CN101914075B - 一种从褐藻中提取褐藻黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从褐藻中提取褐藻黄素的方法。提取时将粉碎的褐藻先经过水溶涨预处理，再用水溶性有机溶剂浸提，依次采用萃取法，两次柱层析法对浸提液中的褐藻黄素进行纯化，最后经制备薄层层析法或制备高效液相色谱法进一步纯化得到纯度90％以上或99％以上的褐藻黄素标准品。本发明工艺简单、经济、高效，为褐藻黄素工业化生产和提高海藻的工业利用率提供了实验依据。
Description
【技术领域】
本发明属于天然产物提取技术领域。更具体地，本发明涉及一种从褐藻中提取褐藻黄素的方法。
【背景技术】
褐藻黄素，又名墨角藻黄素、岩藻黄质，是一种重要的类胡萝卜素，呈黄褐色，具有非常强的抗氧化作用，分子式为C42H58O6，CAS登录号3351-86-8。
褐藻黄素大量存在于褐藻和硅藻中，目前尚未发现在其他藻类和陆生植物中存在褐藻黄素。褐藻黄素作为一种很强的抗氧化剂，甚至优于维生素C和维生素E，具有抗衰老、增强免疫力、预防、治疗癌症的作用，可添加到非处方药或营养保健品中。日本北海道大学研究生院细川雅史教授领导的研究小组发现褐藻黄素具有抑制癌细胞增殖的作用，使癌细胞增殖率约减少15％，远远超过水果和蔬菜色素成分。另外，日本北海道大学研究人员Hayato Maeda通过小鼠实验还发现褐藻黄素具有显著的减肥功效，认为是通过两种方式消除脂肪堆积的：(1)增强了UCP 1蛋白在脂肪组织中的表达，这种蛋白可以促进脂肪分解；(2)刺激肝脏生成降低胆固醇水平的DHA。在动物实验中，研究人员证实褐藻黄素不会引起实验动物的成瘾，也没有任何其它的副作用。
褐藻黄素拥有如此多的对人类健康有益的生物学功能，拥有非常广阔的开发利用价值。但褐藻黄素的大规模提取技术及其应用的研究在国内较少，即使在国外，褐藻黄素大规模提取分离技术亦不成熟。现在市场上出售的褐藻黄素产品成本高，价格昂贵，尚不能达到大众消费水平。
海带属褐藻属，含有大量的褐藻黄素，约47.5mg/100g(干重)，占海带中类胡萝卜素总量的60％以上。我国海带年产量达50万吨(鲜品)，占世界年总产量的一半以上。但我国海带的工业利用率仅为30％，还有约70％具有很大经济效益的成分(如褐藻黄素，褐藻糖胶)被丢弃掉了，造成了大量自然资源的浪费。
专利CN 100999508A公开了一种从褐藻中提取藻褐黄素的方法，该方法以褐藻为原料，经60％-100％乙醇提取、浓缩、过滤沉淀、大孔吸附树脂柱层析、喷雾干燥制得产品，经HPLC法测定，产品中褐藻黄素的重量含量为1％-20％。本方法存在浸提时间长，提取得率较低，杂质多等缺陷。
专利CN 1706836A公开了一种从海藻中分离褐藻黄素的方法，该方法为将海藻用二甲基亚砜在黑暗中浸提，浸提时间为15-60分钟，二甲基亚砜的用量为2-6ml/每克海藻。然后用0.5-1.5倍体积的乙酸乙酯和1倍体积的0.25-3.0mol/L的(NH4)2SO4溶液将浸提液中的色素萃取到乙酸乙酯中，最后经过3-4次硅胶层析柱得到高纯度的褐藻黄素。此方法与传统的方法相比缩短了提取时间，褐藻黄素的得率也提高了，但二甲基亚砜作为浸提溶剂存在一定的缺陷：
(1)二甲基亚砜与各种溶剂互溶性好，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机溶剂，经过乙酸乙酯和硫酸铵溶液萃取后，在乙酸乙酯相中有残留，而二甲基亚砜又具有高沸点，不能通过低温减压蒸馏的方法除去，使得样品无法干燥，并且它的存在会影响之后的褐藻黄素纯化；
(2)乙酸乙酯对浸提液的萃取是将二甲基亚砜溶液中的所有色素全部转移，没有实现色素分离，所以之后要经过多次的柱层析才能得到高纯度的褐藻黄素。如果能在萃取时除去部分杂质，便能简化之后的纯化过程。
本发明提取褐藻黄素时将粉碎的褐藻先经过水溶涨预处理，再用水溶性有机溶剂在黑暗中浸提1-3次，依次采用萃取法，两次柱层析法对浸提液中的褐藻黄素进行纯化。水对海带的预处理可能改变了海带表面胶质层的组织结构和细胞的渗透压，防止有机溶剂使海藻细胞壁硬化，相同时间内使浸提液中褐藻黄素的含量提高了两倍多，叶绿素a的含量降低，改善了传统色素提取法提取褐藻黄素，浸提时间长，提取得率较低，杂质多的缺陷，仅需一小时就能使褐藻黄素浸提得率在70％以上。萃取时只针对褐藻黄素，其它杂质大部分都留在了浸提液中。与高效的DMSO提取法相比，提取效率更高，分离方法更简便，成本更低。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种从褐藻中提取褐藻黄素的方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种从褐藻中提取褐藻黄素的方法。该方法的步骤如下：粉碎的褐藻先用水进行水溶涨预处理5-20min，然后在避光的条件下用甲醇、丙酮或二甲基亚砜水溶性有机溶剂进行浸提，其浸提液在除去不溶物后使用正己烷萃取剂萃取，其萃取液使用硅胶柱层析分离两次，该层析液然后进行制备薄层层析分离，这样分离得到纯度90％以上的褐藻黄素。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的层析液进行制备高效液相色谱分离，这样分离得到纯度99％以上的褐藻黄素。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的粉碎褐藻是淡干褐藻于室温下用自来水清洗2-3次，除去附着在其表面上的泥沙杂物，然后在阴暗处自然风干，再用粉碎机粉碎至-30目的褐藻。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的褐藻是一种或多种选择自海带、马尾藻、墨角藻、裙带菜或羊栖菜的褐藻。
根据本发明的另一种优选实施方式，在所述的水溶涨预处理中，所述褐藻与水的重量比是1∶3-6。
根据本发明的另一种优选实施方式，在所述的水溶性有机溶剂浸提中，所述的褐藻在浸提温度15-35℃、褐藻重量克与水溶性有机溶剂体积毫升之比1∶3-7的条件下浸提20-60min，重复浸提1-3次。
根据本发明的另一种优选实施方式，在所述的萃取中，所述萃取剂与所述浸提液的体积比是0.5-1.5∶1。
根据本发明的另一种优选实施方式，在所述的两次硅胶柱层析分离中，第一次流动相是由丙酮与正己烷按照体积比1∶2至1∶3组成的；第二次流动相是由丙酮与氯仿按照体积比1∶6至1∶13组成的。
根据本发明的另一种优选实施方式，在所述的制备薄层层析分离中，展开剂是由丙酮与氯仿按照体积比1∶9-1∶12组成的。
根据本发明的另一种优选实施方式，在所述制备高效液相色谱分离中，流动相是由甲醇与水按照体积比85∶15至90∶10组成的。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种从褐藻中提取褐藻黄素的方法。该方法的步骤如下：粉碎的褐藻先用水进行水溶涨预处理5-20min，然后在避光的条件下用甲醇、丙酮或二甲基亚砜水溶性有机溶剂进行浸提，其浸提液在除去不溶物后使用正己烷萃取剂萃取，其萃取液使用硅胶柱层析分离两次，该层析液然后进行制备薄层层析分离，这样分离得到纯度90％以上的褐藻黄素。
根据本发明，所述的褐藻是一种或多种选择自海带、马尾藻、墨角藻、裙带菜或羊栖菜的褐藻。
海带是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物。海带一般长2-4米，最长达7米。可分固着器、柄部和叶片三部分。固着器叉形分枝，用以附着海底岩石。柄部短粗，圆柱形。叶片狭长，带形。它分布在中国北部及东南沿海及朝鲜、日本太平洋地区沿岸。
马尾藻藻体分为固着器、主干和“叶”三部分。固着器盘状或假根状等；主干圆柱状，向四外分枝；“叶”扁平或棍棒状，扁平叶在中央有中肋。从叶状体的柄长出气囊和生殖托。它生长在低潮带石沼中或潮下带2-3米水深处的岩石上。我国是马尾藻主要产地之一，盛产于广东、广西、海南岛沿海。
墨角藻为多年生藻类，呈扁平或圆柱形状，二叉状分枝或在主干周围呈辐射状分枝。顶端生长，每个表皮细胞内具有数个盘状色素体。大部分墨角藻分布在热带和亚热带海洋。
裙带菜的孢子体黄褐色，外形很象破的芭蕉叶扇，高1-2m，宽50-100cm，明显地分化为固着器、柄及叶片三部分。裙带菜为温带性海藻，它能忍受较高的水温，我国自然生长的裙带菜主要分布在浙江省的舟山群岛及嵊泗岛。
羊栖菜是生活于海洋里的一种藻类，是一种富营养的食用藻，享有“保健珍品”的盛誉。我国北起辽东半岛，南至雷州半岛，均有它的分布。它喜丛生在浪大流急的礁石上，株高一般为30-50厘米，最高可达200-220厘米。藻体由假根、茎、叶片和气囊组成。假根为吸盘状的基部固着器，茎为直立圆柱状的主枝，叶片、气囊。藻体鲜呈黄褐色，干品呈黑色。
优选地，所述的褐藻是海带。
首先，选用淡干褐藻在室温下用自来水清洗2-3次，除去附着在其表面上的泥沙、浮生物、胶质等杂物，然后在阴暗处自然风干，取干燥后的褐藻用粉碎机粉碎至-30目。本发明使用的粉碎机可以是在食品加工中通常使用的在目前市场上销售的粉碎机，例如江阴市新友机械制造有限公司生产的食品粉碎机。粉碎的粒度不是很关键的，其粒度可以大些，也可以小些。
褐藻粉碎后由于其中的褐藻黄素易发生氧化反应，所以粉碎的褐藻应该放在温度低于4℃的冷藏箱中保存待用。
粉碎的褐藻先进行水溶涨预处理，即在所述褐藻与水的重量比1∶3-6与室温的条件下用水浸泡8-12min，让所述的褐藻吸收足够的水分，使褐藻表面的水溶性胶质处于流体状态，易于褐藻中的褐藻黄素浸出。
然后，经水溶涨预处理的褐藻在避光、浸提温度15-35℃、褐藻重量克与水溶性有机溶剂体积毫升之比1∶3-7的条件下浸提20-60min，重复浸提1-3次。合并浸提液再进行离心或过滤除去其中的不溶物，得到清澈的浸提液。
根据本发明，所述的避光应该理解是所述的浸提不能在阳光自然光或强白帜灯光下进行，避光的目的在于避免在浸提过程中发生一些光化反应，产生一些副产物。
所述的水溶性有机溶剂是甲醇、丙酮或二甲基亚砜。优选地，所述的水溶性有机溶剂是丙酮。
优选地，所述的褐藻在避光、浸提温度15-35℃、褐藻重量克与水溶性有机溶剂体积毫升之比1∶4-6的条件下浸提30-40min，这样浸提重复2次。
得到的浸提液需要进行纯化处理。
根据本发明，所述的纯化处理是利用褐藻黄素与其他杂质在萃取剂相与浸提液水相之间的分配系数不同而达到它们的分离，萃取剂将浸提液中的褐藻黄素转移到萃取剂相中，而其他杂质仍留在浸提液水相中。
在本发明中，所述的萃取剂是正己烷萃取剂。萃取时，正己烷萃取剂与所述浸提液的体积比是0.5-1.5∶1，优选地，0.8-1.2∶1。
按照本发明，可以采用化学领域中人们熟知的各种萃取方法，例如间断萃取法或连续萃取法。萃取使用的设备可以是化学领域中人们熟知的萃取设备，例如萃取塔或混合澄清器。
萃取得到的萃取液再进行硅胶柱层析分离，然后进行制备高效液相色谱分离。
根据本发明，硅胶柱层析分离是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。
按照本发明，可以采用化学领域中人们熟知的硅胶柱层析法。在本发明中，使用的硅胶是目前市场上销售的硅胶，例如青岛海洋化工厂分厂G型硅胶。根据本发明，需要进行两次硅胶柱层析分离，第一次硅胶柱层析分离时，第一次流动相是由丙酮与正己烷按照体积比1∶2至1∶3组成的，分离时收集橘黄色条带的馏分，再进行浓缩，然后，进行第二次硅胶柱层析分离，第二次流动相是由丙酮与氯仿按照体积比1∶6至1∶13组成的，分离时收集颜色最深的橘黄色条带，得到高纯度褐藻黄素。
这样的纯褐藻黄素可以采用制备薄层层析法或制备高效液相色谱法再进一步进行纯化。
制备薄层层析法是一种色谱法，是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板上，形成薄层后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。
在本发明中，使用的仪器例如是青岛海洋化工厂分厂G型50X150mm制备薄层层析硅胶板；采用制备薄层层析的条件是丙酮与氯仿体积比1∶9。
在所述的制备薄层层析分离中，使用的展开剂是由丙酮与氯仿按照体积比1∶9至1∶12组成的。
根据本发明，所述的硅胶柱层析液经制备薄层层析分离可以得到纯度90％以上的褐藻黄素。
制备高效液相色谱法是一种本技术领域的技术人员熟知的方法。
在本发明中，使用的仪器例如是Waters4000制备型高效液相色谱仪；采用制备高效液相色谱的条件是柱型号19×300mm，7μm，SymmetryPrepTM，流速为8mL/min；进样量为8mL。
在本发明中，所述制备高效液相色谱法使用的流动相是由甲醇与水按照体积比85∶15至90∶10组成的。
所述的硅胶柱层析液经制备高效液相色谱分离可以得到纯度99％以上的褐藻黄素。
在浸提过程中褐藻黄素含量的测定：采用紫外吸收光谱法，根据褐藻黄素在450nm处有特征吸收峰，叶绿素c和叶绿素a分别在630nm和668nm处有特征吸收峰，按照常规光谱分析方法测定所述浸提液的紫外吸收光谱，再利用相应特征吸收峰的吸光值可以初步定量分析浸提液中的各个色素含量。
在纯化过程中褐藻黄素纯度的测定：根据褐藻黄素的紫外吸收光谱分析(300-800nm)和高效液相色谱(YWG-C18-10μm，250mm×4.6mm；甲醇∶水＝90∶10；1ml/min；449nm)面积归一法测定褐藻黄素的纯度。
褐藻黄素提取收率的确定：称取1.1mg褐藻黄素样品(本发明方法制得)用800μl甲醇溶解，分别稀释2，3，4，5，6倍，用HPLC法对各褐藻黄素溶液进行测定，建立褐藻黄素的标准曲线。根据标准曲线计算浸提液中褐藻黄素的含量，并根据以下公式计算出浸提过程中褐藻黄素的得率(FRR)：
FRR＝褐藻黄素的质量/1g干海带中褐藻黄素的含量。
[有益效果]
1、本发明的方法简单，成本低。
本发明操作简单，所用试剂和仪器少，且使用的溶剂丙酮、正己烷均为低沸点溶剂，易于回收，大大的降低了成本。
2、浸提效率高。
本发明在浸提前对原料进行了水溶涨预处理，水对褐藻的预处理改变了其表面胶质层的组织结构和细胞渗透压，能使细胞中的色素很快被浸出，也能防止有机溶液使海藻细胞壁硬化，使溶剂能够顺畅进出细胞，在相同时间内可以使浸提液中褐藻黄素含量提高一倍以上，叶绿素a的含量大大降低。浸提前预处理解决了用传统色素提取溶剂提取褐藻黄素时，浸提时间长，褐藻黄素收率低，杂质多的问题，仅需一小时就能使褐藻黄素浸提得率达到70％以上。
3、实施效果非常明显。
与现有技术相比，本发明萃取方法的萃取效率高。本发明的方法仅一次就能几乎萃取在浸提液中的全部褐藻黄素，而大量的叶绿素和多糖不被萃取。
【附图说明】
图1是采用本发明方法制备产品的紫外吸收光谱图；
图2是采用本发明方法制备产品的高效液相色谱图。
【具体实施方式】
实施例1
淡干海带于室温下用自来水清洗2次，除去表面的泥沙、浮生物、胶质等杂物，然后在阴暗处自然风干，再使用江阴市新友机械制造有限公司生产的粉碎机粉碎至30目以下，然后置于温度4℃冰箱中保藏待用。
将1g粉碎的海带放于碘量瓶中，用4ml水浸泡10min，直至海带充分吸收水分，海带表面变干。然后在室温与避光的条件下用5ml丙酮水溶性有机溶剂浸提30min，重复浸提2次。与此同时，在相同的条件下，使用未经溶涨处理的相同海带分别用丙酮或75体积％丙酮水溶液浸提30min，重复浸提2次。分别收集浸提液进行离心除去不溶物，再使用尤尼柯公司以商品名2802s销售的紫外可见分光光度计测定不同浸提液在300-800nm的紫外吸收光谱，在450nm、630nm和668nm处的吸收峰分别是褐藻黄素、叶绿素c和叶绿素a的特征吸收峰。由该紫外吸收光谱图中褐藻黄素、叶绿素a、叶绿素c的吸光值对它们进行初步的定量。这些测定结果列于表1中。
表1：不同提取液中的褐藻黄素、叶绿素c和叶绿素a的吸光值(稀释3倍)
由表1可以清楚地看出，采用本发明方法提取褐藻黄素的效率远高于使用丙酮或75体积％丙酮水溶液，也即本发明方法的分离效率也远高于其它方法的效率。
收集的浸提液在离心除去不溶物后进行硅胶柱层析分离两次。使用硅胶柱的硅胶粒度200-300目；柱为350×25mm，流动相是丙酮∶正己烷(以体积计1∶3)混合物，收集橘黄色条带，浓缩，再使用硅胶柱进行第二次分离，硅胶粒度200-300目；柱为350×25mm，流动相是丙酮∶氯仿(以体积计1∶9)，收集颜色最深的橘黄色条带。将最后收集的溶液在旋转蒸发仪中蒸干，得到膏状物，然后用丙酮溶解，再采用紫外可见吸收光谱分析(300-800nm)和高效液相色谱(YWG-C18-10μm，250mm×4.6mm；甲醇∶水＝90∶10；1ml/min；449nm)面积归一法得出褐藻黄素纯度在70％以上，所述方法制备的产品的紫外吸收光谱见图1，高效液相色谱图谱见图2。
采用高效液相色谱分析技术中的常规方法，使用标准物质绘制出标准曲线，由相应的色谱峰计算出丙酮浸提液中褐藻黄素的含量。采用上述方法测定得到本实施例浸提液中褐藻黄素的含量为0.3411mg。再根据下式计算出提取率为71.8％：
提取率＝褐藻黄素测定含量/海带中的褐藻黄素含量。
实施例2
本实施例按照与实施例1同样的实施方式进行，只是分别用5ml丙酮、二甲基亚砜、甲醇水溶性溶剂进行一次浸提，时间为30min。这些测定结果列于表2中。
表2：使用丙酮、DMSO、甲醇浸提时褐藻黄素、叶绿素c和叶绿素a的吸光值(稀释3倍)
| OD450(褐藻黄素) | OD630(叶绿素c) | OD668(叶绿素a) | |
| 丙酮浸提液 | 1.573 | 0.179 | 0.127 |
| DMSO浸提液 | 1.094 | 0.146 | 0.093 |
| 甲醇浸提液 | 0.633 | 0.071 | 0.068 |
由表2可以清楚地看出，采用本发明方法，即对海带进行预处理后使用丙酮提取褐藻黄素，其效率远高于相同条件下使用其它溶剂(DMSO，甲醇)提取的效率。
实施例3
本实施例按照与实施例1同样的实施方式进行，只是1g粉碎的海带分别用4、5、6、7ml丙酮进行一次浸提，时间为30min。这些测定结果列于表3中。
表3：不同丙酮用量浸提时褐藻黄素、叶绿素c和叶绿素a的吸光值(稀释3倍)
| OD450(褐藻黄素) | OD630(叶绿素c) | OD668(叶绿素a) | |
| 4ml丙酮浸提液 | 1.335 | 0.272 | 0.270 |
| 5ml丙酮浸提液 | 1.612 | 0.220 | 0.257 |
| 6ml丙酮浸提液 | 1.383 | 0.1785 | 0.220 |
| 7ml丙酮浸提液 | 1.210 | 0.1445 | 0.224 |
由表3可以清楚地看出，在本发明方法条件下，使用海带重量克与丙酮体积毫升之比为1∶5时，提取褐藻黄素的效率优于其它比例。
实施例4
本实施例按照与实施例1同样的实施方式进行，只是用丙酮对海带进行一次浸提，浸提时间分别是10、20、30、60min。这些测定结果列于表4中。
表4：不同浸提时间的褐藻黄素、叶绿素c和叶绿素a的吸光值(稀释3倍)
| OD450(褐藻黄素) | OD630(叶绿素c) | OD668(叶绿素a) | |
| 10min丙酮浸提液 | 1.240 | 0.162 | 0.163 |
| 20min丙酮浸提液 | 1.341 | 0.165 | 0.162 |
| 30min丙酮浸提液 | 1.623 | 0.191 | 0.151 |
| 60min丙酮浸提液 | 1.719 | 0.200 | 0.164 |
由表4可以清楚地看出，在本发明方法条件下，褐藻黄素的提取效率随着浸提时间的延长而提高，在30min内褐藻黄素的提取效率随时间的延长提高的幅度较大，超过30min后，褐藻黄素的提取效率提高幅度不明显。
实施例5
本实施例按照与实施例1同样的实施方式进行，只是分别用丙酮对海带浸提1、2、3次，每次30min。这些测定结果列于表5中。
表4：不同浸提次数的褐藻黄素、叶绿素c和叶绿素a的吸光值(稀释3倍)
| OD450(褐藻黄素) | OD630(叶绿素c) | OD668(叶绿素a) | |
| 第一次丙酮浸提液 | 1.521 | 0.161 | 0.185 |
| 第二次丙酮浸提液 | 1.292 | 0.236 | 0.796 |
| 第三次丙酮浸提液 | 0.519 | 0.162 | 1.169 |
由表5可以清楚地看出，在本发明方法条件下，褐藻黄素的提取效率随浸提次数的增加而明显降低，第一次的提取效率略高于第二次，而这两次的效率远远高于第三次。此外，杂质叶绿素a的含量随着浸提次数的增加而明显增加。
Claims (9)
1.一种从褐藻中提取褐藻黄素的方法，其特征在于该方法的步骤如下：粉碎的干褐藻先用水进行水溶涨预处理5-20min，然后在避光的条件下用甲醇、丙酮或二甲基亚砜进行浸提，其浸提液在除去不溶物后使用正己烷萃取剂萃取，其萃取液使用硅胶柱层析分离两次，该层析液然后进行制备薄层层析分离，这样分离得到纯度90％以上的褐藻黄素；所述干褐藻是干海带。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的层析液进行制备高效液相色谱分离，这样分离得到纯度99％以上的褐藻黄素。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的粉碎的干褐藻是淡干褐藻于室温下用自来水清洗2-3次，除去附着在其表面上的泥沙杂物，然后在阴暗处自然风干，再用粉碎机粉碎至30目的干褐藻。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述的水溶涨预处理中，所述干褐藻与水的重量比是1∶3-6。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述浸提中，所述的褐藻在浸提温度15-35℃、褐藻重量克与甲醇、丙酮或二甲基亚砜体积毫升之比1∶3-7的条件下浸提20-60min，重复浸提1-3次。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述的萃取中，所述萃取剂与所述浸提液的体积比是0.5-1.5∶1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述的两次硅胶柱层析分离中，第一次流动相是由丙酮与正己烷按照体积比1∶2至1∶3组成的；第二次流动相是由丙酮与氯仿按照体积比1∶6至1∶13组成的。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述的制备薄层层析分离中，展开剂是由丙酮与氯仿按照体积比1∶9至1∶12组成的。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述制备高效液相色谱分离中，流动相是由甲醇与水按照体积比85∶15至90∶10组成的。
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