CN103145718B - 从小球藻中提取叶绿素铜钠盐的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从小球藻中提取叶绿素铜钠盐的方法，该方法采用将小球藻菌种经活化、扩大培养，得到的小球藻液体经浸提，得到的小球藻固体，经超声波萃取破细胞壁，皂化后，用蒸馏水、石油醚、乙醇溶液连续洗涤，以除去未被皂化的叶绿素和叶黄素等其他色素杂质，浓缩，加入CuSO₄溶液铜化叶绿素，用少量水溶解后，加入NaOH-乙醇溶液,沉淀生成，控制溶液pH11～12；经抽滤，干燥，得到叶绿素铜钠盐。该方法为藻类植物的叶绿素测量、微藻中油脂的提取提供实验依据，为叶绿素盐的工业化生产提供试验数据。

Description

从小球藻中提取叶绿素铜钠盐的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种从小球藻中提取叶绿素铜钠盐的方法。

背景技术

叶绿素是脂溶性色素，存在于一切绿色植物中，目前广泛应用于医药、食品、日用化工等领域，其降解产物和衍生物在医药上具有广阔的应用前景，其中叶绿素铜钠盐最为重要，可治疗传染性肝炎、胃和十二指肠溃疡、慢性肾炎、胰腺炎、白血病等疾病。一般绿色植物中叶绿素含量较低，含量为0.2%，绿藻中的小球藻叶绿素含量是自然界中最高的生物，含量为4%～6%。但小球藻为单细胞微藻，有坚固的纤维素胞壁，常规的有机溶剂提取法并不能有效地将叶绿素提取出来。

叶绿素铜钠盐的分子式为：C34H29CuN4Na306,结构如下所示：

其主要技术指标如表1所述：

表1 叶绿素铜钠盐主要技术指标

发明内容

本发明的目的是提供一种从小球藻中提取叶绿素铜钠盐的方法，该方法为藻类植物的叶绿素测量、微藻中油脂的提取提供实验依据，为叶绿素盐的工业化生产提供试验数据。

本发明的目的是这样实现的：

从小球藻中提取叶绿素铜钠盐的方法，有以下步骤：

1）取小球藻菌种，接种于SE固体培养基上活化，用SE液体培养基在适当条件下扩大培养，培养到10⁷个/mL，得到小球藻液体；

2）取步骤1）所述的小球藻液200mL，离心，用50-65%乙醇作浸提剂，小球藻与乙醇的固液比g/mL为1：10，超声波萃取破细胞壁，65℃下，用5%的NaOH溶液调至小球藻破碎液PH为11～12，用5%NaOH皂化30-50min，溶液蒸发浓缩至原体积（加入酒精的体积）的1/4～1/5；

3）将步骤2）所得到的浓缩液10mL蒸馏水、10mL石油醚、10mL50%的乙醇溶液连续洗涤，以除去未被皂化的叶绿素和叶黄素等其他色素杂质；

4）用盐酸(1:1)调节步骤3）调节所得溶液的PH为2～3，然后加入2mL质量分数为20%的CuSO₄溶液（200mL藻液中叶绿素盐理论值的2倍，使叶绿素完全皂化）用于铜化叶绿素，60℃铜化40min.，用少量蒸馏水溶解后，加入5mL质量分数为2%NaOH-乙醇溶液；再用1mol/mL的NaOH溶液控制混合液的pH为11～12；抽滤，干燥，得到叶绿素铜钠盐。

步骤2）所述离心的时间为5min，离心的速度为3000r/min。

本发明较好的技术方案是，步骤2）所述乙醇浓度为60%；超声波时间为17min，强度为600w；皂化时间为42min。

超声提取作为近十年应用得越来越广泛的一种新提取手段，超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，在提取过程中可将细胞破碎，加强胞内物质的释放、扩散及溶解，缩短提取时间，增加提取效率。

本发明采用超声提取的方法从小球藻中提取叶绿素铜钠盐，具有以下优点：

（1）通过响应面法确定最佳制取参数，可以得到极大量的叶绿素铜盐。

（2）可以得到小球藻最适破壁方法，用于“水华”、“赤潮”中藻类植物含量的测定。

（3）本发明所述方法可以使叶绿素铜钠盐制取率达到59.5%(相对于小球藻中叶绿素的理论含量)。

结合实例对本发明做进一步说明，但本发明不仅限于这些例子。

附图说明

图1为乙醇浓度对叶绿素含量的影响；

图2为超声波时间对叶绿素含量的影响；

图3为皂化时间对叶绿素铜盐含量的影响；

图4为叶绿素铜盐的吸收光谱。

具体实施方式

一.试剂和仪器

1.菌种来源

小球藻菌种（购自中国科学院水生物研究所，SE培养基），由重庆理工大学生物工程实验室（-80℃）保存;

2.实验用培养基

SE培养基：NaNO₃0.25g，K₂HPO₄0.075g，MgSO4·7H₂O0.075g，CaCl₂·2H₂O0.025g，KH₂PO₄0.175g，NaCl0.025g,FeCl₃·6H₂O0.005g，EDTA-Fe1mL/L（1mol/L HCl:取4.1ml浓盐酸用蒸馏水稀释至50ml 1mol/L EDTA-Na₂称取0.9306g溶解至50ml蒸馏水中。称取FeCl₃.6H₂O0.901g溶于10ml以上步骤已经配制完成的1N HCl中,然后与10ml已经配制完成的0.1mol/L EDTA-Na₂混合,加入蒸馏水稀释至1000mL），微量元素溶液1ml/L（H₃BO₃2.86g/L dH₂O，MnCl₂·4H₂O1.86g/L dH₂O，ZnSO₄·7H₂O0.22g/L dH₂O，Na₂MoO₄·2H₂O0.39g/L dH₂O，CuSO₄·5H₂O0.08g/L dH₂O，Co(NO₃)₂·6H₂O0.05g/L dH₂O）,土壤提取液40mL/L（取花园土未施过肥200g置于烧杯或三角瓶中，加入蒸馏水1000毫升，瓶口用透气塞封口，在水浴中沸水加热3小时，冷却，沉淀24小时，此过程连续进行3次，然后过滤，取上清液，于高压灭菌锅中灭菌后于4℃冰箱中保存备用），加水至1000mL，调pH值为7.5～8.0。固体培养基则加琼脂1.8%，湿热灭菌后使用。

该培养基既可用于培养细菌菌株也用于菌种保藏。

本发明所用的其它试剂均采用市售的化学纯。

3.分析测试方法

叶绿素含量测定、叶绿素铜盐的吸收光谱：分光光度法。

4.实验仪器及设备

（1）JY98-3D超声波细胞破碎机，宁波新芝科学仪器研究所

（2）TGL-16M高速台式冷冻离心机

（3）精密电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司

（4）UV-2450紫外分光光度计

（5）KD-98-1型电热恒温水浴锅

（6）SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵

（7）PHS-3C PH计

（8）SW-CJ-1F型洁净工作台。

本发明所述方法有以下步骤：

1）取冷冻（-80℃）保存的小球藻菌种（中国科学院水生物研究所），活化，用SE液体培养基、适当条件下扩大培养，培养到细胞浓度为10⁷个/mL；

2）选取乙醇浓度、超声波时间，皂化时间为自变量，作为单因素实验，通过超声波破细胞壁、皂化、铜代制取叶绿素铜钠盐；

3）步骤2）在单因素实验基础上，利用Box-Benhnken响应曲面分析法，研究各自变量及其交互作用对制取量的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型；确定出了最佳制取工艺条件。

步骤3）所述最佳制取工艺条件为：乙醇浓度为60%，超声波时间为17min，皂化时间为42min；

步骤3）所述叶绿素制取预测值为8.7mg,验证值为8.4mg,相对误差为3.45%，得率为59.5%。

步骤3）所述叶绿素铜钠盐的多项回归模型为：Y=8.63333+0.3000×A+0.32500×B+0.27500×C-0.40000×AB-0.50000×AC+0.65000×BC-0.89167×A²-0.64167×B²-1.24167×C²。

二.制取工艺

1.从小球藻中提取叶绿素铜钠盐的制取工艺流程

小球藻→破壁→皂化→浓缩→除杂→酸化制铜→成盐。

（1）破壁

量取200mL培养的小球藻液（菌体浓度为10⁷个/mL），离心，95%乙醇溶液作浸提剂，小球藻与乙醇的固液比为1：10（g/mL）;超声波萃取（600w，50℃)。通过显微镜观察破壁情况:视野内细胞活性越低,细胞数目越少则破壁越完全。破壁之后离心（3500g,3min)。

（2）叶绿素含量测定

取2.5mL浸提液，用95%乙醇定容至25mL,测定663nm、645nm处的吸光度，做三组平行实验：

叶绿素a浓度C_a=12.7A₆₆₃-2.69A₆₄₅(mg/L)

叶绿素b浓度C_b=22.9A₆₄₅-4.68A₆₆₃(mg/L)

叶绿素总浓度C_总=C_a+C_b

叶绿素含量(mg/L)=C_总×提取液体积×稀释倍数/样品体积

（3）制取

于65℃，用5%的NaOH调至PH11～12皂化；皂化完全后蒸发浓缩至原体积的1/4～1/5；将所得到的浓缩液用蒸馏水、石油醚、50%的乙醇溶液连续洗涤，以除去未被皂化的叶绿素和叶黄素等其他色素杂质；将洗涤液液用盐酸(1:1)调节PH2～3，加20%CuSO₄（小球藻中叶绿素理论值含量的2倍）铜化叶绿素，于60℃铜化40min.。用少量水溶解后，逐渐滴加入2%NaOH-乙醇溶液,即有沉淀生成，控制pH11～12；抽滤，干燥，得到叶绿素铜钠盐。

三．制取叶绿素铜盐的工艺参数

（1）单因素试验结果与分析

1）乙醇浓度对叶绿素含量的影响

用量筒量取200mL新鲜小球藻液，离心，加入20mL不同浓度的乙醇，超声波时间为15min，测定吸光值，计算叶绿素含量。

由图1可知，初期随乙醇浓度的升高，叶绿素含量增大速率较快；当乙醇浓度到达60%时，叶绿素含量达到最大；后期增大乙醇浓度，叶绿素含量增加速率缓慢，因此超声波破壁时乙醇浓度选择60%左右为宜。

2）超声波时间对叶绿素含量的影响

量取200mL新鲜小球藻液，离心，加入20mL浓度为60%的乙醇，超声波时间分别为5、10、15、20min；测定吸光值，计算叶绿素含量。

由图2可知，在15min时，叶绿素含量最高；高于15min时，可能是叶绿素结构被破坏，导致叶绿素含量下降；低于15min时，细胞没有充分破壁。因此超声波时间15min为宜。

3）皂化时间对叶绿素铜盐制取的影响

量取200mL新鲜小球藻液，离心，加入浓度为60%的20mL乙醇，超声波时间为15min,皂化，铜化，成盐，干燥，称量。

由图3可知：随着皂化时间的增加，叶绿素铜盐量增加，40min后，增加速度缓慢，因此，叶绿素皂化时间40min左右为宜。

（2）提取工艺最优参数的确定

1）响应曲面法试验设计

采用Box-Behnken方法，以乙醇浓度、超声波时间、皂化时间3个对叶绿素铜盐得率显著的因素为自变量，分别用X₁、X₂、X₃表示，并根据单因素试验，其取值范围分别为40%～80%，10～20min,30～50min。如表2

表2 响应面分析的因素水平及编码

注：A=(X₁-60)/20;B=(X₂-15)/5;C=(X₃-40)/10.

2）响应面实验设计及结果试验结果见表2。

利用design expert8.0.6(试用版)统计软件对表2试验数据进行回归拟合，得到叶绿素铜盐对以上三个因素的二次多项回归模型为：Y=8.63333+0.3000×A+0.32500×B+0.27500×C-0.40000×AB-0.50000×AC+0.65000×BC-0.89167×A²-0.64167×B²-1.24167×C²。回归分析结果见表3。

表3 响应面试验方案与结果

表4 回归分析结果

由表4可知：模型有较好的显著性（p=0.0175），显著性为P<0.05，根据各因素的p值可知超声波时间与皂化时间交互项（p=0.0345），乙醇浓度二次项（p=0.0126）,超声波时间二次项（p=0.0411），皂化时间二次项（p=0.0032）对叶绿素铜盐得率有显著性影响。

Box-Behnken响应曲面法实验，确定出制取叶绿素铜盐的最佳工艺条件：

乙醇浓度为60%，超声波时间为17min，皂化时间为42min,叶绿素制取预测值为8.7mg/mL。通过验证实验，得到叶绿素铜盐最大制取量为8.4mg/mL，占模型比96.55%,得率为59.5%。说明这种方法可以用来确定最佳优化工艺参数。

四．叶绿素铜盐的检测

采用本发明所述方法制备的叶绿素铜钠盐，经光谱分析，其结构与叶绿素铜钠盐的结构相符（参见图4），其外观为墨绿色带金属光泽,略带氨味,对光、热较稳定,有吸湿性;易溶于水,微溶于乙醇,不溶于石油醚;其水溶液鲜绿翠亮。

采用本发明所述方法制备的叶绿素铜钠盐的主要技术指标如表5所示，吸收光谱如图4所示，在407～413，627～634nm有吸收峰。符合GB26406-2011检验标准。

表5 叶绿素铜钠盐主要技术指标

干燥温度为105℃，时间为2h。

通过Box-Behnken响应曲面法试验，确定出了提取叶绿素铜盐的最佳条件。通过验证试验，得到叶绿素铜盐最大提取量为8.4mg，占模型比96.55%，得率为59.5%。对制得的叶绿素铜盐进行检测，符合GB 26406-2011，说明制取出得叶绿素盐符合标准，可以作为工业化生产叶绿素盐的工艺参数。

Claims (4)

1.一种从小球藻中提取叶绿素铜钠盐的方法，其特征在于，有以下步骤：

1）取小球藻菌种，接种于SE固体培养基上活化，用SE液体培养基扩大培养，浓度为10⁷ 个/mL，得到小球藻液体；

2）取步骤1）所述的小球藻液200mL，离心，所述离心的时间为5min ，离心的速度为3000r/min，用50-65%乙醇作浸提剂，得到小球藻固体，小球藻固体与乙醇的固液比g/mL为1：10，超声波萃取破细胞壁，65℃下，用5%的NaOH溶液调至小球藻破碎液pH为11～12，用5%NaOH皂化30-50 min，溶液蒸发浓缩；

3）将步骤2）所得到的浓缩液用10mL蒸馏水、10mL石油醚、10mL 50%的乙醇溶液连续洗涤；

4）用盐酸调节步骤3）所得溶液的pH为2～3，然后加入2mL质量分数为20%的CuSO₄ 溶液铜化叶绿素，60℃铜化40min^.，用少量蒸馏水溶解后，加入5mL质量分数为2% 的NaOH-乙醇溶液；再用1mol/mL的NaOH溶液溶液调节混合液的pH为11～12；抽滤，干燥，得到叶绿素铜钠盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）所述乙醇浓度为60%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）所述超声波时间为17min，强度为600w。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）所述皂化时间为42min。