CN104250309A - 一种裂片石莼多糖及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种裂片石莼多糖及其应用,所述裂片石莼多糖通过如下方法制备:以洗净的裂片石莼为原料,利用超声波辅助水提醇沉工艺获得裂片石莼粗多糖;所述裂片石莼粗多糖以离子交换剂A103S作为填料,采用径向流色谱柱脱色脱蛋白;脱色脱蛋白后的裂片石莼粗多糖以葡聚糖凝胶Sephadex-G100为填料,利用径向流色谱柱分离纯化,获得分子量均一的裂片石纯多糖。本发明的裂片石莼多糖的制备方法具有环保、快速、高效、成本低的特点,适用于大规模生产;制得的裂片石莼多糖蛋白质和色素含量均较低,达到较高的纯度,且分子量分布集中,均有助于提升吸湿保湿性能,且首次被发现其具有剪切增稠性质。因此,本发明制得的裂片石莼多糖可用作吸湿保湿剂和增稠剂。
Description
(一)技术领域
本发明涉及海洋物质的研究与开发,具体涉及一种裂片石莼多糖及其应用,尤其是在吸湿保湿中的应用,属于海洋亲水性胶体领域。
(二)背景技术
目前最常用的保湿剂主要有透明质酸、甲壳素及其衍生物等,透明质酸的工业生产有制造成本高、生产效率低等缺点,甲壳素不能直接溶于水,限制了在日化方面的广泛应用。常用的化学合成保湿剂如甘油,其吸湿性显著,但保湿性一般,而且保湿效果会随环境的变化而变化。而从天然植物中提取到的多糖,具有无毒副、无刺激、与皮肤的亲和性好等特性。近年来随着海洋经济的逐渐兴起,各种海洋藻类的生物成分开始应用于化妆品中,满足人们对化妆品提出的天然、营养、无刺激性等要求。
海洋面积辽阔,海洋藻类植物来源丰富,海藻多糖正逐步成为生物多糖的主要来源之一。藻多糖具有很高的药用价值,在提高人体非特异性免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、降血糖、降血脂方面具有显著的作用。海藻多糖中的活性物质多为葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等单糖组成的水溶性酸性、中性多糖。海藻多糖中含有多个羟基、羧基和其他极性集团,可与水分子形成氢键,从而牢固结合水分子;此外,多糖与基质中的其他多糖组分及纤维状蛋白质共同组成含有大量水分的胞外胶状基质,为皮肤提供水分;多糖复杂的空间构型也可以吸附一定量的水分子。因此多糖的高吸水性能可为皮肤提供良好的保湿效果。
目前多糖提取采用了许多不同的方法,包括溶剂提取法、酸提法、碱提法、微波法等。提取后粗多糖中蛋白质和色素的脱除是多糖分离工程中的关键步骤。传统步骤根据色素性质不同采取不同的方法脱色,常用的脱色方法有吸附法。多糖脱除色素后,采用轴式DEAE-纤维素吸附洗脱的层析法进行分级纯化,但存在产品产量低、耗时长、分离效率低、压降大等缺点,对多糖类生物活性物质的纯化及工厂化生产十分不利。因此,找到一种简单、高效的脱色脱蛋白、分离纯化方法是本领域技术人员的一个研究方向。
此外,天然植物提取物中,剪切变稀流体占大多数,如卡拉胶、黄原胶、海藻酸钠、阿拉伯胶等等,而剪切增稠流体所占比例较小,仅有生淀粉糊等。若能在海藻多糖中找到新的具有明显的剪切变稠行为的提取物,有利用开发新的海藻多糖类产品。
裂片石莼属于绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、石莼属,富含糖、蛋白质、脂肪、氨基酸、粗纤维、无机盐等成分。裂片石莼中含有较多的水溶性硫酸多糖,具有降血脂、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤等生物活性。在我国海藻类中石莼是重要的大型经济藻类,在沿海均有分布,市场上价格便宜。裂片石莼多糖是从裂片石莼中提取的一类杂多糖,陈蒙[裂片石莼多糖的提取、抗氧化活性及其保润应用研究,浙江工业大学硕士学位论文,2013年](下面称之为D1)报道了裂片石莼多糖的超声波辅助提取、分离纯化方法及所获得的裂片石莼粗多糖、裂片石莼多糖的理化性质,及其抗氧化活性和保润应用的研究。该论文存在以下技术问题:1、没有脱除蛋白质脱除色素的步骤,导致在超滤后的多糖还含有一定量的杂质蛋白质和色素,增加了在后期处理中的难度;2、使用的纯化方法非常复杂,需先稀释过滤分别浓缩,再采用DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱和Sephadex-G100葡聚糖凝胶柱进行纯化,才能获得分子量相对均一的纯品;3、使用的DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱需先以蒸馏水洗脱,再以0.2、0.4、1.0和2mol/L的NaCl梯度洗脱,分部收集,且洗脱的多糖含有相当浓度的NaCl,后续葡聚糖凝胶柱需要脱盐并利用大量的纯水才能从葡聚糖凝胶上冲洗下来。综上,该论文所采用的提取裂片石莼多糖的方法以及产品质量都有待进一步改进。CN 103483460A公开了一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法,本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的裂片石莼硫酸多糖的制备方法:将裂片石莼粉碎后用水超声提取,醇沉制得粗多糖,用装填有弱碱性阴离子交换树脂的径向流色谱柱进行脱色素脱蛋白,洗脱后按分子量进行超滤分离,取分子量10KD至30KD的裂片石莼多糖组分加入装填有DEAE琼脂糖凝胶的径向流色谱柱进行富集提纯,制备的平均分子量为20KD多糖具有显著的抗肿瘤活性,但该多糖不适合作为增稠剂和吸湿保湿剂使用。
(三)发明内容
本发明的内容在于提供一种裂片石莼多糖及其作为吸湿保湿剂和增稠剂的应用,该裂片石莼多糖的制备方法具有环保、快速、高效、成本低的特点,适用于大规模生产;制得的裂片石莼多糖蛋白质和色素含量均较低,达到较高的纯度,且分子量分布集中,均有助于提升吸湿保湿性能,且首次被发现其具有剪切增稠性质。
为实现上述发明目的,本发明采用如下技术方案:
一种裂片石莼多糖,其制备方法为:以洗净的裂片石莼为原料,利用超声波辅助水提醇沉工艺获得裂片石莼粗多糖;所述裂片石莼粗多糖以离子交换剂A103S作为填料,采用径向流色谱柱脱色脱蛋白;脱色脱蛋白后的裂片石莼粗多糖以葡聚糖凝胶Sephadex-G100为填料,利用径向流色谱柱分离纯化,获得分子量均一的裂片石纯多糖。
进一步,所述的裂片石莼多糖的制备方法具体按照如下步骤进行:
(1)以洗净的裂片石莼为原料,利用超声波辅助水提醇沉工艺获得裂片石莼粗多糖;
(2)将裂片石莼粗多糖加水配制成10~30mg/ml的水溶液,于5000~10000r/min、4~10℃条件下离心后取上清液过0.45~0.8μm微孔滤膜,得滤过液;
(3)将步骤(2)得到的滤过液加入径向流色谱柱,其中填料是离子交换剂A103S,上样流速为2~8ml/min,用蒸馏水以20~60ml/min的流速对样品进行洗脱,洗脱完毕后,收集洗脱液;
(4)将步骤(3)收集的洗脱液浓缩至5~15mg/ml,再次加入径向流色谱柱,其中填料是葡聚糖凝胶Sephadex-G100,上样流速2~40ml/min,上样量50~300ml,上样浓度3~30mg/ml,用蒸馏水以5~50ml/min的洗脱流速,的流速对样品进行洗脱,收集洗脱液,减压浓缩、冷冻干燥得裂片石莼多糖。
更进一步,所述步骤(2)中,将裂片石莼粗多糖加水配制成10mg/ml的水溶液。
更进一步,所述步骤(3)中,上样流速为5ml/min,洗脱流速为40ml/min。
更进一步,所述步骤(4)中,将步骤(3)收集的洗脱液浓缩至10mg/ml;上样流速5ml/min,洗脱流速40ml/min。
本发明所述步骤(1)为现有技术,可按照文献[裂片石莼多糖的超声波辅助提取优化及其理化性质,食品与发酵工业,2013年第39卷第10期(总第310期),第239-244页]报道的方法进行操作。具体而言,所述的超声波辅助水提醇沉工艺具体按照如下操作:
(1-1)将洗净的裂片石莼在55℃~65℃条件下烘干3~5小时,粉粹得颗粒长度为3~6mm的粉末,并置于乙醇中浸泡10-24小时,过滤、风干得到粉碎物;
(1-2)取步骤(1-1)得到的粉碎物,以1:20~1:80加入pH 7.0的蒸馏水,以超声功率240~720W、占空比20%~80%进行超声波辅助提取5~40min,冷却静置1~2h,离心得上清液和沉淀;
(1-3)将步骤(1-2)得到的上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的1/10~1/15,加入75%~95%的乙醇溶液使样品最终浓度为80~90%,放置过夜,离心,所得沉淀冷冻干燥,得到裂片石莼粗多糖。
进一步,所述的步骤(1)具体按照如下操作:
(1-1)将洗净的裂片石莼在55℃~65℃条件下烘干3~5小时,粉粹得颗粒长度为3~6mm的粉末,并置于乙醇中浸泡10~24小时,过滤、风干得到粉碎物;
(1-2)取步骤(1-1)得到的粉碎物,以料液比1:60加入pH 7.0的蒸馏水,以超声功率480W、占空比1:1进行超声波辅助提取30min,冷却静置1h,离心得上清液和沉淀;
(1-3)将步骤(1-2)得到的上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的1/10,加入95%的乙醇溶液使样品最终浓度为80%,放置过夜,离心,所得沉淀冷冻干燥,得到裂片石莼粗多糖。
本发明通过对制得的裂片石莼多糖进行流变学研究,发现在1.0~4000.0s-1的剪切速率范围内,表现出明显的剪切变稠现象,即增加剪切速率表观粘度随之增加,属于天然的剪切增稠流体,故可用作增稠剂。
本发明通过对裂片石莼多糖保湿保润性能实验发现,其具有良好的吸湿保湿效果,可作为吸湿保湿剂。
与已有的技术相比较,本发明的创新点如下:
1、建立了一套从原料到产品高效提取亲水胶体多糖的物理分离工艺,有利于最大限度保存活性,并不涉及有机溶剂脱蛋白、单元脱色等高耗能、耗材料的过程,该工艺具有环保、快速、高效、低成本的特点,并且适用于大规模生产。
2、采用径向流色谱法分离纯化裂片石莼多糖,在常温下筛选出分子量相对集中分布、均一性好的亲水胶体多糖,该技术具有分离效率高、得率大、活性组分含量高的优势。
3、制得的裂片石莼多糖在1.0-4000.0s-1的剪切速率下,粘度随剪切速率增大而增大,是一种天然的剪切增稠亲水胶体,和传统的海藻酸钠、阿拉伯胶等剪切变稀亲水胶体相比,展现出不同的流变学现象。
4、提取的裂片石莼多糖组分是一种天然产物,相对合成药具有毒副作用小、活性强的优点,具有资源丰富、容易采集、成本低的优势,而且高分子多糖无毒副作用,与皮肤的亲和性好,具有较好的抗氧化、吸湿保湿等功能。并且,制得的裂片石莼多糖蛋白质和色素含量均较低,达到较高的纯度,且分子量分布集中,有助于提升吸湿保湿性能。
(四)附图说明
图1是裂片石莼多糖浓度对表观粘度的影响;
图2是温度对裂片石莼多糖表观粘度的影响;
图3是溶液pH对裂片石莼多糖表观粘度的影响;
图4是钙离子浓度对裂片石莼多糖表观粘度的影响;
图5是钠离子浓度对裂片石莼多糖表观粘度的影响;
图6空气湿度在43%时,裂片石莼多糖及两个对照品吸湿效果对比图;
图7空气湿度在43%时,裂片石莼多糖及两个对照品保湿效果对比图。
(五)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明,但本发明的保护范围不限于此:
实施例1
(1)将洗净的裂片石莼在55℃-65℃条件下烘干3-5小时,粉粹得颗粒长度为3-6mm的粉末,并置于乙醇中浸泡10-24小时,过滤、风干。
(2)称取步骤(1)中粉碎物30g,以料液比1:60加入1800ml、pH 7.0的蒸馏水,以超声功率480W、占空比50%进行超声波辅助提取30min。冷却静置1h,以转速10000r/min、温度4℃离心10min,得上清液和沉淀。
(3)将步骤(2)得到的上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的1/10左右,加入95%的乙醇溶液使样品最终浓度为80%,放置过夜,1000r/min,4℃离心10min,所得沉淀冷冻干燥,得该乙醇浓度下裂片石莼粗多糖。
(4)称取步骤(3)得到的粗多糖加水配制成10mg/ml的溶液,10000r/min、4℃离心15min后,取上清液过0.45μm微孔滤膜,得滤过液。
(5)将步骤(4)得到的滤过液加入径向流色谱柱(SUPERFL0-250COLUMN,离子交换剂为A103S)中,手动上样50ml,上样流速为5ml/min,用蒸馏水以40ml/min的流速对样品进行洗脱,洗脱完毕后,采用自动部分收集器收集洗脱液,直至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应,证明多糖已全部洗脱完毕。
(6)将步骤(5)收集的洗脱液浓缩至浓度10mg/ml,再次加入径向流色谱柱(SUPERFL0-250COLUMN,葡聚糖凝胶为Sephadex-G100)中,上样量50ml,上样流速5ml/min,洗脱流速30ml/min,收集30-80管洗脱液,减压浓缩冷冻干燥得裂片石莼多糖。
(7)将步骤(6)得到的粗多糖配制成0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%溶液,利用流变仪研究其粘度,发现在1.0-4000.0s-1的剪切速率范围内,具有剪切增稠的特性,并在多糖浓度为0.5%时,进一步考察温度、pH、钠离子、钙离子对其粘度的影响。结果表明,在10-50℃范围内粘度受温度影响不大,pH 5-10的范围内粘度受温度变化影响很小,并且对氯化钠的存在不敏感,这些性质有利于作为增稠剂的使用。
(8)在20℃环境温度下,配制饱和碳酸钾溶液,将饱和溶液置于干燥器底部,使密封容器内相对湿度达到43%。精密称取步骤(6)得到的裂片石莼多糖、甘油及透明质酸各1g于称量瓶中,放入湿度和温度相对恒定的干燥器中,密封干燥器。每隔12h取出称重,计算吸湿率;
吸湿率(%)=100·(Mn-Mo)/Mo
其中,Mn表示吸湿后样品的重量,Mo表示吸湿前样品的重量。
(9)在20℃环境温度下,分别称取步骤(6)得到的裂片石莼多糖、甘油及透明质酸各1g于称量瓶中,放入装有500mL水的密封器中保存24小时,使其在潮湿环境下吸水。24小时后,将样品称重,然后放入相对湿度为43%的密封器内脱水。
每隔12h取出称重,计算吸湿率;
保湿率(%)=(Hn-M)/(Ho-M)·100
其中,Hn表示脱水后的样品重量,M表示样品干重,Ho表示脱水前的样品重量。
表1为医药级裂片石莼多糖和透明质酸价格和添加量的对比,说明在考虑了裂片石莼多糖提取率和径向流脱色脱蛋白的得率后,价格上还具有优势,且添加量一般少于透明质酸。在相对湿度43%条件下,72h后测定其吸湿率和保湿率,分别达到了8.9%和85.2%,对比于同等条件下对透明质酸的测定结果,说明裂片石莼多糖具有价格低、添加量少且保湿保润效果好的优点。
表1裂片石莼多糖和透明质酸对比
实施例2
(1)取适量裂片石莼用清水进行漂洗,自然阴干,置于烘箱,用粉碎机粉碎,过100目筛,并置于乙醇中浸泡24小时,过滤、风干。
(2)取步骤(1)得到的粉碎物50g,以1:20加入pH 7.0的蒸馏水,以超声功率240W、占空比20%进行超声波辅助提取5min,冷却静置1h,离心得上清液和沉淀;
(3)将步骤(2)得到的上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的1/10,加入95%的乙醇溶液使样品最终浓度为80%,放置过夜,离心,所得沉淀冷冻干燥,得到裂片石莼粗多糖。
(4)将步骤(3)得到的多糖加水配制成10mg/ml的水溶液,于5000r/min、4℃条件下离心后取上清液过0.45μm微孔滤膜,得滤过液;
(5)将步骤(4)得到的滤过液加入径向流色谱柱(SUPERFL0-250COLUMN,离子交换剂为A103S)中,上样流速为5ml/min,洗脱流速为40ml/min,洗脱完毕后,采用自动部分收集器收集洗脱液,直至流出液不再发生苯酚-硫酸法显色反应,证明多糖已全部洗脱完毕。
(6)将步骤(5)得到的滤过液浓缩至浓度5mg/ml,再次加入径向流色谱柱(SUPERFL0-250COLUMN,葡聚糖凝胶为Sephadex-G100)中,上样量50ml,上样流速40ml/min,洗脱流速50ml/min,收集25-70管洗脱液,减压浓缩冷冻干燥得裂片石莼多糖。
(7)将步骤(6)得到的多糖配制成0.1%~2%溶液,在1.0-4000.0s-1的剪切速率范围内,具有剪切增稠的特性,在10-50℃范围内粘度受温度影响不大,pH 5-10的范围内粘度受温度变化影响很小,并且对氯化钠的存在不敏感,这些性质有利于作为增稠剂的使用。
(8)在密闭容器中放置饱和的硝酸镁溶液,温度为20℃时容器湿度为85%,选用精密称取步骤(6)得到的裂片石莼多糖、甘油及透明质酸各1g于称量瓶中,放入湿度和温度相对恒定的干燥器中,密封干燥器。12h后取出称重,计算吸湿率;
吸湿率(%)=100·(Mn-Mo)/Mo
其中,Mn表示吸湿后样品的重量,Mo表示吸湿前样品的重量。
表2相对湿度85%下裂片石莼多糖的吸湿率
(10)在密闭容器中放置饱和的硝酸镁溶液,在温度为20℃时容器湿度为85%,选用精密称取步骤(6)得到的裂片石莼多糖、甘油及透明质酸各1g于称量瓶中,放入装有500ml水的密封器中保存24小时,使其在潮湿环境下吸水。24h后取出称重,然后放入相对湿度为43%的密封器内脱水,12h后取出称重,计算吸湿率;
保湿率(%)=(Hn-M)/(Ho-M)·100
其中,Hn表示脱水后的样品重量,M表示样品干重,Ho表示脱水前的样品重量。
表3相对湿度85%下裂片石莼多糖的保湿率
Claims (7)
1.一种裂片石莼多糖,其制备方法为:以洗净的裂片石莼为原料,利用超声波辅助水提醇沉工艺获得裂片石莼粗多糖;所述裂片石莼粗多糖以离子交换剂A103S作为填料,采用径向流色谱柱脱色脱蛋白;脱色脱蛋白后的裂片石莼粗多糖以葡聚糖凝胶Sephadex-G100为填料,利用径向流色谱柱分离纯化,获得分子量均一的裂片石纯多糖。
2.如权利要求1所述的裂片石莼多糖,其特征在于:所述的裂片石莼多糖的制备方法具体按照如下步骤进行:
(1)以洗净的裂片石莼为原料,利用超声波辅助水提醇沉工艺获得裂片石莼粗多糖;
(2)将裂片石莼粗多糖加水配制成10~30mg/ml的水溶液,于5000~10000r/min、4~10℃条件下离心后取上清液过0.45~0.8μm微孔滤膜,得滤过液;
(3)将步骤(2)得到的滤过液加入径向流色谱柱,其中填料是离子交换剂A103S,上样流速为2~8ml/min,用蒸馏水以20~60ml/min的流速对样品进行洗脱,洗脱完毕后,收集洗脱液;
(4)将步骤(3)收集的洗脱液浓缩至5~15mg/ml,再次加入径向流色谱柱,其中填料是葡聚糖凝胶Sephadex-G100,上样流速2~8ml/min,用蒸馏水以20~50ml/min的流速对样品进行洗脱,收集洗脱液,减压浓缩、冷冻干燥得裂片石莼多糖。
3.如权利要求2所述的裂片石莼多糖,其特征在于:所述步骤(2)中,将裂片石莼粗多糖加水配制成10mg/ml的水溶液。
4.如权利要求2所述的裂片石莼多糖,其特征在于:所述步骤(3)中,上样流速为5ml/min,洗脱流速为40ml/min。
5.如权利要求2所述的裂片石莼多糖,其特征在于:所述步骤(4)中,将步骤(3)收集的洗脱液浓缩至10mg/ml;上样流速5ml/min,洗脱流速40ml/min。
6.如权利要求1所述的裂片石莼多糖作为吸湿保湿剂的应用。
7.如权利要求1所述的裂片石莼多糖作为增稠剂的应用。
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