CN114796261A - 石莼多糖在制备抗帕金森症药物、保健品或食品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药或食品技术领域，首次公开了石莼多糖在制备抗帕金森病(PD)药物或保健品方面的应用。具体涉及石莼多糖用于预防α‑突触核蛋白(α‑Synuclein，α‑Syn)的异常聚集。研究发现石莼多糖可以在体外有效抑制α‑Syn的聚集，显著拮抗α‑Syn诱导的细胞毒性，并且在体内也能够降低帕金森病模型线虫NL5901体内α‑Syn的聚集。表明该药物具有治疗帕金森症的潜力，可用于制备抗帕金森症药物、食物或保健品。

Description

石莼多糖在制备抗帕金森症药物、保健品或食品中的应用

一、技术领域

本发明属于生物医药和食品技术领域，首次公开了石莼多糖在制备抗帕金森病药物、食 品或保健品方面的应用。具体涉及石莼多糖作为α-Syn聚集抑制剂在制备药物、保健品或食 品中的应用。

二、背景技术

帕金森综合症(Parkinson’s disease，PD)是一种常见于中老年的神经系统变性疾病，临 床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征。易发生于60岁以上的老 年人，给患病的老年人带来极大的不适，给家庭和照顾者带来巨大的压力。目前尚无有效的 预防措施阻止疾病的发生和进展。

PD的病理特征是黑质中的多巴胺能神经元丢失和细胞内存在称为路易体(LB)的包涵 体，主要由聚集的α-Syn组成。因此α-Syn成为预防PD和相关疾病的治疗靶点。抑制α-Syn 聚集成为针对这种突触核蛋白病的重要策略。α-Syn主要存在于神经元突触前端，与突触囊 泡运输有关，并在神经递质释放和可塑性的调节中起重要作用。在PD患者脑内α-Syn异常 聚集形成寡聚体和不溶性的纤维，会导致PD的神经元损伤和死亡。

目前发现的α-Syn聚集抑制剂主要包括小分子抑制剂、多肽抑制剂，多酚化合物抑制剂， 纳米粒子抑制剂和金属螯合剂等。近年来，随着PD研究的发展，天然生物活性物质由于具 有来源丰富，副作用小，成本低廉等特点，逐渐得到研究人员关注。从海洋藻类中筛选有效 的α-Syn聚集抑制剂，成为开发PD新药的有效途径。

石莼多糖是一种复杂的水溶性硫酸多糖，主要来源于石莼属植物的细胞壁。在结构上它 主要由3-磺化鼠李糖、糖醛酸(葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸)和木糖组成。石莼多糖具有多种 生物活性，如：抗病毒、抗炎症、抗氧化和抗肿瘤等。因此，石莼多糖在食品、保健品和生 物医药等领域具有广阔的应用前景。

石莼寡糖是由石莼多糖降解产生的低聚糖，寡糖是生命活动中重要的生物活性物质，石 莼寡糖具有更强的抗氧化活性、免疫调节活性和降血脂作用。海洋低聚糖是食品、化妆品和 医药领域的潜在资源。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)是神经科学领域的重要实验生物。用它进行PD 和蛋白质聚集研究的主要原因为：体积小、易培养、传代周期短、发育迅速等，此外线虫的 透明解剖结构有助于监测神经蛋白α-Syn的聚集。并且线虫体内60～80％的基因与人类同源。 因此我们利用过表达人α-Syn的PD病理模型线虫(NL5901(Punc-54：：α-syn：：YFP+unc-119)) 在体壁肌肉中表达黄绿色荧光蛋白，探讨了石莼多糖和石莼寡糖对α-Syn聚集的作用。

基于上述研究现状，本发明公开了一种石莼多糖的新应用，所述石莼多糖可在体外显著 抑制α-Syn的聚集，并缓解其聚集引发的细胞毒性，且对秀丽隐杆线虫帕金森病病理模型具 有显著的治疗作用。提示石莼多糖可作为α-Syn聚集抑制剂，用于制备预防和治疗帕金森病 的药物、保健品和食品等。

三、发明内容

本发明提供了石莼多糖在制备治疗PD药物、保健品或食品中的新应用。

具体地，石莼多糖是用于预防和/或治疗以α-Syn的聚集沉淀为特征的PD。

所述石莼多糖作为药效成分的药物制剂为注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、 片剂等任一剂型。。

本发明具有以下有益效果：

1、首次公开了石莼多糖在体外能显著抑制α-Syn的聚集，开拓了石莼多糖在医药领域的 应用价值。

2、以PC12作为细胞模型的细胞毒性实验证明：石莼多糖可显著减轻α-Syn聚集诱导的 细胞毒性，提示石莼多糖具有治疗帕金森病的潜力。

3、以秀丽隐杆线虫PD病理模型进行实验，结果表明：石莼多糖可在体内显著抑制α-Syn 的聚集，对秀丽隐杆线虫PD模型具有显著的治疗作用，提示石莼多糖具有治疗帕金森病的 潜力。

下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于 一下所述。

四、附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及 其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1ThT荧光测定不同浓度石莼多糖对α-Syn聚集的抑制作用(A)和石莼多糖与对α-Syn 诱导的细胞毒性的缓解作用(B)。

图2经或不经石莼多糖处理的NL5901线虫头部α-Syn聚集荧光图像(A)和荧光定量图(B)。

图3ThT荧光测定不同浓度石莼寡糖对α-Syn聚集的抑制作用(A)和石莼寡糖与对α-Syn 诱导的细胞毒性的缓解作用(B)。

图4经或不经石莼寡糖处理的NL5901线虫头部α-Syn聚集荧光图像(A)和荧光定量图(B)。

五、具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

以下通过具体实施方式对本发明做进一步的阐述，本领域技术人员应理解，下面描述的 实施例是为了更好地理解本发明，本发明的范围并不受限于此。

以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。

以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。

以下实施例中，石莼多糖和石莼寡糖购自法国Elicityl生物技术公司。

具体如下：

实施例1：不同浓度石莼多糖与α-Syn共培养的ThT荧光强度随时间的变化

实施步骤：重组α-Syn蛋白大肠杆菌菌株由课题组前期构建，37℃恒温震荡培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，添加IPTG后置于37℃诱导5min，发酵液以15000rpm离心10min收集菌体。 利用超声破碎仪破碎菌体细胞后离心，收集上清，使用镍柱纯化杂蛋白液，获得纯度95％以 上的α-Syn蛋白。纯化后的蛋白过夜冻干，冻干的α-Syn用TBS缓冲溶(20mM Tris-HCl， pH 7.0，150mM NaCl)液溶解，超声10min，14000rpm离心20min取上清，以去除已经 形成的聚集体，采用Nanodrop 2000测定蛋白浓度。将上述α-Syn蛋白用TBS稀释，得浓度 为50μM的α-Syn母液。

用TBS缓冲液配制ThT溶液浓度为1mM的母液。

称取20mg石莼多糖溶于1mL过膜水中，得浓度为20mg/ml的石莼多糖母液。

将上述所得α-Syn母液与石莼多糖母液按梯度稀释并加入ThT溶液，获得石莼多糖终浓 度分别为0.5，1.0和2.0mg/ml的检测液(α-Syn终浓度为50μM，ThT终浓度为250μM)，加入96孔黑板中，每孔液体体积为200μL。每组设置三个平行。

使用多功能酶标仪，测定样品在440nm处激发波长和480nm处发射波长下的荧光强度， 扫描结果均为3次平均值。以α-Syn最高荧光强度作为100％将数据进行归一化处理。

实验结果：如图1(A)所示，单独培的α-Syn ThT荧光图呈现典型的淀粉样蛋白聚集的 “S”形曲线，图1为加入石莼多糖后α-Syn的ThT荧光强度随时间变化的趋势图，由图可知在石莼多糖作用下α-Syn的ThT荧光强度明显下降，且ThT荧光下降程度与加入的石莼多糖浓度相关，加入石莼多糖浓度越大，荧光抑制效果越强，说明石莼多糖呈剂量依赖性抑制了α-Syn的聚集。

实施例2：MTT比色法检测细胞毒性

实施步骤：细胞毒性实验中使用的细胞为鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株(PC12)。

PC12细胞培养基组分为胎牛血清、青霉素-链霉素和1640培养基他们的比例为10∶1∶100， 细胞在5％CO₂，37℃条件下培养。取生长状况良好的PC12细胞以5×10³cell/孔的细胞浓度 接种到96孔板，每孔90μL继续培养24h。

其次，配制石莼多糖终浓度分别为0.5，1.0和2.0mg/mL的α-Syn溶液(其中α-Syn的浓度均为50μM)，样品处理方法与实施例1相同，37℃培养至平台期。

将上述老化好的样品加入到已经培养24h的细胞中，10μL/孔。空白组加入10μLPBS 缓冲液，对照组为单独培养的α-Syn。细胞在培养箱中以5％CO₂，37℃继续培养48h后，加 入10μL/孔的MTT溶液。5％CO₂，37℃条件继续培养4h。

移除96孔板中溶液，加入DMSO(100μL/孔)的37℃震荡10min，检测570nm处吸光值。将空白组细胞活性记为100％，对其他数据进行归一化处理。

实验结果：如图1(B)，当只有α-Syn单独存在时，细胞存活率为48.01％。而加入不同 浓度的石莼多糖(0.5，1.0和2.0mg/mL)后细胞存活率提高到57.61％、64.30％、71.54％。加 入的石莼多糖浓度越大，毒性缓解作用越强，说明石莼多糖能够有效抑制α-Syn产生的细胞 毒性。

实施例3：2mg/mL石莼多糖对PD模型线虫NL5901体内α-Syn聚集的影响

实施步骤：NL5901线虫培养于20℃恒温培养箱中，在涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上培养。约4天转板一次。

生长状况良好的产卵期线虫用M9(其组分为22mM KH₂PO₄，42mM Na₂HPO₄和85mMNaCl，121℃灭菌，冷却后添加MgSO₄使其终浓为1mM)溶液从NGM固体培养基上洗脱下 来，800rpm离心3min，去除菌体。加入5mL裂解液(双蒸水，10％NaClO和5M NaOH 溶液按体积8∶1∶1混合)反复震荡3min。离心去除裂解液，用M9缓冲液反复清洗虫卵三次， 获得洁净虫卵。

将上述所得虫卵转移到固体NGM板上，置于20℃培养箱中过夜孵育，获得L1期幼虫。

用M9缓冲液将L1期线虫从培养基上冲下，转移到15mL离心管中，离心弃上清。将线虫转移到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上，继续置于20℃培养箱中，培养至L4期。

将同期化线虫转移到NGM培养基上，空白对照组为涂布有OP50并加有与石莼多糖等体 积双蒸水的NGM培养基，实验组药物终浓度为2mg/mL，每组设置三个平行，20℃继续培养5d。用M9将线虫冲洗下来，12000rpm，1min离心去上清，加入4％NaN3麻醉线虫， 在荧光显微镜下观察，拍照。每组随机观察30条线虫，所有图片采用Image J软件定量分析 荧光强度。结果如图3所示。

实验结果：图2(A)结果显示，5d后2mg/ml石莼多糖饲喂的线虫体内黄 绿色荧光强度比对照组弱。(B)纵坐标表示YFP相对荧光强度，由于α-Syn融 合，因此荧光强度代表α-Syn聚集量，此值越低，表明石莼多糖抗α-Syn聚集能 力越强。将空白对照组NL5901线虫体内YFP荧光强度记为100％，实验组荧光 强度下降到68.10％。

实施例4：石莼多糖用于保健品的制备

实施步骤：保健品组成：石莼多糖∶维生素C∶硫酸亚铁∶氧化锌∶水＝1∶10∶5∶1∶1000。

饮用时加水1L冲服。

使用该保健品与α-Syn的制得的混合溶液进行荧光强度测试，与对照组(未添加石莼多 糖的保健品与α-Syn形成的溶液)进行比较。

实验结果：加入石莼多糖后α-Syn的荧光强度明显下降，说明石莼多糖和石莼寡糖有效 抑制了α-Syn的聚集。

实施例5：石莼多糖用于饮料的制备

实施步骤：饮料组分为：石莼多糖∶柠檬酸∶低聚糖∶水＝1∶50∶1000。

通过溶解活性组分，混合，在85℃下搅拌1h，过滤，然后将所有组分填装进瓶中进行 灭菌制得健康饮料。

使用该饮品与α-Syn的混合溶液进行荧光强度测试，与对照组(未添加石莼多糖的饮品 与α-Syn形成的溶液)进行比较。

实验结果：加入石莼多糖后α-Syn溶液的荧光强度明显下降，说明石莼多糖有效抑制了 α-Syn的聚集。

实施例6：石莼寡糖对α-Syn聚集的抑制作用

实施步骤：具体实施方法如实施例1、2、3所述，石莼寡糖浓度的终浓度分别为0.25，0.5， 1和2mg/mL。

实验结果：如图3(A)所示，随着石莼寡糖浓度的增加，ThT荧光强度逐渐下降，这表明石莼寡糖呈剂量依赖性的抑制了α-Syn的聚集。并且石莼寡糖能够显著缓解α-Syn聚集诱导的细胞毒性，如图3(B)所示，当只有α-Syn单独存在时，细胞存活率为62.94％。而加 入不同浓度的石莼寡糖(0.25，0.5，1.0和2.0mg/mL)后细胞存活率提高，69.76％、73.62％、77.85％、91.86％。2mg/mL石莼寡糖能够有效抑制线虫NL5901体内α-Syn的聚集，如图4 (A)所示，2mg/mL石莼寡糖处理5d后的线虫体内黄绿色荧光强度明显弱于对照组。(B) 与未处理组相比，石莼寡糖处理后NL5901体内荧光强度下降到41.82％。

实施例7：石莼寡糖用于保健品和食品的制备

实施步骤：具体实施方法如实施例4、5所述，石莼寡糖添加量与石莼多糖一致。

实验结果：加入石莼寡糖后α-Syn溶液的荧光强度明显下降，说明石莼寡糖有效抑制了 α-Syn的聚集。

以上实施例证明，石莼多糖及其降解产物在体内外均可显著抑制α-Syn的聚集，提示本 发明所述石莼多糖具有治疗PD的潜力，可用于制备治疗PD的药物、食品和保健品。

Claims (5)

1.石莼多糖在制备治疗帕金森病的药物、保健品或食品中的应用。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：石莼多糖可显著抑制α-Syn的聚集。

3.根据权利要求2所述的石莼多糖在制备治疗帕金森病的药物、保健品或食品中的应用，其特征在于，石莼多糖作为有效成分的药物制剂为散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂等。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：石莼多糖可降解产生低聚糖为石莼寡糖。

5.根据权利要求4所述的石莼寡糖可显著抑制α-Syn的聚集，用于制备治疗帕金森病的药物、保健品或食品。

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