞有较低的细胞毒性(最小无毒剂量为50μg/ml)。在此剂量时对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为70.9％和38.5％，有显著性作用。HBsAg和HBeAg是乙型病毒性肝炎病人血清中主要的标记，提示牛蒡子苷元在体外有抗HBV作用。

实施例9牛蒡子苷元在鸭体内对乙型病毒性肝炎病毒感染的治疗效果

本发明采用国内外公认的实验模型，在乙型病毒性肝炎病毒感染的鸭体内进行实验。

1.DHBV感染：30只雏鸭经胫静脉注射DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.2ml。在感染后7天取血，分离血清。70℃保存待检。

2.药物治疗试验：DHBV感染1日龄北京鸭随机分组，给药组分3个剂量腹腔注射给以实施例1制备的牛蒡子苷元注射剂，分别为牛蒡子苷元低剂量组(0.1mg/kg)、牛蒡子苷元中剂量组(0.5mg/kg)、牛蒡子苷元高剂量组(3.0mg/kg)，每天2次，连续给药10d，空白对照组，以生理盐水代替药物；阳性药物阿昔洛韦组(50mg/kg)，每天2次，连续10d。给药前，给药第5d、10d和停药后3d，分别自鸭腿胫静脉取血，分离血清，于-70℃保存待检。

3.检测方法：取上述待检鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA的动态水平。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32p标记DHBV-DNA探针，作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，测定OD值(490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值。

4.药效计算：计算每组不同时间点血清DHBV-DNA水平，各组用药前后比较采用配对t检验，计算DHBV-DNA抑制率，比较各组鸭血清DHBV-DNA抑制率的动态变化。给药组与病毒对照组比较，采用成组t检验。DHBV-DNA抑制率＝(给药前OD值一给药后OD值)/给前OD值×100％。结果见表3。

表3牛蒡子苷元注射剂对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA水平的影晌

与空白对照组相比，^*p＜0.05，^**p＜0.01；与阿昔洛韦组相比，^#p＜0.05，^##p＜0.01

本实验通过鸭乙型病毒性肝炎模型证明了牛蒡子苷元注射剂具有更好的抗鸭乙型病毒性肝炎病毒活性，乙型病毒性肝炎病毒感染鸭腹腔注射给以牛蒡子苷元治疗，一天给药两次，牛蒡子苷元各治疗组对感染鸭血清DHBV-DNA水平均有显著抑制作用，其中牛蒡子苷元中剂量组(0.5mg/kg)对感染鸭血清DHBV-DNA水平的抑制效果尤为显著，并有抑制停药反跳的特点，停止给药后对乙型病毒性肝炎病毒仍有抑制作用。

将实施例2-7制备的牛蒡子苷元注射剂替代实施例8中使用的实施例1的牛蒡子苷元注射剂，重复实施例8，结果发现实施例2-7制备的牛蒡子苷元注射剂在体外仍有显著的抗HBV作用。将实施例2-7制备的牛蒡子苷元注射剂替代实施例9中使用的实施例1的牛蒡子苷元注射剂，重复实施例9，结果发现实施例2-7制备的牛蒡子苷元注射剂具有较好的抗鸭乙型病毒性肝炎病毒活性。

以上通过具体实施方式进一步描述了本发明，任何等同替换对于本领域的技术人员来说都是显而易见的且包含在本发明之中。

Claims

1.牛蒡子苷元在制备治疗乙型病毒性肝炎药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的牛蒡子苷元为注射剂。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的牛蒡子苷元注射剂含有牛蒡子苷元和助溶剂。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的助溶剂包含吐温-80、丙二醇、甘油、乙醇和PEG-400中的一种或几种。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的牛蒡子苷元和助溶剂重量份为：牛蒡子苷元5-50份、助溶剂2-5份。

6.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的牛蒡子苷元注射剂处方为：

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7.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的牛蒡子苷元注射剂处方为：

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8.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的牛蒡子苷元注射剂处方为：

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