CN106070339B - 具有抑藻活性的褐藻多酚组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有抑藻活性的褐藻多酚组合物及其制备方法和应用。本发明通过有机溶剂辅助低温超声的方法提取了泡叶藻，得到的褐藻多酚组合物对“水华”微藻的生长具显著的抑制作用，抑制作用表现为对细胞分裂和叶绿素a合成的抑制，对微藻生长的抑制是多个方面的综合体现。本发明还提供了一种综合利用泡叶藻的方法，可以极大的提高他们的产值，减少能源消耗。

Description

具有抑藻活性的褐藻多酚组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及环境工程领域，特别涉及一种褐藻多酚组合物及其制备方法和应用。

背景技术

褐藻属较高等的多细胞藻类，属真核细胞生物。全世界大约有1,500～2,000种褐藻，主要分布于大陆附近的水域，则淡水种罕见。褐藻的外表从暗褐色的橄榄绿都有，其取决于岩藻黄素与叶绿素的比例。常见的褐藻包括泡叶藻属(Ascophyllum)、马尾藻属(Sargassum)和海带属(Laminaria)。近年来，人们已经证实了褐藻中的一些成分具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗肿瘤和促进生长等活性，因此根据这些生物特性，褐藻逐渐开发为肥料、饲料、药品、化妆品和食品的原料。

泡叶藻(Ascophyllumnodosum)是一种常见的，已大规模养殖的褐藻。原产于北大西洋水域，别名为岩藻、挪威海带、多节海带等。研究表明泡叶藻是含褐藻多酚最多的褐藻之一，其含量大概为干重的6.5％。

“水华”(Algae Bloom)，指的是水体富营养化后导致淡水水体中藻类，如蓝藻、绿藻、硅藻等，大量繁殖的自然生态现象。“水华”不仅影响了生态环境、经济发展，微藻所分泌的毒素还严重影响了饮水质量和人类的健康。通常人们会采用物理、化学和生物的方法进行治理。早期的研究发现大型海藻可能分泌了一些抑制海洋微藻生长的物质，因此在海藻生长区域的附近没有发现微藻。近年来的研究证实，绿藻和红藻中的萜类、多不饱和脂肪酸、溴代过氧化物酶可以影响赤潮微藻的生长。

虽然已有报道将褐藻提取物应用于治理富营养水体，但是其主要的活性物质并没有详细的研究，对微藻生长的抑制作用也没有深入的探讨，而且针对用于抑制“水华”微藻的褐藻提取物，其提取方法也有待优化。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种褐藻多酚组合物的制备方法，包括：

1)褐藻用溶剂进行超声提取；

2)步骤1)得到的提取物分离上清液，浓缩。

根据本发明，所述褐藻包括但不限于泡叶藻，例如可以是泡叶藻或其与其它海藻，优选与其它褐藻的混合物。

根据本发明，所述褐藻在提取前可经过预处理。所述预处理包括浸泡和/或粉碎。优选地，所述泡叶藻为泡叶藻粉。

根据本发明的制备方法，其中：

步骤1)中，超声提取可以采用超声细胞粉碎机进行；

优选地，所述超声提取同时进行搅拌，例如磁力搅拌。例如，所述搅拌的转速为50rpm以上，例如100rpm～500rpm，200rpm～400rpm。所述磁力搅拌转速可以为600～1,400rpm，优选800～1,200rpm，更优选1,000～1,100rpm。

其中，优选地，褐藻原料与溶剂的比例可以是1～50g/100mL溶剂，例如3～20g/100mL溶剂、6～18g/100mL溶剂，优选9～15g/100mL溶剂，更优选12～14g/100mL，如12.81g/100mL溶剂。

超声提取的时间可以为5min以上，例如10～300min，优选20～150min，如30min、45min、60min、90min、120min。

超声功率95～855w，优选190～665w，更优选285～475w。

提取温度可以在55℃以下，例如室温、30℃、40℃或50℃，更优选40℃。

所使用的溶剂可以选自水、醇类溶剂、酯类溶剂、酮类中的一种或多种，优选甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸甲酯、丙酮中的一种或多种，更优选水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和/或丙酮中的一种或多种。当选择两种溶剂组成的混合物作为溶剂时，其混合体积比可以是10:1～1:10，例如9:1～2:1、3:7～7:3或4:6～6:4。作为实例，所述溶剂可以选自40～90体积％，如50～75体积％或65～75体积％的丙酮水溶液，具体可以为70体积％的丙酮水溶液。

步骤2)中，可以将步骤1)得到的提取物离心或过滤，分离上清液。

对于离心的具体条件没有特别限制，例如：温度可以为60℃以下，优选50℃以下，如30℃以下，如10℃以下、如4℃，转速可以为12,000rpm、10,000rpm、8,000rpm、5,000rpm，离心时间为1～60min，例如3min、8min、10min或15min。

作为实例，提取后于4℃，10,000rpm下离心10min。

优选地，在上清液浓缩后还将其干燥。

优选地，上清液浓缩采用减压蒸馏，干燥采用冻干机冻干。

本发明还提供一种褐藻多酚组合物。所述褐藻多酚组合物中褐藻多酚的质量百分比可以在15％以上，优选20％以上，例如24％以上。

优选地，所述褐藻多酚组合物为上述制备方法得到的产物。

本发明还提供了所述褐藻多酚组合物用于抑制“水华”微藻生长的应用，优选用于抑制“水华”微藻的细胞分裂和/或叶绿素a合成。其中，优选地，当褐藻多酚组合物用于抑制“水华”微藻生长时，所述褐藻多酚组合物在微藻生长介质(如培养液或微藻生长水体)中的浓度可以>2体积％，例如2.5体积％以上，如3体积％或4体积％。

所述的微藻包括但不限于小球藻(Chlorella vulgaris)和/或斜栅藻(和Scenedesmus sp.)。该组合物对“水华”微藻生长的抑制通过多方面综合起效，具体表现为对细胞分裂和叶绿素a合成的抑制。

本发明还提供一种综合利用褐藻的方法，包括：

1)使用上述方法提取褐藻后，提取剩余的残渣进行再提取，得到褐藻多糖；

2)步骤1)得到的褐藻多糖中，将褐藻淀粉和甘露醇作为酵母发酵的底物，生产生物能源；和/或将褐藻胶进行降解，分成不同聚合度的寡糖。

有益效果

本发明的褐藻多酚组合物对“水华”微藻的生长具有显著的抑制作用。本发明褐藻多酚组合物的提取方法还取得了良好的提取效率。并且，本发明还实现了对褐藻的综合利用，可以极大的提高他们的产值，减少能源消耗，物尽其用。

附图说明

图1示出3％褐藻提取物对两种微藻作用7天后的生长抑制效果(包括细胞密度和叶绿素a合成指标)。

实施例

以下通过实施例对本发明所述的褐藻多酚组合物的制备方法和应用作进一步的解释与说明，但以下实施例不构成对本发明的限制。

除非另有说明，所述仪器和试剂均可商购获得。

实施例1.泡叶藻提取褐藻多酚组合物的制备

泡叶藻(Ascophyllum nodosum)干粉(100目)购买自加拿大Stawest Botanicals公司。

藻粉用100mL溶剂进行超声提取，采用超声细胞粉碎机(宁波新芝)进行，同时辅助磁力搅拌，转速约1,000rpm，温度控制在30℃以下，70％丙酮为溶剂提取。提取后10,000rpm、4℃离心10分钟，取上清液减压蒸馏后于冻干机冻干，最后将提取物重悬于20mL去离子水，待使用。

表1泡叶藻提取条件实验结果

*功率为细胞粉碎机的总功率(950w)的百分比

另外，还使用50％、75％丙酮水溶液作为提取溶剂，实验a～e相似的提取条件，得到的提取率相近。

实施例2.泡叶藻提取褐藻多酚组合物对“水华”微藻生长的抑制作用

2.1泡叶藻提取物影响微藻生长实验

两种微藻Chlorella vulgaris和Scenedesmus sp.分别在装有30mL无菌培养液的三角瓶中培养，除了对照，其他各加入1mL实施例1实验d的泡叶藻提取物。置于光照培养箱培养7天后，取样用Countstar自动细胞计数仪(Inno-Alliance Biotech,Inc.,USA)测细胞密度，用于计算抑制率。计算公式如下：

两种微藻分别在100mL培养液中培养，提取物的加入量为使得其在该培养液中的浓度为3％(体积比)。培养条件与上述一致。同样采用细胞计数仪培养7天后检测微藻细胞密度，并计算抑制率(图1)。

半最大效应浓度(EC₅₀)指的是泡叶藻提取物引起微藻细胞数减少50％最大效应的浓度。本发明根据不同浓度泡叶藻对微藻生长的抑制率，采用Minitab软件的Probit回归分析方法，计算EC₅₀。

表2泡叶藻提取物对两种微藻的半最大效应浓度(EC₅₀)

结果表明，所述泡叶藻提取物对两种微藻均有良好的抑制作用。

2.2微藻叶绿素a含量的检测

微藻叶绿素a含量是采用超声辅助热乙醇法对两种微藻的叶绿素a进行提取。先采用0.45μm微孔滤膜抽滤10mL水样，然后迅速加入10mL预热的90％乙醇80℃水浴提取2分钟，超声破碎3分钟后，避光静置4小时，用微孔滤膜过滤后，分别在665nm和750nm处测吸光值A₆₆₅和A₇₅₀。加入200μL 1mol/L的盐酸后，再测一遍吸光值B₆₆₅和B₇₅₀。v为提取液体积(mL)，V为样品体积(L)，计算公式如下：

叶绿素a含量常作为指标，用于衡量植物的光合作用强度。如图1所示，泡叶藻提取物极大地减少了斜栅藻和小球藻细胞内叶绿素a的合成。

2.3泡叶藻提取物抑藻活性成分分析

当泡叶藻提取物重新用100％丙酮进行溶解，可以得到可溶和不可溶两个组分。使用100％丙酮多次溶解，以确保这两个组分能完全分开。然后离心、冻干，最后分别溶解于20mL去离子水。

Chlorella vulgaris和Scenedesmus sp.这两种藻分别在30mL BG11培养液中培养，其中分别加入了1mL粗提取物、提取物丙酮可溶和丙酮不可溶部分。7天后，通过微藻细胞数计算微藻生长抑制率。

褐藻多酚含量测定是通过福林酚法(Folin–Ciocalteu method)测定提取物不同组分中总多酚含量。提取物样品、福林酚试剂和碳酸钠混合后，在室温静置1h。用分光光度计测量溶液在765nm的吸光度。测量结果通过没食子酸标准曲线进行计算，总多酚含量为g没食子酸当量/g干重(提取物)。

当泡叶藻粗提物重新用100％丙酮溶解时，可得到丙酮溶解组分和丙酮不溶组分，他们的干重分别占粗提物的38.48％和61.52％，而褐藻多酚含量分别占粗提物的73.86％和22.15％。分别将这两个组分按之前比例添加到培养液中，7天后得知丙酮可溶组分对两种微藻生长的抑制作用与泡叶藻粗提物一致。

表3褐藻多酚(PC)的含量(％)

另外，采用实施例1实验a、b、c和e的提取物重复进行上述实验，结果相似。

Claims (13)

1.一种褐藻多酚组合物或其溶液用于抑制“水华”微藻生长的应用，其中所述褐藻多酚组合物中褐藻多酚的质量百分比在24％以上，并且所述褐藻多酚组合物的制备方法包括：

1)褐藻用溶剂进行超声提取；

2)步骤1)得到的提取物分离上清液，浓缩；

其中，所述褐藻是泡叶藻；所述褐藻在提取前经过预处理，所述预处理包括浸泡和/或粉碎；

褐藻原料与溶剂的比例是6～18g/100mL溶剂；所述溶剂选自50～75体积％的丙酮水溶液；

提取温度在40℃以下；

其中，所述微藻选自小球藻(Chlorella vulgaris)和/或斜栅藻(和Scenedesmussp.)。

2.一种褐藻多酚组合物或其溶液用于抑制“水华”微藻生长的应用，其中所述褐藻多酚组合物中褐藻多酚的质量百分比在24％以上，并且所述褐藻多酚组合物的制备方法包括：

1)泡叶藻粉用溶剂进行超声提取；

2)步骤1)得到的提取物分离上清液，浓缩；

泡叶藻粉与溶剂的比例是9～15g/100mL溶剂；所述溶剂选自70～75体积％的丙酮水溶液；

提取温度在30℃以下；

其中，所述微藻选自小球藻(Chlorella vulgaris)和/或斜栅藻(和Scenedesmussp.)。

3.如权利要求1或2所述的应用，其中所述制备方法中：

步骤1)中，超声提取采用超声细胞粉碎机进行；

所述超声提取同时进行搅拌；

超声提取的时间为5min以上；

超声功率95～855w；

提取温度在室温或30℃。

4.如权利要求3所述的应用，其中所述制备方法中：

步骤1)中，所述超声提取同时进行磁力搅拌；

超声提取的时间为10min以上；

超声功率190～665w。

5.如权利要求3所述的应用，其中所述制备方法中：

超声提取的时间为20min以上；

超声功率285～475w。

6.如权利要求4或5所述的应用，其中所述制备方法中：

步骤2)中，将步骤1)得到的提取物离心或过滤，分离上清液。

7.如权利要求6所述的应用，其中所述制备方法中，在上清液浓缩后还将其干燥。

8.如权利要求7所述的应用，其中所述制备方法中，上清液浓缩采用减压蒸馏，干燥采用冻干机冻干。

9.如权利要求7或8所述的应用，其中所述的褐藻多酚组合物或其溶液用于抑制“水华”微藻的细胞分裂和/或叶绿素a合成；

所述褐藻多酚组合物在微藻生长介质中的浓度>2体积％。

10.如权利要求9所述的应用，其中所述褐藻多酚组合物在微藻生长介质中的浓度为2.5体积％以上。

11.如权利要求9所述的应用，其中所述褐藻多酚组合物在微藻生长介质中的浓度为3体积％以上。

12.如权利要求9所述的应用，其中所述褐藻多酚组合物在微藻生长介质中的浓度为4体积％以上。

13.如权利要求10-12所述的应用，还包括：

1)提取泡叶藻后，提取剩余的残渣进行再提取，得到褐藻多糖；

2)步骤1)得到的褐藻多糖中，将褐藻淀粉和甘露醇作为酵母发酵的底物，生产生物能源；和/或将褐藻胶进行降解，分成不同聚合度的寡糖。